本技術(shù)涉及凍存保護(hù)液，具體涉及一種凍存成熟樹突狀細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、樹突狀細(xì)胞（dendritic?cell，dc）是一類重要的免疫細(xì)胞，具有獨(dú)特的形態(tài)和功能特征，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。樹突狀細(xì)胞由ralph?m.?steinman于1973年發(fā)現(xiàn)，因其表面具有星狀多形性或樹枝狀突起而得名。dc是功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞（antigen?presenting?cells，apcs），能夠高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，激活初始t細(xì)胞。目前國內(nèi)外學(xué)者期望借助dc較強(qiáng)的抗原負(fù)載和信息呈遞能力，激起體內(nèi)免疫應(yīng)答，比如通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為未成熟dc，用類腫瘤復(fù)合抗原負(fù)載并誘導(dǎo)其成為成熟dc，并作為一種腫瘤治療性疫苗。通過皮下注射后能在人體內(nèi)激活細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效識(shí)別及殺傷。

2、過程中誘導(dǎo)成熟的dc需要在特定期限內(nèi)進(jìn)行凍存，以保證dc有足夠的時(shí)間做質(zhì)檢放行和有效呈遞抗原信息。

3、凍存對(duì)樹突狀細(xì)胞的影響是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，因?yàn)閐c在免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色，所以常在臨床應(yīng)用中使用。以下是一些關(guān)于凍存對(duì)dc影響的研究結(jié)果：①《cryopreservation?affected?the?levels?of?immune?responses?of?pbmcs?andantigen-presenting?cells》，m.?martikainen等，該文獻(xiàn)研究比較了新鮮和凍存的外周血單核細(xì)胞（pbmcs）的總體免疫反應(yīng)性，并特別研究了凍存對(duì)pbmcs中循環(huán)抗原呈遞細(xì)胞（apcs）的影響。研究發(fā)現(xiàn)，凍存的pbmcs產(chǎn)生的細(xì)胞因子少于新鮮細(xì)胞，但應(yīng)答情況相當(dāng)。凍存對(duì)apcs的相對(duì)比例存在影響，刺激誘導(dǎo)的反應(yīng)可復(fù)現(xiàn)，但比新鮮細(xì)胞中觀察到反應(yīng)弱。這表明凍存可能對(duì)dc的功能產(chǎn)生一定影響，但具體程度可能取決于凍存技術(shù)和條件。②《自體樹突狀細(xì)胞注射液制備和初步穩(wěn)定性試驗(yàn)》，劉俊云等，該文獻(xiàn)研究了凍存溫度對(duì)dc存活的影響，探討了不同凍存溫度對(duì)dc存活率的影響。研究指出，選擇合適的凍存方法對(duì)于保持凍存dc的存活率和活性至關(guān)重要。③《自制細(xì)胞凍存液對(duì)樹突狀細(xì)胞存活率及活性的影響》，趙滿倉等，該文獻(xiàn)研究觀察了使用自制改良細(xì)胞凍存液（含dmso、羥乙基淀粉及細(xì)胞穩(wěn)定劑）凍存dc后，復(fù)蘇的dc的細(xì)胞存活率及體外誘導(dǎo)cik對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示，使用自制凍存液凍存的dc的存活率和活性隨凍存時(shí)間延長有輕度下降，但與兩種常用的凍存液（1.含10v/v%二甲基亞砜(dmso)、20v/v%牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液；2.日本zenoaq公司的cellbanker細(xì)胞凍存液）相比沒有明顯差別。這表明自制的改良細(xì)胞凍存液能夠作為傳統(tǒng)凍存液和進(jìn)口凍存液的替代品，具有很好的應(yīng)用前景。

4、綜上所述，凍存技術(shù)對(duì)dc的免疫反應(yīng)性和存活率有一定影響，但通過改進(jìn)凍存方法可以減少這些影響，保持dc的功能和活性。因此，選擇合適的凍存液和凍存條件對(duì)于dc的臨床應(yīng)用非常關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種凍存成熟樹突狀細(xì)胞的方法，通過凍存液中所含有的cryostor?cs10、人血白蛋白注射液、復(fù)方右旋糖酐40注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液、抗凍蛋白液、setanaxib成分之間的協(xié)同增效，以及凍存過程中特定的程序性凍存溫度達(dá)到對(duì)dc的有效凍存，即復(fù)蘇后存活率≥80%，且較大程度保全dc的抗原呈遞能力。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種樹突狀細(xì)胞凍存液，所述凍存液由cryostor?cs10、人血白蛋白注射液、復(fù)方右旋糖酐40注射液、復(fù)方電解質(zhì)注射液、抗凍蛋白液、setanaxib制備而成；其中，cryostor?cs10的體積百分比為41-50%，人血白蛋白注射液的體積百分比為15-16%，復(fù)方右旋糖酐40注射液的體積百分比為17-20%，復(fù)方電解質(zhì)注射液的體積百分比為17-20%，抗凍蛋白液的體積百分比為1-3%，所述setanaxib的濃度為20μmol/l。

4、優(yōu)選的，所述cryostor?cs10的體積百分比為50%。

5、優(yōu)選的，所述人血白蛋白注射液的體積百分比為15%。

6、優(yōu)選的，所述復(fù)方右旋糖酐40注射液的體積百分比為17%。

7、優(yōu)選的，所述復(fù)方電解質(zhì)注射液的體積百分比為17%。

8、優(yōu)選的，所述抗凍蛋白液的體積百分比為1%。

9、第二方面，本發(fā)明提供一種樹突狀細(xì)胞的凍存方法，具體操作步驟如下：

10、步驟1：從第三方血液制品供給單位（即廈門三一造血技術(shù)有限公司）采購人外周血單個(gè)核細(xì)胞（pbmcs），cd14磁珠陽選法獲得目的細(xì)胞（即樹突狀細(xì)胞），將目的細(xì)胞置入培養(yǎng)基中培養(yǎng)120h，期間換液一次，換液時(shí)間在開始培養(yǎng)后72h，所換液體為原培養(yǎng)基，第6天加入目的抗原，4-6h后加入成熟誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)，在加入目的抗原的20-50h內(nèi)收集成熟的樹突狀細(xì)胞；

11、步驟2：對(duì)收集到的dc計(jì)數(shù)、而后進(jìn)行1-3次離心洗滌，并去除上清液；

12、步驟3：在dc中添加所述樹突狀細(xì)胞凍存液，得到細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液的濃度為2.0×106-2.5×107個(gè)細(xì)胞/ml，而后將細(xì)胞懸液分裝到凍存袋中，26ml/袋；

13、步驟4：程序性降溫，即將分裝好的細(xì)胞懸液放入程序降溫設(shè)備中，按照預(yù)設(shè)的降溫速率逐漸降低溫度，其中預(yù)設(shè)降溫速率為：

14、t1：待程序降溫儀腔內(nèi)溫度達(dá)到6±0.5℃，將分裝好的細(xì)胞放入，并挑選一份細(xì)胞樣品，連接溫度探頭；

15、t2：腔內(nèi)溫度維持在6±0.5℃，等待樣品溫度降至8±0.5℃；

16、t3：程序降溫儀降溫速率為1.0-1.5℃/min，樣品溫度由8±0.5℃降溫至-4±0.5℃；

17、t4：程序降溫儀降溫速率為20-21℃/min，樣品溫度降溫至-60±0.5℃；

18、t5：程序降溫儀升溫速率為7-8℃/min，樣品溫度升溫至-25±0.5℃；

19、t6：程序降溫儀降溫速率為1.0±0.5℃/min，樣品溫度降溫至-60±0.5℃；

20、t7：程序降溫儀降溫速率為10-11℃/min，樣品溫度降溫至-120±0.5℃；

21、t8：樣品溫度為-120±0.5℃保持10min；

22、t9：結(jié)束。

23、步驟5：程序降溫完成后，將細(xì)胞凍存袋轉(zhuǎn)移到氣相液氮中長期保存。

24、步驟1中所述未成熟誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基由在x-vivo培養(yǎng)基中加入10v/v%fbs、500iu/ml重組人il-4；500iu/mlgm-csf組成；所述成熟誘導(dǎo)劑為近岸蛋白公司生產(chǎn)的成熟誘導(dǎo)劑，貨號(hào)：gmp-1806；添加量為：1.0v/v%；所述目的抗原購自mabtech,貨號(hào)3616-1，添加量為：2μg/ml。

25、本發(fā)明中：

26、(1)cryostor?cs10是配方獨(dú)特，無血清、無動(dòng)物成分，含有10%二甲基亞砜（dmso）的凍存液，可在低溫（-80°c或-196°c）環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞，在冷凍、儲(chǔ)存和解凍過程中為細(xì)胞和組織提供了一個(gè)安全、保護(hù)的環(huán)境。

27、(2)抗凍蛋白液（afps，antifreeze?proteins）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱，最初是從南極與北極地區(qū)的海洋魚類血清中發(fā)現(xiàn)的一種能與冰晶相結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)，它能阻止體液內(nèi)冰核的形成與生長，維持體液的非冰凍狀態(tài)?？箖龅鞍祝╝fps）在細(xì)胞凍存中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.冰重結(jié)晶抑制（iri）活性：afps具有iri活性，能夠抑制冰晶的生長和重結(jié)晶，從而減少細(xì)胞在冷凍過程中受到的損傷；2.提高細(xì)胞凍存后的生存率：通過使用afps作為冷凍保護(hù)劑，可以提高細(xì)胞在凍存和解凍后的生存率和活力；3.減少有毒冷凍保護(hù)劑的使用，傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法常使用一些有毒的有機(jī)溶劑作為冷凍保護(hù)劑，而afps提供了一種更安全、更有效的替代方案。

28、(3)復(fù)方電解質(zhì)注射液的主要組分，每500ml中含：氯化鈉2.63g、葡萄糖酸鈉2.51g、醋酸鈉1.84g、氯化鉀0.185g、氯化鎂0.15g。本品與血液和血液成分相容，可使用同一給藥裝置在輸血前或輸血后輸注（即作為預(yù)充液），可加入正在輸注的血液組分中，或作為血細(xì)胞的稀釋液。

29、(4)復(fù)方右旋糖酐40注射液在細(xì)胞凍存中的作用主要與其作為血漿代用品的特性有關(guān)，具體到細(xì)胞凍存，復(fù)方右旋糖酐40注射液可能用于以下幾個(gè)方面：1.凍存介質(zhì)的組成部分，作為細(xì)胞凍存液的一部分，幫助保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷；2.防止細(xì)胞凝集，通過減少細(xì)胞間的黏附，降低細(xì)胞在冷凍過程中形成大的凝集團(tuán)塊的可能性；3.維持滲透壓平衡，在冷凍和解凍過程中，幫助維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，減少因滲透壓變化引起的細(xì)胞破裂。

30、(5)人血白蛋白（human?serum?albumin,?hsa）在細(xì)胞凍存中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.維持滲透壓平衡，人血白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，它能夠維持細(xì)胞外液的滲透壓，防止細(xì)胞在凍存過程中因滲透壓變化而發(fā)生過度脫水或腫脹；2.作為冷凍保護(hù)劑，人血白蛋白可以作為非滲透性的冷凍保護(hù)劑，它通過與水分子結(jié)合，降低細(xì)胞外自由水的含量，減少冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受冰晶的機(jī)械損傷；3.抗氧化作用，人血白蛋白具有抗氧化特性，能夠結(jié)合并中和自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，這對(duì)于凍存過程中可能產(chǎn)生的氧化損傷具有保護(hù)作用；4.?穩(wěn)定細(xì)胞膜，人血白蛋白能夠與細(xì)胞膜上的磷脂相互作用，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少凍存過程中細(xì)胞膜的損傷；5.運(yùn)輸和儲(chǔ)存功能，人血白蛋白能夠結(jié)合并運(yùn)輸多種分子，包括營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，這有助于在凍存過程中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；6.促進(jìn)細(xì)胞復(fù)蘇，在細(xì)胞復(fù)蘇過程中，人血白蛋白有助于維持細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)定，減少細(xì)胞在解凍過程中的損傷，提高細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率和功能恢復(fù)。

31、(6)setanaxib也稱為gkt137831，是一種雙重nadph氧化酶1和4（nox1/4）抑制劑，近年來在細(xì)胞凍存方面的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。在細(xì)胞凍存中的作用和機(jī)制：1.抗氧化保護(hù)，setanaxib通過抑制nox1和nox4，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧（ros）的產(chǎn)生，在細(xì)胞凍存過程中，ros的生成可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，而setanaxib的抗氧化特性可以幫助保護(hù)細(xì)胞在凍存和復(fù)蘇過程中的活性；2.改善細(xì)胞存活率，在細(xì)胞凍存過程中，冰晶的形成和細(xì)胞膜的損傷是主要的挑戰(zhàn)，setanaxib通過減少氧化應(yīng)激，改善細(xì)胞膜的完整性，從而提高細(xì)胞在凍存后的存活率；3.促進(jìn)細(xì)胞復(fù)蘇，setanaxib的使用有助于細(xì)胞在解凍后的快速恢復(fù)，通過減少細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，setanaxib可能提高細(xì)胞的功能和活力，促進(jìn)細(xì)胞的復(fù)蘇；4.潛在的聯(lián)合應(yīng)用，setanaxib可以與其他冷凍保護(hù)劑（如dmso）聯(lián)合使用，以增強(qiáng)細(xì)胞凍存的效果。通過綜合利用不同機(jī)制的保護(hù)作用，可能會(huì)提高細(xì)胞凍存的成功率。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

33、1、使用本發(fā)明所限定凍存液及凍存方法可以有效地提高成熟dc的凍存后的存活率。

34、2.使用本發(fā)明所限定凍存時(shí)間點(diǎn)，可有效地保全成熟dc凍存后的抗原呈遞能力。