本發(fā)明涉及生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種北美紅楓十月光輝品種組培快繁方法。

背景技術(shù)：

北美紅楓十月光輝是紅葉槭的一種，屬于大型落葉喬木。春季紅葉紅花，夏季葉片為綠色，秋季因溫度變化葉色呈現(xiàn)紅色，冬季落葉。原產(chǎn)于美國東部，十月光輝紅楓是中國引進(jìn)的北美紅楓中表現(xiàn)最穩(wěn)定、變色最紅艷的品種之一。

據(jù)報道播種、扦插可獲得幼苗，但播種成苗在經(jīng)過性狀雜交后發(fā)生變異，其品種優(yōu)良特性不易保留，而扦插苗出圃量低，也難達(dá)到市場需求。因而通過組培快繁獲得大量具母本優(yōu)良特性苗木成為解決該問題有效方案。目前北美紅楓快繁體系尚在完善之中，僅有少數(shù)品種有所突破，其它品種研究多見于愈傷誘導(dǎo)階段，尤其是關(guān)于“十月光輝”不定器官形成的報道未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種北美紅楓十月光輝組培快繁方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種北美紅楓十月光輝品種組培快繁方法，包括以下步驟：

（1）外植體消毒：以北美紅楓十月光輝葉片或莖段為外植體，先對其進(jìn)行消毒處理；

（2）愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（1）準(zhǔn)備好的外植體接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將接種后的材料置于濕度75%，溫度（25±2）℃，光照14h、光照強(qiáng)度1500lx、黑暗10h條件的人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

（3）愈傷增殖培養(yǎng)：將步驟（2）得到的愈傷組織每隔30d分割繼代于愈傷增殖培養(yǎng)基，在步驟（2）的相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)；

（4）胚性細(xì)胞誘導(dǎo)：在上述愈傷基礎(chǔ)上選擇淺黃色、白色疏松愈傷組織接種于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)15d，后將培養(yǎng)愈傷轉(zhuǎn)移到不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)直到體胚細(xì)胞形成；

（5）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（4）得到的胚性愈傷組織置于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度85%，溫度（25±2）℃，光照18h、光照強(qiáng)度3000lx、2h黑暗；

（6）不定根誘導(dǎo)：將步驟（5）得到的胚性愈傷組織繼代于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度85%，溫度（25±2）℃，光照6h、光照強(qiáng)度1500lx、18h黑暗；

（7）煉苗移栽：將已長出完整器官的幼苗培養(yǎng)基瓶蓋打開，在光照強(qiáng)度3000lx的光照下煉苗5～7d，之后將組培苗從培養(yǎng)基中取出，洗掉根部培養(yǎng)基后栽至配置的營養(yǎng)土中進(jìn)行培養(yǎng)15d，培養(yǎng)條件為濕度35%，溫度（25±2）℃，光照14h、光照強(qiáng)度2500lx、黑暗10h，幼苗表面噴施水，后連同營養(yǎng)土一起栽植大田。

進(jìn)一步地，所述步驟（1）中外植體的消毒處理方法是：采集無任何部位損傷的葉片外植體，用流量為80ml/s的自來水清洗15～20min，之后將其移至超凈工作臺用75%醫(yī)用酒精消毒30s，后用無菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒2～4min，再用無菌水清洗5次，后用無菌濾紙吸去葉片表面水分，備用；

或者，采集所留葉柄不能太短的莖段外植體，將莖段剪成2～3cm長，用流量為120ml/s的自來水清洗15～20min，之后將其移至超凈工作臺用75%醫(yī)用酒精消毒30s，用含有效氯3%的次氯酸鈉消毒6～8min，后用無菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒8～10min，再用無菌水清洗5次，后用無菌濾紙吸去葉片表面水分，備用。

進(jìn)一步地，所述步驟（2）中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+0.8～1.0mg/ltdz+1.0～1.2mg/l6-ba+0.5～0.8mg/lnaa+35～40g/l蔗糖+7.5～10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述步驟（3）中愈傷增殖培養(yǎng)基為ms+2.0～2.5mg/ltdz+0.8～1.0mg/l6-ba+0.2～0.5mg/lnaa+35～40g/l蔗糖+7.5-10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述步驟（4）中體胚細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1.6～2.0mg/ltdz+0.4～0.5mg/lnaa+35～40g/l蔗糖+7.5～10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基，所述的不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基為ms+35～40g/l蔗糖+7.5～10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述步驟（5）中不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1.2～1.6mg/ltdz+0～0.5mg/lnaa+35～40g/l蔗糖+7.5～10g/l瓊脂半固定培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述步驟（6）中不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+3.0～4.0mg/ltdz+0.8～1.0mg/l6-ba+3.0～4.0mg/lnaa+35～40g/l蔗糖+7.5～10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述步驟（7）中營養(yǎng)土的配方是腐殖質(zhì)土、蛭石和石英砂，按體積比為3~4:1:1。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明以北美紅楓“十月光輝”莖段或葉片為試驗材料經(jīng)消毒處理，通過不同培養(yǎng)基和激素篩選得到適合各階段生長繁殖培養(yǎng)基，再通過外植體愈傷誘導(dǎo)、胚性細(xì)胞誘導(dǎo)以及特定器官誘導(dǎo)三個階段建立外植體繁殖體系，以獲得大量高質(zhì)量北美紅楓“十月光輝”組培苗，建立了系統(tǒng)的北美紅楓“十月光輝”組織培養(yǎng)植株再生體系，為實現(xiàn)該品種規(guī)?；S育苗提供了參考。

附圖說明

圖1為不同外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織照片，其中a:莖段外植體培養(yǎng)15d，在切口處繁殖大量愈傷細(xì)胞；b:莖段外植體培養(yǎng)30d，愈傷顏色加深；c:葉片外植體培養(yǎng)15d，葉片邊緣處形成愈傷，葉片發(fā)生嚴(yán)重形變；d:葉片外植體培養(yǎng)30d，葉片形狀基本不存在，完全被愈傷覆蓋。

圖2為胚性愈傷組織形成照片，其中a：繼代3次培養(yǎng)100d后愈傷組織體內(nèi)含大量胚性細(xì)胞；b：繼代5次培養(yǎng)150d愈傷組織分化出白色胚性愈傷群細(xì)胞；c：初代培養(yǎng)45d時胚性愈傷組織；d：胚性愈傷不定器官形成。

圖3為生根培養(yǎng)得到的照片，其中a：莖段外植體培養(yǎng)15d直接生根及愈傷生根；b：繼代培養(yǎng)后帶芽莖段外植體生根發(fā)芽；c：莖段外植體初代培養(yǎng)30d，在白色胚性愈傷組織上形成大量不定根；d：繼代3次后愈傷組織誘導(dǎo)形成的完整植株。

圖4為外植體芽誘導(dǎo)照片，其中a：初代培養(yǎng)30d，綠色胚性愈傷誘導(dǎo)形成莖枝；b：初代培養(yǎng)45d，在外植體切口處誘導(dǎo)形成不定芽；c，d：莖段直接誘導(dǎo)腋芽發(fā)育形成單個植株。

圖5為煉苗移栽得到的北美紅楓照片。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

（1）外植體消毒：采集無任何部位損傷的北美紅楓十月光輝葉片外植體，用流量為80ml/s的自來水清洗15min，之后將其移至超凈工作臺用75%醫(yī)用酒精消毒30s，后用無菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，再用無菌水清洗5次，后用無菌濾紙吸去葉片表面水分，備用；

（2）愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（1）準(zhǔn)備好的外植體接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將接種后的材料置于濕度75%，溫度（25±2）℃，光照14h、光照強(qiáng)度1500lx、黑暗10h條件的人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+0.8mg/ltdz+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；

（3）愈傷增殖培養(yǎng)：將步驟（2）得到的愈傷組織每隔30d分割繼代置于愈傷增殖培養(yǎng)基，在步驟（2）的相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，所述愈傷增殖培養(yǎng)基為ms+2.0mg/ltdz+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基。葉片外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織照片如圖1c和d所示，其中圖1c為葉片外植體培養(yǎng)15d的照片，葉片邊緣處形成愈傷，葉片發(fā)生嚴(yán)重形變；圖1d為葉片外植體培養(yǎng)30d，葉片形狀基本不存在，完全被愈傷覆蓋；

（4）胚性細(xì)胞誘導(dǎo)：在上述愈傷基礎(chǔ)上選擇淺黃色、白色疏松愈傷組織接種于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)15d，后將培養(yǎng)愈傷轉(zhuǎn)移到不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)直到體胚細(xì)胞形成，所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1.6mg/ltdz+0.5mg/lnaa+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基，所述的不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基為ms+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；胚性愈傷組織形成照片如圖2所示，其中a：繼代3次培養(yǎng)100d后愈傷組織體內(nèi)含大量胚性細(xì)胞；b：繼代5次培養(yǎng)150d愈傷組織分化出白色胚性愈傷群細(xì)胞；c：初代培養(yǎng)45d時胚性愈傷組織；d：胚性愈傷不定器官形成；

（5）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（4）得到的胚性愈傷組織置于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度85%，溫度（25±2）℃，光照18h、光照強(qiáng)度3000lx、2h黑暗,所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1.2mg/ltdz+0.5mg/lnaa+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂半固定培養(yǎng)基；

（6）不定根誘導(dǎo)：將步驟（5）得到的胚性愈傷組織繼代置于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度85%，溫度（25±2）℃，光照6h、光照強(qiáng)度1500lx、18h黑暗，所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+4.0mg/ltdz+1.0mg/l6-ba+3.0mg/lnaa+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；外植體芽誘導(dǎo)照片如圖4所示，其中a：初代培養(yǎng)30d，綠色胚性愈傷誘導(dǎo)形成莖枝；b：初代培養(yǎng)45d，在外植體切口處誘導(dǎo)形成不定芽；c，d：莖段直接誘導(dǎo)腋芽發(fā)育形成單個植株；

（7）煉苗移栽：將已長出完整器官的幼苗培養(yǎng)基瓶蓋打開，在光照強(qiáng)度3000lx的光照下煉苗5d，之后將組培苗從培養(yǎng)基中取出，洗掉根部培養(yǎng)基后栽至配置的營養(yǎng)土中進(jìn)行培養(yǎng)15d，所述營養(yǎng)土的配方是腐殖質(zhì)土、蛭石和石英砂，按重量比為3:1:1，培養(yǎng)條件為濕度35%，溫度（25±2）℃，光照14h、光照強(qiáng)度1500lx、黑暗10h，幼苗表面噴施水，后連同營養(yǎng)土一起栽植大田。煉苗移栽得到的北美紅楓照片如圖5所示。

實施例2

（1）外植體消毒：采集所留葉柄不能太短的北美紅楓十月光輝莖段外植體，將莖段剪成2～3cm長，用流量為120ml/s的自來水清洗15～20min，之后將其移至超凈工作臺用75%醫(yī)用酒精消毒30s，用含有效氯3%的次氯酸鈉消毒6～8min，后用無菌水清洗5次，再用0.1%的升汞溶液消毒8～10min，再用無菌水清洗5次，后用無菌濾紙吸去葉片表面水分，備用；

（2）愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（1）準(zhǔn)備好的外植體接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將接種后的材料置于濕度75%，溫度（25±2）℃，光照14h、光照強(qiáng)度1500lx、黑暗10h條件的人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1.0mg/ltdz+1.2mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+40g/l蔗糖+10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；

（3）愈傷增殖培養(yǎng)：將步驟（2）得到的愈傷組織每隔30d分割繼代置于愈傷增殖培養(yǎng)基，在步驟（2）的相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，所述愈傷增殖培養(yǎng)基為ms+2.5mg/ltdz+0.8mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+40g/l蔗糖+10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；莖段外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織如圖1所示，其中a:莖段外植體培養(yǎng)15d，在切口處繁殖大量愈傷細(xì)胞；b:莖段外植體培養(yǎng)30d，愈傷顏色加深；

（4）胚性細(xì)胞誘導(dǎo)：在上述愈傷基礎(chǔ)上選擇淺黃色、白色疏松愈傷組織接種于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)15d，后將培養(yǎng)愈傷轉(zhuǎn)移到不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)直到體胚細(xì)胞形成，所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+2.0mg/ltdz+0.4mg/lnaa+40g/l蔗糖+10g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基，所述的不含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基為ms+35g/l蔗糖+7.5g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；

（5）不定芽誘導(dǎo)：將步驟（4）得到的胚性愈傷組織置于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度85%，溫度（25±2）℃，光照18h、光照強(qiáng)度3000lx、2h黑暗,所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+1.6mg/ltdz+0.1mg/lnaa+40g/l蔗糖+10g/l瓊脂半固定培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)得到的照片如圖3所示，其中a：莖段外植體培養(yǎng)15d直接生根及愈傷生根；b：繼代培養(yǎng)后帶芽莖段外植體生根發(fā)芽；c：莖段外植體初代培養(yǎng)30d，在白色胚性愈傷組織上形成大量不定根；d：繼代3次后愈傷組織誘導(dǎo)形成的完整植株；

（6）不定根誘導(dǎo)：將步驟（5）得到的胚性愈傷組織繼代置于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度85%，溫度（25±2）℃，光照6h、光照強(qiáng)度1500lx、18h黑暗，所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+3.0mg/ltdz+0.8mg/l6-ba+4.0mg/lnaa+35g/l蔗糖+8.0g/l瓊脂的半固定培養(yǎng)基；外植體芽誘導(dǎo)照片如圖4所示，其中a：初代培養(yǎng)30d，綠色胚性愈傷誘導(dǎo)形成莖枝；b：初代培養(yǎng)45d，在外植體切口處誘導(dǎo)形成不定芽；c，d：莖段直接誘導(dǎo)腋芽發(fā)育形成單個植株；

（7）煉苗移栽：將已長出完整器官的幼苗培養(yǎng)基瓶蓋打開，在光照強(qiáng)度3000lx的光照下煉苗7d，之后將組培苗從培養(yǎng)基中取出，洗掉根部培養(yǎng)基后栽至配置的營養(yǎng)土中進(jìn)行培養(yǎng)15d，所述營養(yǎng)土的配方是腐殖質(zhì)土、蛭石和石英砂，按重量比為4:1:1，培養(yǎng)條件為濕度35%，溫度（25±2）℃，光照14h、光照強(qiáng)度1500lx、黑暗10h，幼苗表面噴施水，后連同營養(yǎng)土一起栽植大田。

以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。