本發(fā)明屬于生物技術(shù)應用領域，具體地，涉及一種高存活率的細胞凍存方法。

背景技術(shù)：

細胞培養(yǎng)是生物與健康相關(guān)研究領域的一項重要技術(shù)。隨著生命科學的迅速發(fā)展，目前細胞培養(yǎng)已成為細胞生物學、分子生物學、遺傳學和免疫學等學科研究的重要基礎。為了深入探討細胞的生長活動規(guī)律、有關(guān)疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發(fā)具有不同針對性的細胞培養(yǎng)方法具有重要意義。

人們在細胞生物學及其相關(guān)學科的研究中，越來越多的運用組織細胞培養(yǎng)增殖技術(shù)，將有研究意義或有應用前景的活體細胞，采用低溫度進行長期保存數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年甚至數(shù)百年，一旦需要，可隨時對所保存的細胞進行復蘇，恢復其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學特性，供生命科學研究實驗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明提供了一種高存活率的細胞凍存方法，用于多種人源以及非人源細胞的培養(yǎng)。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種高存活率的細胞凍存方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入3-5mlpbs洗滌細胞2-3次，向細胞培養(yǎng)皿中加入1-2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3-5min，加入2-3ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細胞培養(yǎng)皿底部40-50次；將液體移至細胞離心管中，在1000-1500g/min條件下離心3-10min，用移液槍去除上清液，加入凍存液，使用移液槍上下吹打細胞40-50次，加入到細胞凍存管中，擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在2-7℃保存10-30min，再于-15--20℃保存40-60min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進行細胞凍存。第二天放入液氮罐中在液氮浸沒條件下進行細胞凍存。本發(fā)明的高存活率的細胞凍存方法，安全性、穩(wěn)定性好，凍存后的細胞復蘇后存活率高，可以適用于人源以及非人源的多種細胞的培養(yǎng)。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，每支凍存管中細胞凍存密度為10⁵-10⁶個細胞。細胞密度合理，可以有效保證細胞的存活率及細胞活性。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。可以與胰蛋白酶相配合，迅速使貼壁細胞脫離培養(yǎng)皿，減少胰蛋白酶對細胞的損傷。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述培養(yǎng)基包括70-90%的基礎培養(yǎng)基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以進一步為培養(yǎng)的細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時還能終止胰蛋白酶的消化作用。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉2-5份、殼聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、維生素c1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基礎培養(yǎng)基80-90份。細胞凍存液組分合理，營養(yǎng)豐富，其中右旋糖酐可以，n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺則抑制細胞活動和基因表達，維生素c的抗氧化性好，在保證休眠細胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、絲膠蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、n-異丙基丙烯酰胺0.2-0.4份、亞麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份?；A培養(yǎng)基組分合理，營養(yǎng)豐富，可以提高細胞凍存時的營養(yǎng)物質(zhì)，保證凍存細胞的活性。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述基礎培養(yǎng)基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述基礎培養(yǎng)基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經(jīng)白細胞素1-4份。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素?？梢杂行Х乐箖龃婕毎晃廴?。

進一步的，上述的高存活率的細胞凍存方法，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。

有益效果：本發(fā)明所述的高存活率的細胞凍存方法，方法合理，應用成本低，在保證休眠細胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

附圖說明

圖1為實施例1-4細胞存活率的測定圖。

具體實施方式

下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。

實施例1

一種高存活率的細胞凍存方法，凍存人源性肝癌細胞a549，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入3mlpbs洗滌細胞3次，向細胞培養(yǎng)皿中加入1ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3min，加入2ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細胞培養(yǎng)皿底部40次；將液體移至細胞離心管中，在1000g/min條件下離心10min，用移液槍去除上清液，加入凍存液，使用移液槍上下吹打細胞40次，加入到細胞凍存管中，每支凍存管中細胞凍存密度為10⁵個細胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在2℃保存10min，再于-15℃保存60min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進行細胞凍存。第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進行細胞凍存。

其中，所述培養(yǎng)基包括70%的基礎培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥乙基淀粉2份、殼聚糖5份、谷胱甘肽2份、維生素c1份、右旋糖酐0.3份、丙二醇0.5份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1份和基礎培養(yǎng)基80份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、絲膠蛋白5份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽堿0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、n-異丙基丙烯酰胺0.2份、亞麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經(jīng)白細胞素1份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

實施例2

一種高存活率的細胞凍存方法，凍存小鼠來源的黑色素瘤細胞b16，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌細胞2次，向細胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化5min，加入3ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細胞培養(yǎng)皿底部50次；將液體移至細胞離心管中，在1500g/min條件下離心3min，用移液槍去除上清液，加入凍存液，使用移液槍上下吹打細胞50次，加入到細胞凍存管中，每支凍存管中細胞凍存密度為10⁶個細胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在7℃保存30min，再于-20℃保存40min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進行細胞凍存。第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進行細胞凍存。

其中，所述培養(yǎng)基包括90%的基礎培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉2-5份、殼聚糖5-10份、谷胱甘肽2-5份、維生素c1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.1-1份和基礎培養(yǎng)基80-90份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、絲膠蛋白9份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.6份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.8份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎培養(yǎng)基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎培養(yǎng)基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子8份、白介素28份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ6份和神經(jīng)白細胞素4份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

實施例3

一種高存活率的細胞凍存方法，凍存猴腎細胞marc145，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入4mlpbs洗滌細胞3次，向細胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化4min，加入3ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細胞培養(yǎng)皿底部48次；將液體移至細胞離心管中，在1200g/min條件下離心5min，用移液槍去除上清液，加入凍存液，使用移液槍上下吹打細胞45次，加入到細胞凍存管中，每支凍存管中細胞凍存密度為5×10⁵個細胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在5℃保存20min，再于-18℃保存50min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進行細胞凍存。第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進行細胞凍存。

其中，所述培養(yǎng)基包括80%的基礎培養(yǎng)基以及20%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜10份、羥乙基淀粉3份、殼聚糖6份、谷胱甘肽3份、維生素c2份、右旋糖酐3份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基礎培養(yǎng)基85份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.3份、亞麻酸1.6份、乙醇胺0.7份、芳香酸酯0.5份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎培養(yǎng)基還包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎培養(yǎng)基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子6份、白介素25份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細胞素3份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

實施例4

一種高存活率的細胞凍存方法，凍存大鼠的永生化肝星形細胞hsc-t6，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌細胞3次，向細胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化4min，加入3ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細胞培養(yǎng)皿底部50次；將液體移至細胞離心管中，在1000g/min條件下離心8min，用移液槍去除上清液，加入凍存液，使用移液槍上下吹打細胞50次，加入到細胞凍存管中，每支凍存管中細胞凍存密度為10⁶個細胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在2℃保存20min，再于-18℃保存45min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進行細胞凍存。第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進行細胞凍存。

其中，所述培養(yǎng)基包括70%的基礎培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。此外，所述細胞凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥乙基淀粉2份、殼聚糖6份、谷胱甘肽3份、維生素c1份、右旋糖酐4份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲酰胺0.8份和基礎培養(yǎng)基90份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉72份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.3份、肌醇1份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.3份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎培養(yǎng)基還包括6份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸5份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸10份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎培養(yǎng)基還包括4份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細胞生長因子2份、白介素28份、白介素43份、白介素144份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細胞素2份。

進一步的，所述基礎培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

將實施例1-4凍存的細胞分別取凍存后3個月、6個月、9個月、12個月、18個月以及24個月的凍存細胞進行復蘇，并對細胞存活率進行測定，細胞存活率均在85%以上。

以上所述僅是發(fā)明的幾個實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發(fā)明的保護范圍。