本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地說，本發(fā)明涉及一種促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
：羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，本課題組前期根據(jù)羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，已推導(dǎo)出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發(fā)生在胞質(zhì)中，mep途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進(jìn)而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經(jīng)角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環(huán)氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進(jìn)一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，形成羅漢果甜苷v。異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴(yán)格調(diào)控，一直被認(rèn)為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，cyp450酶基因的表達(dá)對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達(dá)cyp450酶基因，可以促進(jìn)羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制cyp450酶基因的表達(dá)，羅漢果甜苷v的產(chǎn)量將顯著降低。然而，cyp450酶基因是個(gè)超基因家族，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果cyp749a36基因與羅漢果甜苷v的合成途徑有一定關(guān)聯(lián)。現(xiàn)有技術(shù)中未見有促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)來提高羅漢果中甜苷v含量的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種通過茉莉酸甲酯處理羅漢果組培苗或其果實(shí)來促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，為有效促進(jìn)羅漢果中甜苷v含量積累奠定基石。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種通過對羅漢果組培苗根系處理與花粉處理進(jìn)一步促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)來提高羅漢果甜苷v含量的方法。為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)至少30天，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為50-400μmol/l。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：相對濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux、光照時(shí)間8h/d、溫度23±2℃。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為50-400μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為300-350μmol/l。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導(dǎo)液至表面滴水，連續(xù)噴灑5天，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為50-400μmol/l的茉莉酸甲酯。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為200-250μmol/l的茉莉酸甲酯。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括有0.35mg/l油菜素甾醇和0.02mg/l獨(dú)角金內(nèi)酯。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述組培苗經(jīng)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之前經(jīng)過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個(gè)傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經(jīng)過預(yù)浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續(xù)變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預(yù)浸泡處理是指將玉米須經(jīng)洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預(yù)浸泡溶液浸泡處理15min，所述預(yù)浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、3g/l檸檬酸、4μg/l的天花粉、0.25g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，羅漢果組培苗移栽后，于盛花期早上6-7點(diǎn)摘取雄株2-3級(jí)側(cè)蔓上的花朵，取花粉，將花粉先置于花粉浸泡液中用頻率為3khz的超聲波振蕩器中攪拌處理2h，再經(jīng)400目紗布過濾后，將紗布連同濾上物一起平攤置于帶蓋的玻璃器皿中，蓋上設(shè)有通氣孔，將帶蓋玻璃器皿連同花粉一起置于40℃恒溫干燥機(jī)中干燥8h，密封儲(chǔ)存于4℃下備用，授粉前將其取出置于相對濕度為85-90％的環(huán)境中吸濕24h；其中，所述花粉浸泡液中含有30g/l的蜂蜜、0.30mg/l油菜素甾醇、0.05mg/l視黃酸、0.01mg/l獨(dú)角金內(nèi)酯，溶劑為磁化水。本發(fā)明的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法操作簡單，成本低，對環(huán)境友好，適于規(guī)模生產(chǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣價(jià)值，至少包括以下有益效果：1)本發(fā)明通過在羅漢果組培苗移栽前對其進(jìn)行采用含有茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，長期內(nèi)以刺激并誘導(dǎo)羅漢果中cyp749a36基因的表達(dá)，從而促進(jìn)cyp450酶基因過表達(dá)，促進(jìn)羅漢果甜苷v的生物合成，提高其產(chǎn)量；2)本發(fā)明通過在羅漢果組培苗移栽后，于授粉后20-30d采用含有茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)液處理羅漢果表面，在短期內(nèi)進(jìn)一步刺激并誘導(dǎo)羅漢果中cyp749a36基因的表達(dá)，從而促進(jìn)促進(jìn)羅漢果甜苷v的生物合成；3)本發(fā)明通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入適宜量的油菜素甾醇和獨(dú)角金內(nèi)酯，與茉莉酸甲酯起協(xié)調(diào)作用，進(jìn)一步誘導(dǎo)刺激羅漢果組培苗表達(dá)cyp749a36基因；4)本發(fā)明通過對羅漢果組培苗誘導(dǎo)培養(yǎng)前進(jìn)行根系處理，以去除弱根，劃傷刺激強(qiáng)根，并以連續(xù)變溫處理與磁場處理結(jié)合，刺激并脅迫羅漢果組培苗果實(shí)中甜苷v生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因cyp749a36的高表達(dá)，從而進(jìn)一步提高羅漢果甜苷v的含量；5)本發(fā)明通過對用于授粉的雄株花粉采用花粉浸泡液結(jié)合超聲振蕩處理，充分發(fā)揮花粉浸泡液中主要成分的作用，其中蜂蜜、磁化水結(jié)合超聲波的空化作用將花粉浸泡液中的油菜素甾醇、視黃酸和獨(dú)角金內(nèi)酯充分包裹雄株花粉，強(qiáng)烈誘導(dǎo)并調(diào)控羅漢果雌株授粉后酶基因cyp749a36高表達(dá)，促進(jìn)cyp749a36基因表達(dá)量積累，從而促進(jìn)cyp450酶基因高表達(dá)，提高羅漢果甜苷v含量。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。需要說明的是，下述實(shí)施方案中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。需要說明的是，本文所述的羅漢果組培苗為常規(guī)組培方法得到。6-ba為6-芐氨基腺嘌呤，iba為吲哚丁酸。實(shí)施例1：一種促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)至少30天，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為50μmol/l。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：相對濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux、光照時(shí)間8h/d、溫度23±2℃。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為50μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。實(shí)施例2：一種促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)至少30天，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為400μmol/l。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：相對濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux、光照時(shí)間8h/d、溫度23±2℃。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為400μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。實(shí)施例3：一種促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度為350μmol/l。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：相對濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux、光照時(shí)間8h/d、溫度23±2℃。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分?jǐn)?shù)為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯濃度為350μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。實(shí)施例4：在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導(dǎo)液至表面滴水，連續(xù)噴灑5天，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為50μmol/l的茉莉酸甲酯。實(shí)施例5：在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導(dǎo)液至表面滴水，連續(xù)噴灑5天，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為400μmol/l的茉莉酸甲酯。實(shí)施例6：在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導(dǎo)液至表面滴水，連續(xù)噴灑5天，所述誘導(dǎo)液中含有濃度為250μmol/l的茉莉酸甲酯。實(shí)施例7：在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括有0.35mg/l油菜素甾醇和0.02mg/l獨(dú)角金內(nèi)酯。實(shí)施例8：在實(shí)施例6的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括有0.35mg/l油菜素甾醇和0.02mg/l獨(dú)角金內(nèi)酯。實(shí)施例9：在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述組培苗經(jīng)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之前經(jīng)過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個(gè)傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經(jīng)過預(yù)浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續(xù)變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預(yù)浸泡處理是指將玉米須經(jīng)洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預(yù)浸泡溶液浸泡處理15min，所述預(yù)浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、3g/l檸檬酸、4μg/l的天花粉、0.25g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。實(shí)施例10：在實(shí)施例6的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述組培苗經(jīng)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之前經(jīng)過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個(gè)傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經(jīng)過預(yù)浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續(xù)變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預(yù)浸泡處理是指將玉米須經(jīng)洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預(yù)浸泡溶液浸泡處理15min，所述預(yù)浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、3g/l檸檬酸、4μg/l的天花粉、0.35g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。實(shí)施例11：在實(shí)施例8的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，所述組培苗經(jīng)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之前經(jīng)過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個(gè)傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經(jīng)過預(yù)浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續(xù)變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預(yù)浸泡處理是指將玉米須經(jīng)洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預(yù)浸泡溶液浸泡處理15min，所述預(yù)浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、3g/l檸檬酸、4μg/l的天花粉、0.25g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。實(shí)施例12：在實(shí)施例6的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，羅漢果組培苗移栽后，于盛花期早上6-7點(diǎn)摘取雄株2-3級(jí)側(cè)蔓上的花朵，取花粉，將花粉先置于花粉浸泡液中用頻率為3khz的超聲波振蕩器中攪拌處理2h，再經(jīng)400目紗布過濾后，將紗布連同濾上物一起平攤置于帶蓋的玻璃器皿中，蓋上設(shè)有通氣孔，將帶蓋玻璃器皿連同花粉一起置于40℃恒溫干燥機(jī)中干燥8h，密封儲(chǔ)存于4℃下備用，授粉前將其取出置于相對濕度為85-90％的環(huán)境中吸濕24h；其中，所述花粉浸泡液中含有30g/l的蜂蜜、0.30mg/l油菜素甾醇、0.05mg/l視黃酸、0.01mg/l獨(dú)角金內(nèi)酯，溶劑為磁化水。實(shí)施例13：在實(shí)施例11的基礎(chǔ)上，所述的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，羅漢果組培苗移栽后，于盛花期早上6-7點(diǎn)摘取雄株2-3級(jí)側(cè)蔓上的花朵，取花粉，將花粉先置于花粉浸泡液中用頻率為3khz的超聲波振蕩器中攪拌處理2h，再經(jīng)400目紗布過濾后，將紗布連同濾上物一起平攤置于帶蓋的玻璃器皿中，蓋上設(shè)有通氣孔，將帶蓋玻璃器皿連同花粉一起置于40℃恒溫干燥機(jī)中干燥8h，密封儲(chǔ)存于4℃下備用，授粉前將其取出置于相對濕度為85-90％的環(huán)境中吸濕24h；其中，所述花粉浸泡液中含有30g/l的蜂蜜、0.30mg/l油菜素甾醇、0.05mg/l視黃酸、0.01mg/l獨(dú)角金內(nèi)酯，溶劑為磁化水。為了說明本發(fā)明的技術(shù)效果，本發(fā)明的申請人針對不同方法或?qū)嵤├玫降牧_漢果果實(shí)，針對cyp749a36基因表達(dá)量以及甜苷v含量進(jìn)行測定，具體方法以及結(jié)果如下。1、cyp749a36基因表達(dá)量測定方法：利用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀，采用qrt-pcr檢測cyp749a36基因的表達(dá)。步驟一、樣品前處理：采集羅漢果果實(shí)，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆?。步驟二、先采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna；步驟三、將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；步驟四、采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，cyp749a36引物序列為：fp：gataagaatgcggccgcatggttggtatgagaatctacg，rp：cgagctcttatggcttgtggtgagacaatg；內(nèi)參基因用ubq5，序列為fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc；步驟五、qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl；反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。2、羅漢果甜苷v含量：采用高效液相色譜法，具體方法參考《廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》第2007年04期上發(fā)表的“hplc測定羅漢果中羅漢果甜苷v的含量”一文。對比例1：以實(shí)施例1-3的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度依次設(shè)定為：0、100、150、200、250、300、350、400μmol/l，對比研究在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為30天時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯的濃度對羅漢果cyp749a36基因表達(dá)量和甜苷v含量(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的影響，結(jié)果見表1。表1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯濃度對羅漢果cyp749a36基因表達(dá)量和甜苷v含量的影響茉莉酸甲酯的濃度μmol/l0100150200250300350400cyp749a36基因表達(dá)量14.47.39.912.314.415.314.2甜苷v含量/(w/w％)0.751.261.521.771.982.202.312.16注：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實(shí)cyp749a36基因表達(dá)量以未經(jīng)茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實(shí)cyp749a36基因表達(dá)量是1為參照；上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為上述每一個(gè)實(shí)施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)得到的。由表1可知，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加茉莉酸甲酯可以有效促進(jìn)羅漢果果實(shí)cyp749a36基因的表達(dá)，且以300-350μmol/l時(shí)為最適宜濃度。對比例2：以實(shí)施例4-6的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，將誘導(dǎo)液中茉莉酸甲酯的濃度依次設(shè)定為：0、100、150、200、250、300、350、400μmol/l，對比研究誘導(dǎo)液中茉莉酸甲酯的濃度對羅漢果cyp749a36基因表達(dá)量和甜苷v含量的影響，結(jié)果見表2。表2誘導(dǎo)液中茉莉酸甲酯濃度對羅漢果cyp749a36基因表達(dá)量和甜苷v含量的影響茉莉酸甲酯的濃度μmol/l0100150200250300350400cyp749a36基因表達(dá)量15.316.116.717.117.316.916.716.4甜苷v含量/(w/w％)2.312.402.452.492.512.472.442.43注：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實(shí)cyp749a36基因表達(dá)量以未經(jīng)茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實(shí)cyp749a36基因表達(dá)量是1為參照；上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為上述每一個(gè)實(shí)施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)得到的。由表2可知，在誘導(dǎo)液中添加茉莉酸甲酯，于羅漢果苗木待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑，可以進(jìn)一步有效促進(jìn)羅漢果果實(shí)cyp749a36基因的表達(dá)，且以誘導(dǎo)液中茉莉酸甲酯濃度為200-250μmol/l時(shí)為最適宜濃度。對比例3：對比實(shí)施例3、實(shí)施例6、實(shí)施例7、實(shí)施例8、實(shí)施例9、實(shí)施例10、實(shí)施例11、實(shí)施例12、實(shí)施例13的促進(jìn)羅漢果cyp749a36基因表達(dá)的方法，測定羅漢果cyp749a36基因表達(dá)量和甜苷v含量，結(jié)果見表3。對照組設(shè)定為：以實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中茉莉酸甲酯濃度設(shè)為0μmol/l，其他同實(shí)施例3。表3不同實(shí)施例方法對羅漢果cyp749a36基因表達(dá)量和甜苷v含量的影響注：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實(shí)cyp749a36基因表達(dá)量以未經(jīng)茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實(shí)cyp749a36基因表達(dá)量是1為參照；上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為上述每一個(gè)實(shí)施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)得到的。實(shí)施例7與實(shí)施例8分別是在實(shí)施例3與實(shí)施例6的基礎(chǔ)上，于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中增加了適量的油菜素甾醇和獨(dú)角金內(nèi)酯，由表3可以看出，實(shí)施例7與實(shí)施例8分別相對實(shí)施例3與實(shí)施例6得到的羅漢果果實(shí)中cyp749a36基因表達(dá)量與甜苷v含量是明顯增加的；實(shí)施例9、實(shí)施例10、實(shí)施例11分別是在實(shí)施例3、實(shí)施例6與實(shí)施例8的基礎(chǔ)上，于誘導(dǎo)培養(yǎng)之前將組培苗經(jīng)過根部處理，由表3可以看出，實(shí)施例9、實(shí)施例10、實(shí)施例11分別相對實(shí)施例3、實(shí)施例6與實(shí)施例8得到的羅漢果果實(shí)中cyp749a36基因表達(dá)量與甜苷v含量是顯著增加的。實(shí)施例12與實(shí)施例13分別是在實(shí)施例6與實(shí)施例11的基礎(chǔ)上，于移栽授粉前，對羅漢果雄花花粉進(jìn)行處理，由表3可以看出，實(shí)施例12與實(shí)施例13分別相對實(shí)施例6與實(shí)施例11得到的羅漢果果實(shí)中cyp749a36基因表達(dá)量與甜苷v含量是顯著增加的。盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。當(dāng)前第1頁12