本發(fā)明涉及葡萄栽培
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種耐堿性葡萄砧木微繁篩選培養(yǎng)基及微繁篩選方法。
背景技術(shù)：
：我國是世界上鹽堿地大國之一，鹽堿土地面積約占耕土地面積的四分之一，改良利用這些鹽堿土具有廣闊的發(fā)展前景。我國西部是發(fā)展葡萄產(chǎn)業(yè)最有利地區(qū)，嫁接栽培是一項有效的葡萄栽培措施，選用合適的砧木才能發(fā)揮其嫁接栽培的優(yōu)勢。我國應(yīng)用最早、面積最大的葡萄砧木是貝達。貝達耐寒、耐旱、易生根，嫁接親合力好，故而廣泛應(yīng)用，唯一不足是耐鹽堿性較差，耐堿性葡萄貝達砧木的篩選意義十分重大。但應(yīng)用常規(guī)雜交和系統(tǒng)選育，費時費事，而且要用大量人工和土地，葡萄砧木育種長達30年，是葡萄品種育種的一倍時間。葡萄耐鹽性選育研究報道較多，有田間法、容器法等。容器法中又分水泥池、瓷盆法、塑料杯法和試管法；田間法最直觀，管理容易；容器法鹽堿溶液準確，管理費事。但田間法和容器法均篩選周期長，一年只能做一次，不能高效獲取耐堿性篩選植株葡萄砧木。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種耐堿性篩選植株葡萄砧木微繁篩選培養(yǎng)基及微繁篩選方法。本發(fā)明提供的耐堿性篩選植株葡萄砧木的微繁篩選培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)耐堿性篩選植株葡萄砧木的高效篩選，對促進我國西部石灰質(zhì)土和鹽堿土發(fā)展葡萄產(chǎn)業(yè)有積極意義。本發(fā)明提供了一種耐堿性葡萄砧木的微繁篩選培養(yǎng)基，所述微繁篩選培養(yǎng)基以gn蛭石培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包含質(zhì)量百分含量為20％的飽和石灰水和2g/l碳酸鈉；所述gn蛭石培養(yǎng)基為每50～60g蛭石加入80～90ml的gn營養(yǎng)液和25～50mg的青霉素。優(yōu)選的是，以每1000ml水計，所述gn營養(yǎng)液包括以下重量的組分：kno3，475mg；nh4no3，412mg；mgso4·7h2o，92.5mg；kh2po4，85mg；cacl2·2h2o，150mg；mnso4·4h2o，5.5mg；znso4·7h2o，2.2mg；h3bo4，1.6mg；ki，0.2mg；na2moo4·2h2o，0.06mg；cuso4·4h2o，0.06mg；cocl2·6h2o，0.06mg；na2·edta，37.3mg；feso4·7h2o，27.8mg。本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述微繁篩選培養(yǎng)基篩選耐堿性葡萄砧木的方法，包括以下步驟：1)將篩選植株葡萄砧木無菌苗在gs瓊脂培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)，得到初代培養(yǎng)植株；2)當所述初代培養(yǎng)的植株長至10～12cm，進行2次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；3)剪取有頂芽和2～3個葉片的繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)得到的莖段，轉(zhuǎn)入微繁篩選培養(yǎng)基中，在25～28℃、1500～3000lx光照條件下培養(yǎng)30天，得到篩選植株；4)在所述步驟3)得到的篩選植株中選擇出無堿害的植株作為耐堿性篩選植株葡萄砧木。優(yōu)選的是，所述步驟1)篩選植株葡萄砧木無菌苗選自篩選植株砧木實生植株休眠期后長出的含有4～5葉的嫩枝。優(yōu)選的是，初代培養(yǎng)和繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的培養(yǎng)基為gs培養(yǎng)基。優(yōu)選的是，所述步驟2)的繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)剪截上一代培養(yǎng)植株的單芽莖段進行培養(yǎng)優(yōu)選的是，所述步驟2)繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的條件為：25～28℃、1500～3000lx光照條件。優(yōu)選的是，所述嫩枝由30～50cm一年生葡萄砧木實生植株硬枝培養(yǎng)得到。本發(fā)明提供了一種耐堿性篩選植株葡萄砧木的微繁篩選培養(yǎng)基。本發(fā)明通過在gn蛭石培養(yǎng)基中加入半致死堿濃度的石灰水和碳酸鈉，廣泛實現(xiàn)了從葡萄篩選植株種子后代砧木中耐堿性葡萄砧木的成功篩選，為葡萄能在堿性大的西部地區(qū)栽培奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的培養(yǎng)基成本低廉，可有效、快速地篩選耐堿性的葡萄砧木，在促進我國西部石灰質(zhì)土和鹽堿土發(fā)展葡萄產(chǎn)業(yè)有積極意義。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1提供的利用盆栽土進行培養(yǎng)的植株；圖2為本發(fā)明實施例1提供的利用本發(fā)明gn營養(yǎng)液進行水培法獲得的外植體；圖3為本發(fā)明實施例1提供的不同植株在1.5克碳酸鈉加入+20％石灰水和2.5克碳酸鈉加入20％石灰水的受堿害生長結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明實施例1提供的不同植株在2.0克碳酸鈉和20％石灰水條件下受堿害生長結(jié)果圖。具體實施方式本發(fā)明提供了一種耐堿性葡萄砧木的微繁篩選培養(yǎng)基，所述微繁篩選培養(yǎng)基以gn蛭石培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包含質(zhì)量百分含量為20％的飽和石灰水和2g/l碳酸鈉；在本發(fā)明中，所述飽和石灰水和碳酸鈉的加入量形成的堿濃度能夠半致死篩選植株葡萄砧木，實現(xiàn)耐堿性篩選植株葡萄砧木的高效篩選。在本發(fā)明中，所述葡萄優(yōu)選為貝達葡萄品種。所述gn蛭石培養(yǎng)基為每50～60g蛭石加入80～90ml的gn營養(yǎng)液和25～50mg的青霉素。在本發(fā)明中，所述gn營養(yǎng)液能夠給繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)得到的莖段提供大量元素n、p、k及微量元素：mg、s、ca、cl、mn、zn、i、mo、cu、co、na、fe，蛭石作為基質(zhì)起到透氣、保水作用，青霉素起抗菌抑制污染、促進生根作用。本發(fā)明對gn營養(yǎng)液的組成沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)市售gn營養(yǎng)液即可。在本發(fā)明中，以每1000ml水計，所述gn營養(yǎng)液包括以下重量的組分：kno3，475mg；nh4no3，412mg；mgso4·7h2o，92.5mg；kh2po4，85mg；cacl2·2h2o，150mg；mnso4·4h2o，5.5mg；znso4·7h2o，2.2mg；h3bo4，1.6mg；ki，0.2mg；na2moo4·2h2o，0.06mg；cuso4·4h2o，0.06mg；cocl2·6h2o，0.06mg；na2·edta，37.3mg；feso4·7h2o，27.8mg。本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述微繁篩選培養(yǎng)基篩選耐堿性篩選植株葡萄砧木的方法，包括以下步驟：1)將篩選植株葡萄砧木無菌苗在gs瓊脂培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)，得到初代培養(yǎng)植株；2)當所述初代培養(yǎng)的植株長至10～12cm，進行2次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；3)剪取有頂芽和2～3個葉片的繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)得到的莖段，轉(zhuǎn)入微繁篩選培養(yǎng)基中，在25～28℃、1500～3000lx光照條件下培養(yǎng)30天，得到篩選植株；4)在所述步驟3)得到的篩選植株中選擇出無堿害的植株作為耐堿性篩選植株葡萄砧木。本發(fā)明將篩選植株葡萄砧木無菌苗在gs瓊脂培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)，得到初代培養(yǎng)植株。在本發(fā)明中，所述篩選植株葡萄砧木無菌苗優(yōu)選剪取自葡萄砧木實生苗休眠后，1年生的枝條。本發(fā)明優(yōu)選采用綜合無傷消毒技術(shù)獲取無菌苗，所述綜合無傷消毒技術(shù)具體包括以下步驟：第一步：先將無菌水倒入廣口瓶中，并劇烈搖動1分鐘，沖洗2次；第二步：倒入清潔劑搖洗5分鐘，所述清潔劑優(yōu)選為80倍液的84消毒液，無菌水沖洗3次，倒入70％酒精迅速(不超過5秒鐘)沖洗一下，去酒精，無菌水沖洗2次；第三步：倒去無菌水，加入0.1‰升汞(內(nèi)加2％的95％酒精)浸沒材料，并劇烈搖動，根據(jù)材料老幼確定時間(上部幼嫩枝條時間短，下部較老時間長)，0.1‰升汞搖動時間為4～6分鐘；消毒結(jié)束后，在超凈工作臺上剪去受傷藥面，剪取帶有1～2芽的莖段接種于裝有g(shù)s培養(yǎng)基50ml的小三角瓶中。接種后，放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為29土1℃培養(yǎng)。在本發(fā)明中，所述步驟1)初代培養(yǎng)的條件包括：25～28℃、1500～3000lx光照條件，更優(yōu)選為26℃，2000lx光照條件。當初代培養(yǎng)的植株長至10～12cm，進行繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。在本發(fā)明中，初次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的原料為初代培養(yǎng)植株的單芽莖段，第2次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的原料為初次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植株的單芽莖段。具體的，當植株長至10～12cm時，取單芽莖段進行繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。在本發(fā)明中，所述2次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的條件獨立為25～28℃、2000～3000lx光照條件，更優(yōu)選為27℃，2500lx光照條件。在本發(fā)明中，所述初代培養(yǎng)和繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)用培養(yǎng)基為gs培養(yǎng)基。本發(fā)明對所述gs培養(yǎng)基沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)市售gs培養(yǎng)基即可，如gs培養(yǎng)基為：每1000ml水中包括以下組分:1250mg/lkno3，125mg/lmgso4·7h2o，175mg/lna2hpo4，150mg/lcacl2·2h2o，5mg/lmnso4·h2o，1mg/lznso4·7h2o，1.5mg/lh3bo3，0.375mg/lki，0.125mg/lna2moo4·2h2o，0.0125mg/lcuso4·4h2o，0.0125mg/lcoci·6h2o，18.65mg/lna2-edta，13.9mg/lfeso4·7h2o，10mg/lvb1，1mg/lvb6，1mg/lvpp，25mg/l肌醇，0.2mg/liaa，15000mg/l蔗糖和4000～7000mg/l瓊脂。調(diào)整ph為5.8～6.0。繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，本發(fā)明優(yōu)選當繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)擴繁數(shù)量充足時，選取長勢均勻一致繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)得到的植株剪取有頂芽和2～3個葉片的莖段，轉(zhuǎn)入微繁篩選培養(yǎng)基中，25～28℃、1500～3000lx光照條件下培養(yǎng)30天，得到篩選植株。本發(fā)明從篩選植株中選擇出無堿害的植株作為耐堿性篩選植株葡萄砧木。在本發(fā)明中，所述篩選過程優(yōu)選進行對照試驗，當本發(fā)明篩選方法得到的無堿害植株生長狀態(tài)高于對照組時，視為本發(fā)明方法篩選成功。所述對照組植株優(yōu)選為當?shù)睾Y選植株砧木植株，抗鹽堿地的抗3(抗砧3號)(樊秀彩.葡萄砧木新品種‘抗砧3號’.園藝學報[j].2011,38(6):9-9)，和耐堿性強的葡萄砧木1103p。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述的一種耐堿性篩選植株葡萄砧木微繁篩選培養(yǎng)基及微繁篩選方法做進一步詳細的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實施例。實施例1第一步：篩選材料的采?。涸诓宦裢恋母瓯邴}堿地，當葡萄植株休眠期過后，春季從貝達實生種子植株采取7個植株枝條(編號為a1；b2；c3；d4；e5；f6；h7)砧木進行試驗。剪成長30～50厘米一年生硬枝，保濕帶回備用。從當?shù)刎愡_砧木植株也采取30～50厘米一年生硬枝為對照(為編號k8)，同時引進抗鹽堿地的抗3，和耐堿性強的葡萄砧木1103p(2005年趙秀梅等報道1103p葡萄抗鹽性強、2006年任玉華也報道1103p耐鹽性較強)種苗做雙對照(編號為抗3、1103p)。第二步：初選無菌材料的獲得：在休眠期過后，將貝達砧木種子植株和對照種條和種苗插(栽)于盆中或瓶中或大棚中，侍萌發(fā)后有4～5葉的嫩枝時，剪取帶芽莖段，采用綜合無傷消毒技術(shù)獲取無菌苗，然后在gs瓊脂培養(yǎng)基上，在25～28℃，1500～3000lx光照條件培養(yǎng)室內(nèi)，進行初代培養(yǎng)，以獲得的各種無菌試驗材料。當初代葡萄試管苗長至10cm，進行繼代，即剪成單芽莖段轉(zhuǎn)入另瓶gs瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶放5～8個單芽莖段，30天后多數(shù)葡萄品種又長至10cm，再剪成單芽莖段轉(zhuǎn)入另瓶同種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，仍在25～28℃、2000～3000lx連續(xù)冷光源的日光燈下培養(yǎng)，獲得一批無菌砧木貝達葡萄通過剪取實生貝達苗水培獲得的實生貝達試管苗和對照種條和種苗的葡萄試管苗。通過對比，利用盆栽土進行培養(yǎng)的植株均因土壤鹽堿性太大取材失敗(見圖1)，利用本發(fā)明gn營養(yǎng)液通過水培法獲得的植株均取材成功(見圖2)，從貝達砧木種子植株采取7個植株枝條，最后a1；b2；d4；e5；f6五個株系繁殖成功的葡萄試管苗，對照k8；抗3；1103p砧木試管繁殖全部成功，并都有一定量的試管苗。第三步：耐堿性貝達葡萄砧木的微繁篩選培養(yǎng)基的配制耐堿性貝達葡萄砧木的微繁篩選培養(yǎng)基的篩選試驗：配制系列堿性蛭石培養(yǎng)基，用大口培養(yǎng)瓶瓶，內(nèi)裝60g蛭石，加有不同量的石灰水至80mlgn營養(yǎng)液，然后加入50mg/升的青霉素，經(jīng)高溫滅菌備用。接種時，每瓶放5個有頂芽帶2葉的莖段，蓋上透氣瓶蓋，在25～28度，1500～3000lux連續(xù)冷光源日光燈下培養(yǎng)，每5天觀察一次，生長和受害情況，30天后統(tǒng)計觀察和照相，每項處理6～8瓶。用系列飽和石灰水0％、5％、10％、15％、20％、30％的簡易蛭石培養(yǎng)基，在最高濃度30％飽和石灰水下，30天后，試驗各砧木之間有差異，但不顯著。用5克、10克、15克、20克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基各砧木又全部死亡；20％石灰水再加入0、1.25、2.0、2.5、5、10克、20克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基,每處理接種瓊脂培養(yǎng)基苗，每處理6～8瓶，均勻插入蛭石培養(yǎng)基中，于2000～3000lx冷光源日光燈下培養(yǎng)，30天后取出統(tǒng)計小苗和葉片堿害情況，并照相。通過幾次試驗，找出了堿害半致死劑量，以此來做為篩選貝達砧木堿濃度，以代表石灰質(zhì)土壤，用不同碳酸鈉代表堿性土壤方法進行篩選。第四步：葡萄砧木貝達耐堿性篩選堿濃度的確定：用飽和石灰水為0％、5％、10％、15％、20％、30％的簡易蛭石培養(yǎng)基進行試驗，試驗結(jié)果差異不顯著，不適宜篩選。當加入5、10、15、20克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基，堿濃度太高又全部死亡。在20％石灰水再加入0、1.25、2.5、5、10克、20克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基試驗，在20％飽和石灰水1.25、2.5克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基有一差異，特別是在20％飽和石灰水加入2.5克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基上，在葡萄砧木葉片耐堿性上差異明顯，試驗表明堿的濃度還略高，觀察到高濃度的碳酸鈉的蛭石苗開始是從剪口褐變至變黑，隨著時間的延長，莖段及葉片發(fā)黃、一直到整個莖段及葉片的枯死，濃度稍低碳酸鈉蛭石苗在其后的15天后也會出現(xiàn)黃化、褐化以至到整個苗枯死，這表明碳酸鈉堿濃度太高，不適宜篩選耐堿性葡萄砧木，看來未找到半致死劑量。后在20％飽和石灰水加入2.0克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基試驗有較明顯的差異，終于找到20％飽和石灰水加入2.0克碳酸鈉蛭石培養(yǎng)基，是堿濃度的半致死的劑量。第五步：篩選堿濃度確定下篩選葡萄砧木貝達的耐堿性株系：第一次試驗篩選：把化學純碳酸鈉濃度降為每升為0克、1.25克、1.5克、2.5克和5克碳酸鈉再各加入20％飽和石灰水，用b2；d4；e5；f6；k8；抗3；1103p砧木進行試驗，30天后觀察統(tǒng)計，1.5克碳酸鈉加入+20％石灰水1103p砧木死亡，2.5克碳酸鈉加入20％石灰水有的砧木都未成苗，但出現(xiàn)葉受堿害有一定差異害，結(jié)果見圖3-1～圖3-7，圖3-1為b2低濃度1.25克碳酸鈉+20％石灰水和2.5克碳酸鈉+20％石灰水受堿害結(jié)果圖；圖3-2為d4低濃度1.25克碳酸鈉+20％石灰水和2.5克碳酸鈉+20％石灰水(半數(shù)葉片有綠色)受堿害結(jié)果圖；圖3-3為e5低濃度1.25克碳酸鈉+20％石灰水和2.5克碳酸鈉+20％石灰水(少半數(shù)葉片有綠色)受堿害結(jié)果圖；圖3-4為f61.25克碳酸鈉+20％石灰水和2.5克碳酸鈉+20％石灰水(多半數(shù)葉片呈綠色)受堿害結(jié)果圖；圖3-5為k81.25克碳酸鈉+20％石灰水和2.5克碳酸鈉+20％石灰水(少半數(shù)葉片有綠色)受堿害結(jié)果圖；圖3-6為抗3砧木1.25克碳酸鈉+20％石灰水(少部受害)和2.5克碳酸鈉++20％石灰水(極少葉片有綠色)受堿害結(jié)果圖；圖3-7為1103p在1.25克碳酸鈉+20％石灰水(多數(shù)受害)和2.5克碳酸鈉+20％石灰水(無綠色葉片)受堿害結(jié)果圖。耐堿性依次為f6>d4>k8>b2>e5>抗3>1103p，2014年年底又重復進行，結(jié)果相近。表1：不同碳酸鈉濃度和20％飽和石灰水對葡萄砧木葉片和小植株的影響碳酸鈉濃度(克)砧木號小植株堿害程度葉片堿害程度1.25b2002.5b20++1.25d4+02.5d40++1.25e5+02.5e50++1.25f6+02.5f60+1.25k8+02.5k80++1.25抗3++02.5抗30+++1.251103p+++02.51103p0++++小植株堿害程度分0級(無堿害:0)、1級(極輕堿害:+)、2級(輕堿害:++)、3級(中堿害:+++)、4級(重堿害:++++)。葉片堿害程度分0級(葉片無堿害:0)、1級(多數(shù)葉片有綠色:+)、2級(半數(shù)葉片有綠色:++)、3級(少數(shù)葉片有綠色:+++)、4級(重堿害，葉片無綠色:++++)。植物離體葉片失綠進程常用來鑒定植物耐性。本發(fā)明在2.5克碳酸鈉+20％石灰水的堿濃度下，從圖3-1～圖3-7和表可看出，供試葡萄砧木無一個砧木長成苗，但在本發(fā)明中長達一月的堿害下，仍有綠色葉片或部分綠色葉片，反映了供試砧木耐堿性程度不同，綠色葉片或部分綠色多的，耐堿性程度高，沒有或極少耐堿性程度低，根據(jù)小植株和葉片受害程度排列，耐堿性依次為f6>b2>d4>e5>k8>抗3>1103p。第二次半致死的劑量堿濃度下的篩選結(jié)果：篩選方法同前，用半致死劑量的堿濃度進行，即20％石灰水再加入2.00克碳酸鈉，30天后觀察統(tǒng)計(根系生長為主)，加入后d4；e5未受害，生長最好，b2；f6未受害，生長略差，但都略高于k8，a1(此時已有一定數(shù)量的瓊脂試管苗)受害，生長差，抗3少數(shù)成苗，多數(shù)受害，1103p砧木則受害最重，大部死亡，耐堿性依次排列為f6>b2>d4>e5>k8>a1>抗3>1103p，與前結(jié)果相近，f6>b2>d4>e5>好于對照貝達砧木，a1生長差于>k8>抗3>1103p，淘汰。入選的貝達株系為f6、d4、e5、b2，結(jié)果見圖4(4-1，f6在2.0克碳酸鈉和20％石灰水的生長正常；4-2，b2在2.0克碳酸鈉和20％石灰水的生長正常；4-3，d4在2.0克碳酸鈉和20％石灰水的生長正常；4-4，e5在2.0克碳酸鈉和20％石灰水的生長正常情況；4-5，k8在2.0克碳酸鈉和20％石灰水下生根略差；4-6，a1在2.0克碳酸鈉和20％石灰水下輕度受害；4-7，抗3在2.00克碳酸鈉下和20％石灰水下中度受害；4-8，1103p在2.0克碳酸鈉和20％石灰水的生長情況下重度受害)，這4個株系都優(yōu)于對照k8，更優(yōu)于耐鹽堿砧木抗3和1103p，篩選成功為下一步田間鹽堿地終選提供耐堿性貝達砧木。通過二次耐堿性篩選貝達砧木，已選出f6、b2、d4和e5為耐堿性貝達砧木株系，最好是貝達f6、b2，其次d4和e5株系，它們都優(yōu)于當?shù)刎愡_砧木，更優(yōu)于耐鹽堿的抗3、1103p砧木，表明本方法可以用于葡萄砧木的篩選。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12