本發(fā)明屬于外泌體，具體涉及一種細(xì)胞外囊泡保護(hù)劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體(exosomes)是細(xì)胞分泌的小型膜囊泡，直徑約30-150納米，近年來在生物醫(yī)學(xué)研究中引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)外泌體在各種正常的生理過程和疾病進(jìn)程中發(fā)揮著各種各樣功能，得益于其低免疫原性和靶向性，在疾病治療方面展現(xiàn)了良好的臨床應(yīng)用潛力。

2、然而，關(guān)于外泌體儲存條件的研究較少，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體儲存條件。目前常用的-80℃條件，不同的保存緩沖液中外泌體保存穩(wěn)定性差異很大，有研究顯示(a?etal.,identification?of?storage?conditions?stabilizing?extracellular?vesiclespreparations.j?extracell?vesicles.2022jun；11(6):e12238.doi:10.1002/jev2.12238.pmid:35716060；pmcid:pmc?9206228.)，

3、保護(hù)效果差的緩沖液中外泌體在1.5個月時濃度下降超過一半，保存效果并不理想。另外，-80℃保存條件比較苛刻，對于運(yùn)輸和長期保存來說是很大的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重制約外泌體在臨床中的應(yīng)用。因此，迫切需要開發(fā)一個穩(wěn)定的處方，使高濃度外泌體可以在冷藏(2-8℃)或常溫下保存、運(yùn)輸，并且可以耐多次凍融。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種不僅適合-80℃、2-8℃以溶液形式保存，而且適合凍干的細(xì)胞外囊泡保存制劑。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供一種細(xì)胞外囊泡保護(hù)劑。

4、進(jìn)一步，所述保護(hù)劑由緩沖體系和凍干穩(wěn)定劑組成，所述凍干穩(wěn)定劑包括表面活性劑和/或糖類物質(zhì)。

5、進(jìn)一步，所述緩沖體系包括tris-nacl緩沖劑、pbs緩沖劑、枸櫞酸緩沖劑、組氨酸緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、nacl溶劑。

6、進(jìn)一步，所述tris-nacl緩沖劑中tris和nacl濃度分別為20mm和137mm。

7、進(jìn)一步，所述緩沖體系提供6.0～8.0的溶液ph。

8、優(yōu)選地，所述緩沖體系為pbs緩沖劑。

9、優(yōu)選地，所述pbs緩沖劑提供7.3的溶液ph。

10、進(jìn)一步，所述表面活性劑包括吐溫、dmso、f68。

11、優(yōu)選地，所述表面活性劑為f68。

12、優(yōu)選地，所述f68在緩沖體系中的終濃度為0.005％。

13、進(jìn)一步，所述糖類物質(zhì)包括海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、乳糖、棉子糖、果糖、麥芽糖。

14、優(yōu)選地，所述糖類物質(zhì)為蔗糖。

15、優(yōu)選地，所述蔗糖在緩沖體系中的終濃度為1.5％。

16、進(jìn)一步，所述保護(hù)劑為pbs緩沖劑與f68和蔗糖的組合。

17、進(jìn)一步，所述保護(hù)劑為pbs緩沖劑與f68的組合。

18、優(yōu)選地，所述f68、蔗糖在pbs緩沖劑中的終濃度分別為0.005％和1.5％。

19、術(shù)語“細(xì)胞外囊泡”應(yīng)理解為涉及可從細(xì)胞以任何形式獲得的任何類型的囊泡，例如微囊泡(例如從細(xì)胞的質(zhì)膜脫落的任何囊泡)、外泌體(例如源自內(nèi)溶酶體途徑的任何囊泡)、凋亡小體(例如可從凋亡細(xì)胞獲得)、微粒(可源自例如血小板)、核外顆粒體(可源自例如血清中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)、前列腺小體(例如可從前列腺癌細(xì)胞獲得)或心臟小體(例如可從心臟細(xì)胞獲得)等。細(xì)胞外囊泡的大小可以相差很大，但是細(xì)胞外囊泡通常具有納米級的流體動力學(xué)直徑，即直徑小于1000nm。顯然，細(xì)胞外囊泡可以源自體內(nèi)、離體和體外的任何細(xì)胞類型。優(yōu)選的細(xì)胞外囊泡包括外泌體和微囊泡，但是其它細(xì)胞外囊泡在各種情況下也可以是有利的。此外，所述術(shù)語還應(yīng)理解為涉及細(xì)胞外囊泡模擬物、通過例如膜擠出、超聲處理或其它技術(shù)等獲得的基于細(xì)胞膜的囊泡。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，當(dāng)描述細(xì)胞外囊泡的醫(yī)學(xué)和科學(xué)用途和應(yīng)用時，本發(fā)明通常涉及多個細(xì)胞外囊泡，即，可以包含數(shù)千個、數(shù)百萬個、數(shù)十億個或甚至數(shù)萬億個細(xì)胞外囊泡的細(xì)胞外囊泡群體。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，細(xì)胞外囊泡為外泌體。

20、本發(fā)明細(xì)胞或后續(xù)提到的能夠分泌細(xì)胞外囊泡的細(xì)胞包括但不限于原代細(xì)胞、細(xì)胞系、存在于多細(xì)胞生物的細(xì)胞、或基本上任何其它類型的細(xì)胞來源。本發(fā)明的細(xì)胞包括體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以選自廣泛范圍的細(xì)胞和細(xì)胞系，例如間充質(zhì)干細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞(可從例如骨髓、脂肪組織、臍帶膠質(zhì)(wharton'sjelly)、圍產(chǎn)期組織、胎盤、牙芽、臍帶血、皮膚組織等獲得)、成纖維細(xì)胞、羊膜細(xì)胞且更具體地說是任選地表達(dá)各種早期標(biāo)記物的羊膜上皮細(xì)胞、骨髓抑制細(xì)胞、m2極化巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。特別關(guān)注的細(xì)胞系包括人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)、人胚腎(hek)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞系例如微血管內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、紅系祖細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、不同來源的msc、羊膜細(xì)胞、羊膜上皮(ae)細(xì)胞、通過羊膜穿刺術(shù)或從胎盤獲得的任何細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。此外，免疫細(xì)胞例如b細(xì)胞、t細(xì)胞、nk細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞(dc)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且基本上能夠產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡的任何類型的細(xì)胞也包括在本文中。通常，細(xì)胞外囊泡基本上可以源自任何細(xì)胞來源，無論是原始細(xì)胞來源還是永生化細(xì)胞系。細(xì)胞外囊泡源細(xì)胞可以是任何胚胎的、胎兒的和成年的體干細(xì)胞類型，包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)和通過任何方法衍生的其它干細(xì)胞。當(dāng)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時，可以考慮利用例如原代神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞作為源細(xì)胞。對于待治療的患者而言，細(xì)胞本質(zhì)上可以是同種異體的、自體的、甚至異種的，即細(xì)胞可以來自患者本人或者來自無關(guān)的、匹配的或不匹配的供體。

21、在一些實(shí)施例中，術(shù)語“外泌體”是一種由細(xì)胞分泌的，直徑為30～150nm的磷脂雙層囊泡小體，膜上和囊泡腔體內(nèi)攜帶母細(xì)胞的多種核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物，是細(xì)胞間通訊的介質(zhì)。外泌體可以由所有類型的細(xì)胞分泌，在血漿、尿液、精液、唾液、支氣管液、腦脊髓、母乳、血清、羊水、滑膜液、淚液、淋巴液、膽汁和胃酸中均有發(fā)現(xiàn)。外泌體的形成由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期的內(nèi)涵體開始。這些早期內(nèi)涵體可以與其他細(xì)胞器發(fā)生物質(zhì)交換或者與不同的內(nèi)涵體之間融合，進(jìn)一步形成細(xì)胞內(nèi)多囊泡體。多囊泡體之后與細(xì)胞膜融合，釋放到胞外形成外泌體。不同細(xì)胞分泌攜帶不同組分的外泌體。外泌體具有高度異質(zhì)性，表現(xiàn)為其大小，內(nèi)含物，功能，以及細(xì)胞來源的不同。微環(huán)境和母細(xì)胞固有的生物學(xué)特性可能會影響外泌體的含量及其生物標(biāo)志物。外泌體可能含有膜蛋白、細(xì)胞膜和核蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、代謝物和核酸，即mrna、非編碼rna和dna等。外泌體對受體細(xì)胞的影響可能因其細(xì)胞表面受體表達(dá)的不同而不同，這種功能異質(zhì)性可能導(dǎo)致一組外泌體誘導(dǎo)細(xì)胞存活，另一組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而另外的一組外泌體則誘導(dǎo)不同靶細(xì)胞類型的免疫調(diào)節(jié)等。同時，不同的器官和組織來源的外泌體，呈現(xiàn)不同的特性。以上各種特征組合，使得外泌體可能具有更高的復(fù)雜性和異質(zhì)性。外泌體釋放到細(xì)胞外后，在組織液中移動到鄰近的或者遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞。這些外泌體被受體細(xì)胞吸收后，通過物質(zhì)交換釋放內(nèi)含物實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和信號的交流。這種物質(zhì)和信息傳遞可以通過外泌體上的跨膜蛋白直接作用于受體細(xì)胞膜表面的信號分子，激活細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)；也可以通過與受體細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，將外泌體的內(nèi)含物送入受體細(xì)胞中；或者通過內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞中。外泌體作為細(xì)胞間的通訊途徑，其功能影響著廣泛的生理過程，如免疫反應(yīng)，組織修復(fù)、干細(xì)胞維持，心血管疾病，神經(jīng)變性，癌癥和驗(yàn)證等病理過程。

22、在一些實(shí)施例中，外泌體來源于造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中的至少一種。本發(fā)明不限制提供的外泌體保護(hù)劑適用的外泌體來源，任何細(xì)胞分泌的外泌體，或者來源于任何體液的外泌體均可使用上述保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)。

23、在一些實(shí)施例中，術(shù)語“緩沖體系”是指存在于組合物或溶液中的組分，其可提供針對由強(qiáng)酸或堿引起的ph的顯著變化的抗性。緩沖體系可包含單一試劑或多于一種試劑，例如弱酸及其共軛堿。緩沖體系可通過與組合物或溶液中的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的相互作用來提供針對顯著ph變化的抗性，從而至少部分地防止組合物或溶液的ph顯著變化。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，使用的緩沖體系為pbs緩沖劑，提供7.3的溶液ph，其為藥用輔料，滲透壓與生理鹽水相近，適合靜脈注射。

24、在一些實(shí)施例中，術(shù)語“糖”包括單糖和寡糖。單糖是一種不能被酸水解的單體碳水化合物，包括單糖及其衍生物，如氨基糖。糖類通常呈d構(gòu)象。單糖的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脫氧核糖、神經(jīng)氨酸。寡糖是由多于一個的單體糖單元組成的碳水化合物，其通過一個或多個糖苷鍵連接，可以是支鏈或直鏈。寡糖中的單體糖單元可以是相同的或不同的。根據(jù)單體糖單元的數(shù)量，寡糖是二糖、三糖、四糖、五糖等等。與多糖不同，單糖和寡糖是水溶性的。寡糖的例子包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。

25、在一些實(shí)施例中，術(shù)語“表面活性劑”是一類能夠使兩種液體間、液體與氣體間、液體與固體間的表面張力或界面張力顯著降低的化合物。表面活性劑在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用，他們具有乳化、分散、增溶、發(fā)泡、去污等多種作用，并且一些特定類型的表面活性劑還具有抗菌作用。表面活性劑類型多樣，包括但不限于吐溫、dmso或f68。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，選用表面活性劑f68作為外泌體保護(hù)劑，在外泌體的儲存過程中起到了很好的保護(hù)作用。

26、在一些實(shí)施例中，術(shù)語“保護(hù)劑”指的是藥學(xué)上可接受的賦形劑，它可以保護(hù)不穩(wěn)定的活性成分(如外泌體)在凍干過程、隨后的儲存和重建過程中不受去穩(wěn)定條件影響。保護(hù)劑包括但不限于糖類、多元醇(如糖醇)、氨基酸或表面活性劑。在特定的實(shí)施方式中，保護(hù)劑可選自糖類，如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神經(jīng)氨酸、氨基糖，例如葡糖胺、半乳糖胺、n-甲基葡糖胺(“葡甲胺(meglumine)”)，多元醇如甘露糖醇和山梨糖醇，以及氨基酸如精氨酸和甘氨酸或其混合物。

27、在一些實(shí)施例中，外泌體保存過程中影響外泌體變性的主要因素有：由于物理(非共價)相互作用或者化學(xué)凝集(共價)造成的蛋白質(zhì)凝聚；氧化反應(yīng)；水解作用等，雖然凍干的生物活性因子中含有極少量的水分，但在保存過程中仍然會發(fā)生水解作用；所以，為了防止外泌體在冷凍干燥和保存過程中變性或者失活，需要添加有效的保護(hù)劑，以穩(wěn)定外泌體的活性。凍干保護(hù)劑的種類繁多，機(jī)制復(fù)雜，如果保護(hù)劑添加不當(dāng)，不僅不能有效對外泌體進(jìn)行保護(hù)，甚至在外泌體凍干粉的后期使用中會產(chǎn)生毒性等較大負(fù)面影響。而且，保護(hù)劑添加的濃度也對保護(hù)劑的保護(hù)效果起著非常重要的作用，通常，在某個濃度范圍內(nèi)，保護(hù)劑的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大，當(dāng)達(dá)到某一濃度時，保護(hù)作用達(dá)到最大值，而此后再增大保護(hù)劑的濃度，則保護(hù)劑的保護(hù)效果不再顯著增加，過高的濃度甚至?xí)沟美鋬龈稍镞^程中外泌體發(fā)生變性；但是不同保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制不一樣，呈現(xiàn)最大保護(hù)作用的濃度也不同，實(shí)際使用時，需要考慮多種保護(hù)劑的綜合效果。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，提供了一種通用型的外泌體保護(hù)劑，其由表面活性劑f68和pbs緩沖劑組成，或由表面活性劑f68、蔗糖和pbs緩沖劑組成；其中，f68、蔗糖在pbs緩沖劑中的終濃度分別為0.005％和1.5％。

28、本發(fā)明第二方面提供一種細(xì)胞外囊泡制劑。

29、進(jìn)一步，所述制劑包括本發(fā)明第一方面所述的保護(hù)劑和細(xì)胞外囊泡。

30、進(jìn)一步，所述細(xì)胞外囊泡制劑類型包括溶液、凍干粉、懸浮液、凝膠或納米顆粒。

31、在一些實(shí)施例中，細(xì)胞外囊泡制劑包括外泌體制劑，外泌體制劑的類型除了常見的溶液和凍干粉外，還包括其它幾種形式，包括但不限于：活體化的外泌體(這種類型的外泌體是將外泌體懸浮在液體基質(zhì)中，以保持其在儲存、運(yùn)輸和使用過程中的活性)、微球裝載的外泌體(利用微球裝載外泌體，以實(shí)現(xiàn)外泌體在體內(nèi)的緩釋效果)、凝膠制備的外泌體、特定載體復(fù)合的外泌體(如與脂質(zhì)體、納米顆粒等復(fù)合)。需要注意的是，在基于細(xì)胞外囊泡保護(hù)劑公開的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何方法將本發(fā)明公開的保護(hù)劑和細(xì)胞外囊泡組裝成任何制劑類型；因此，利用本發(fā)明公開的保護(hù)劑制成的任何細(xì)胞外囊泡制劑類型均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

32、本發(fā)明第三方面提供如下任意一種應(yīng)用。

33、進(jìn)一步，所述應(yīng)用包括：

34、1)本發(fā)明第一方面所述的保護(hù)劑在制備細(xì)胞外囊泡制劑、含細(xì)胞外囊泡藥物中的應(yīng)用；

35、2)本發(fā)明第一方面所述的保護(hù)劑在細(xì)胞外囊泡儲存中的應(yīng)用；

36、3)本發(fā)明第一方面所述的細(xì)胞外囊泡制劑在制備藥物或藥物載體、化妝品中的應(yīng)用。

37、本發(fā)明第四方面提供一種細(xì)胞外囊泡凍干制劑的制備方法。

38、進(jìn)一步，所述方法包括：凍干包含細(xì)胞外囊泡和本發(fā)明第一方面所述的保護(hù)劑的混合體系。

39、進(jìn)一步，本發(fā)明第一、第二、第三和第四方面所述的細(xì)胞外囊泡為外泌體。

40、優(yōu)選地，外泌體的細(xì)胞來源為間充質(zhì)干細(xì)胞。

41、在一些實(shí)施例中，術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”是指干細(xì)胞家族中的一項重要成員，其來源于發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞、骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉間充質(zhì)干細(xì)胞、肺間充質(zhì)干細(xì)胞、肝間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞、羊水間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等。其中，術(shù)語“臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞”是指來源于臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞。術(shù)語“脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞”是指來源于脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞。

42、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

43、(1)本技術(shù)發(fā)明的保護(hù)劑用料更簡化；

44、(2)本技術(shù)發(fā)明的保護(hù)劑是一種通用型保護(hù)劑，兼容-80℃、2-8℃以溶液形式保存，同時適合凍干；

45、(3)新保護(hù)劑選擇的pbs、f68、蔗糖均為藥用輔料，滲透壓與生理鹽水相近，適合靜脈注射；

46、(4)新保護(hù)劑能有效保護(hù)高濃度外泌體，對于5×1010顆粒/ml的高濃度外泌體保護(hù)效果良好。