本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種細胞凍存方法及細胞凍存液。
背景技術：
：超低溫冷凍保存是細胞長期保存的一種有效方法，主要通過降低細胞的代謝率來起到保護作用。液氮(-196℃)保存細胞是最常見的一種細胞長期保存方式，調(diào)節(jié)和控制細胞生長代謝的各類酶的作用受到極大抑制，使細胞內(nèi)部的生化反應十分緩慢，甚至停止，從而避免細胞遺傳性狀的改變，細胞和組織不會喪失形態(tài)發(fā)生的潛能。但是，凍傷是超低溫保護最大的負反應，其原因是冰晶所致的機械性損傷和滲透性損傷。目前細胞凍存主要是快速凍存法，即玻璃化法。但是如果沒有采取合適的凍存方法和合適的冷凍保護劑，細胞在凍存過程中容易被凍傷。改進凍存液和凍存方法是改進保存細胞的重要途徑，目前很多研究都是改進凍存液和凍存方法來保護細胞盡量免受凍存過程凍傷的情況。目前絕大多數(shù)凍存液中含有動物源性的血清成分，而動物源性血清存在傳染病毒的風險；因動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致，影響每批試驗或生產(chǎn)結果；血清成本很高，加重了生產(chǎn)成本。因此，不含血清的細胞凍存液是將來發(fā)展的趨勢，有些單位或機構研究無血清細胞凍存液。申請?zhí)朿n201610322202.7的專利公開了一種無血清細胞凍存液，用于解決凍存液使用不方便、成本高、細胞存活率低的問題。申請?zhí)朿n201610124499.6的專利公開了一種人脂肪干細胞無血清凍存液及其制備方法。現(xiàn)有無血清的凍存液長期冷凍后解凍，細胞復蘇率低，復蘇后細胞活性與性能下降，而且無法滿足不同細胞長期凍存的需要。目前大多數(shù)凍存液中含有動物源性的血清成分，而動物源性血清存在傳染病毒的風險；因動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致，影響每批試驗或生產(chǎn)結果；含血清后后期的產(chǎn)品安全檢驗成本會很高，加重了生產(chǎn)成本。盡管目前玻璃化凍存是比較理想的凍存方法，但是它在玻璃化過程還是會形成冰晶損傷細胞，而且復蘇后細胞活率低、細胞增殖數(shù)量不足、細胞易老化。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明實施例提供了一種細胞凍存方法及細胞凍存液，由于該細胞凍存液中不含血清，能夠提高細胞復蘇率，使細胞復蘇后活性與性能高、可滿足多種不同細胞長期凍存的需要。為達到上述目的，本發(fā)明實施例采用如下技術方案：本發(fā)明實施例提供一種細胞凍存方法，細胞凍存方法包括以下兩個步驟：步驟一、將混入細胞的細胞凍存液裝入容器1，再將容器1裝入容器2，其中，容器1和容器2之間形成真空；步驟二、對步驟一所得的容器2依此執(zhí)行以下a-d四個步驟：a、利用常溫風冷使容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降3-4℃；b、利用冰箱使容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1-2℃；c、利用冰箱使容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2-3℃；d、將容器2放入液氮罐中凍存，其中，液氮罐的溫度為-196℃。進一步地，步驟二具體包括：對步驟一所得的容器2依此執(zhí)行以下a-d四個步驟：a、利用常溫風冷使容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降4℃；b、利用冰箱使容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1℃；c、利用冰箱使容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2℃；d、將容器2放入液氮罐中凍存，其中，液氮罐的溫度為-196℃。進一步地，細胞為表皮干細胞、成纖維細胞、角膜細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞、口腔黏膜上皮細胞或者口腔牙齦細胞。進一步地，細胞為第2~7代的細胞。本發(fā)明實施例還提供一種細胞凍存液，細胞凍存液應用于如權利要求1-4中任意一項的細胞凍存方法，細胞凍存液包括：dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物；其中，dmso在細胞凍存液中的含量為2-10%的dmem/f12的體積；甘油在細胞凍存液中的含量為5-30%的dmem/f12的體積；血清替代物在細胞凍存液中的含量為20-60%的dmem/f12的體積；血清替代物包括羥乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人ab血清、表皮生長因子、重組人胰島素、孕酮、氫化可的松、腐胺、硒酸鈉和黃酮。進一步地，羥乙基淀粉的濃度為0.1-10%w/v，葡聚糖的濃度為0.1-10%w/v，人血白蛋白的濃度為0.1-15%w/v，重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為1-10%w/v，人ab血清的濃度為1-10%w/v，表皮生長因子的濃度為0.01-10%w/v，重組人胰島素的濃度為1-10%w/v，孕酮的濃度為0.01-5%w/v，氫化可的松的濃度為0.01-5%w/v，腐胺的濃度為0.01-5%w/v，硒酸鈉的濃度為0.1-5%w/v，黃酮的濃度為0.01-5%w/v。進一步地，甘油在細胞凍存液中的含量為10-25%的dmem/f12的體積。優(yōu)選的，甘油在細胞凍存液中的含量為15-20%的dmem/f12的體積。進一步地，血清替代物在細胞凍存液中的含量為30-55%的dmem/f12的體積。優(yōu)選的，血清替代物在細胞凍存液中的含量為35-50%的dmem/f12的體積。優(yōu)選的，dmso在細胞凍存液中的含量為5-7%的dmem/f12的體積。進一步地，dmem/f12是dmem培養(yǎng)液和f12培養(yǎng)液以體積比3:1的比例混合的。本發(fā)明實施例提供一種細胞凍存方法，細胞凍存方法包括以下兩個步驟：步驟一、將混入細胞的細胞凍存液裝入容器1，再將容器1裝入容器2，其中，容器1和容器2之間形成真空；步驟二、對步驟一所得的容器2依此執(zhí)行以下a-d四個步驟：a、利用常溫風冷使容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降3-4℃；b、利用冰箱使容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1-2℃；c、利用冰箱使容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2-3℃；d、將容器2放入液氮罐中凍存，其中，液氮罐的溫度為-196℃。基于上述實施例的描述，由于該細胞凍存液中不含血清，不存在動物性傳染病毒風險，適用范圍廣。通過本發(fā)明長期冷凍的細胞解凍后，細胞復蘇率高達90%以上，復蘇后細胞活性高、不易老化，可滿足多種不同細胞長期凍存的需要。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例提供的細胞凍存方法凍存6個月的細胞和采用現(xiàn)有方法凍存6個月的細胞的復蘇前后的細胞形態(tài)比較圖；圖2為本發(fā)明實施例提供的細胞凍存方法凍存6個月的細胞和采用現(xiàn)有方法凍存6個月的細胞的復蘇率比較圖；圖3為本發(fā)明實施例提供的細胞凍存液凍存6個月的細胞和采用現(xiàn)有液凍存6個月的細胞的復蘇前后的細胞形態(tài)比較圖；圖4為本發(fā)明實施例提供的細胞凍存液凍存6個月的細胞和采用現(xiàn)有液凍存6個月的細胞的復蘇率比較圖。具體實施方式下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行詳細地描述。實施例1本發(fā)明實施例提供一種細胞凍存方法，所述細胞凍存方法包括以下兩個步驟：步驟一、將混入細胞的細胞凍存液裝入容器1，再將所述容器1裝入容器2，其中，所述容器1和所述容器2之間形成真空；步驟二、對步驟一所得的所述容器2依此執(zhí)行以下a-d四個步驟：a、利用常溫風冷使所述容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降3-4℃；b、利用冰箱使所述容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1-2℃；c、利用冰箱使所述容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2-3℃；d、將所述容器2放入液氮罐中凍存，其中，所述液氮罐的溫度為-196℃。在一種可能的實現(xiàn)方式中，將表皮干細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞、口腔黏膜上皮細胞的原代細胞混入凍存液中，分別裝入1ml離心管后封口；凍存液由dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物組成，所述血清替代物由羥乙基淀、葡聚糖、人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人ab血清、表皮生長因子、重組人胰島素、孕酮、氫化可的松、腐胺、硒酸鈉、黃酮、地塞米松組成。接著將裝有原代細胞的1ml離心管裝入15ml離心管中封口密閉，用冷風以3℃的降溫速率冷至4℃；將4℃的15ml離心管放至冰箱180分鐘，以1℃降溫速率降至-20℃；然后將-20℃的15ml離心管迅速放至-80℃冰箱凍存8小時；最后直接移至液氮-196℃凍存。在另一種可能的實現(xiàn)方式中，將表皮干細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞、口腔黏膜上皮細胞的原代細胞混入凍存液中，分別裝入1ml離心管后封口；凍存液由dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物組成，所述血清替代物由羥乙基淀、葡聚糖、人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人ab血清、表皮生長因子、重組人胰島素、孕酮、氫化可的松、腐胺、硒酸鈉、黃酮、地塞米松組成。接著將裝有原代細胞的1ml離心管裝入15ml離心管中封口密閉，用冷風以4℃的降溫速率冷至4℃；將4℃的15ml離心管放至冰箱90分鐘，以2℃降溫速率降至-20℃；然后將-20℃的15ml離心管迅速放至-80℃冰箱凍存12小試；最后直接移至液氮-196℃凍存。需要說明的是，將通過本發(fā)明實施例提供的凍存方法凍存6個月的細胞，通過直接放置40℃水域中復蘇，觀察凍存前與復蘇后細胞的形態(tài)。與采用現(xiàn)有方法凍存6個月的細胞相比，從圖1可以看出，應用本發(fā)明的凍存方法，凍存前的細胞與凍存6個月后的細胞形態(tài)非常相近，幾乎沒有變化，說明本發(fā)明凍存方法能夠在凍存過程對細胞起到很好的保護作用。同時，將本發(fā)明實施例提供的凍存方法以及現(xiàn)有常規(guī)的凍存方法凍存6個月的細胞，直接放置42℃水域中復蘇3分鐘，觀察復蘇后細胞的復蘇率，具體實驗結果見圖2。通過圖2發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明凍存方法細胞復蘇率明顯優(yōu)于現(xiàn)有凍存方法。本發(fā)明實施例提供一種細胞凍存方法，細胞凍存方法包括以下兩個步驟：步驟一、將混入細胞的細胞凍存液裝入容器1，再將容器1裝入容器2，其中，容器1和容器2之間形成真空；步驟二、對步驟一所得的容器2依此執(zhí)行以下a-d四個步驟：a、利用常溫風冷使容器2的溫度從常溫下降至4℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降3-4℃；b、利用冰箱使容器2的溫度從4℃下降至-20℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降1-2℃；c、利用冰箱使容器2的溫度從-20℃下降至-80℃，其中，溫度下降的速度為每分鐘下降2-3℃；d、將容器2放入液氮罐中凍存，其中，液氮罐的溫度為-196℃?；谏鲜鰧嵤├拿枋?，由于該細胞凍存液中不含血清，不存在動物性傳染病毒風險，適用范圍廣。通過本發(fā)明長期冷凍的細胞解凍后，細胞復蘇率高達90%以上，復蘇后細胞活性高、不易老化，可滿足多種不同細胞長期凍存的需要。實施例2本發(fā)明實施例提供一種細胞凍存液，所述細胞凍存液應用于如實施例1中任意一項所述的細胞凍存方法，所述細胞凍存液包括：dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物；其中，所述dmso在所述細胞凍存液中的含量為2-10%的所述dmem/f12的體積；所述甘油在所述細胞凍存液中的含量為5-30%的所述dmem/f12的體積；所述血清替代物在所述細胞凍存液中的含量為20-60%的所述dmem/f12的體積；所述血清替代物包括羥乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人ab血清、表皮生長因子、重組人胰島素、孕酮、氫化可的松、腐胺、硒酸鈉和黃酮。進一步地，所述羥乙基淀粉的濃度為0.1-10%w/v，所述葡聚糖的濃度為0.1-10%w/v，所述人血白蛋白的濃度為0.1-15%w/v，所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為1-10%w/v，所述人ab血清的濃度為1-10%w/v，所述表皮生長因子的濃度為0.01-10%w/v，所述重組人胰島素的濃度為1-10%w/v，所述孕酮的濃度為0.01-5%w/v，所述氫化可的松的濃度為0.01-5%w/v，所述腐胺的濃度為0.01-5%w/v，所述硒酸鈉的濃度為0.1-5%w/v，所述黃酮的濃度為0.01-5%w/v。在一種可能的實現(xiàn)方式中，本發(fā)明實施例提供的細胞凍存液是按如下比例配置的：10%的dmem/f12體積的dmso、30％的dmem/f12體積的甘油、50%dmem/f12體積的血清替代物及體積比例10%的dmem/f12，其中血清替代物組成比例如下：10%（w/v）羥乙基淀粉、0.1%（w/v）葡聚糖、15%（w/v）人血白蛋白、5%（w/v）重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、10%（w/v）人ab血清、0.01%（w/v）表皮生長因子、10%（w/v）重組人胰島素、5%（w/v）孕酮、5%（w/v）氫化可的松、0.01%（w/v）腐胺、5%（w/v）硒酸鈉、0.01%（w/v）黃酮組成。將同等數(shù)量的表皮干細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞混入上述制備的凍存液后，液氮凍存6個月后，均在42℃水域中復蘇2分鐘，觀察凍存前后細胞的形態(tài)如圖3。從圖3可以看出，用本發(fā)明的凍存液，凍存前的細胞與凍存6個月后的細胞形態(tài)非常相近，幾乎沒有變化，說明本發(fā)明凍存液對細胞的凍存起到了很好地保護作用。在另一種可能的實現(xiàn)方式中，本發(fā)明實施例提供的細胞凍存液是按如下比例配置的：2%dmem/f12體積的dmso、30％的dmem/f12體積的甘油、20%dmem/f12體積的血清替代物以及體積比例48%的dmem/f12；其中血清替代物組成比例如下：0.1%（w/v）羥乙基淀粉、10%（w/v）葡聚糖、10%（w/v）人血白蛋白、1%（w/v）重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、10%（w/v）人ab血清、0.5%（w/v）表皮生長因子、10%（w/v）重組人胰島素、0.01%（w/v）孕酮、0.01%（w/v）氫化可的松、0.5%（w/v）腐胺、0.01%（w/v）硒酸鈉、5%（w/v）黃酮組成。將表皮干細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞、角膜細胞、口腔牙齦細胞混入上述制備的凍存液以及商用無血清凍存液后，液氮凍存6個月后，用相同常規(guī)復蘇方法40℃復蘇2分鐘，細胞復蘇率結果具體見圖4。需要補充的是，將表皮干細胞、成纖維細胞、脂肪干細胞、黑色素細胞混入上述制備的凍存液以及商用無血清凍存液后，液氮凍存6個月后，用相同復蘇方法復蘇后，進行傳代培養(yǎng)，觀察細胞開始老化代次，具體結果見表1。表1本發(fā)明商業(yè)化無血清凍存液表皮干細胞p15p9成纖維細胞p21p10脂肪干細胞p15p12黑色素細胞p18p9口腔黏膜模型p24p20通過表1，可以看出，本發(fā)明提供的凍存液凍存的細胞在復蘇后開始老化代次明顯要大于商業(yè)化無血清凍存液，說明本發(fā)明提供的凍存液凍存后的細胞的活性或性能優(yōu)于商業(yè)化無血清凍存液。還需要補充的是，將現(xiàn)有常規(guī)凍存與本發(fā)明實施例提供的凍存6個月后細胞采用本發(fā)明實施例提到的復蘇方法復蘇，然后用商業(yè)化無血清dmem/f-12連續(xù)傳代培養(yǎng)，每天更液，觀察細胞開始老化的天數(shù)，具體實驗結果見表。表2本發(fā)明現(xiàn)有凍存方法表皮干細胞第10天第6天成纖維細胞第12天第7天脂肪干細胞第18天第10天黑色素細胞第14天第9天口腔黏膜模型第24天第21天通過表2，可以看出，本發(fā)明提供的凍存方法凍存的細胞在復蘇后開始老化的天數(shù)明顯要晚于現(xiàn)有凍存方法，即說明本發(fā)明提供的凍存方法凍存后的細胞的活性或性能優(yōu)于現(xiàn)有凍存方法的細胞。以上所述，僅為本申請的具體實施方式，但本申請的保護范圍并不局限于此，任何在本申請揭露的技術范圍內(nèi)的變化或替換，都應涵蓋在本申請的保護范圍之內(nèi)。因此，本申請的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。當前第1頁12