本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種免疫細(xì)胞凍存液及免疫細(xì)胞凍存方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療的弊端，已經(jīng)被公認(rèn)為二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有發(fā)展前途的一種治療手段,也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的治療手段。免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。免疫細(xì)胞可以分為多種，在人體中各種免疫細(xì)胞擔(dān)任著重要的角色。從血液中分離出來的單個核細(xì)胞包括：t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞和dc細(xì)胞等，是免疫細(xì)胞治療中的初始細(xì)胞來源，經(jīng)各類細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)，得到一群具有高效殺傷活性的免疫細(xì)胞群。常見的免疫細(xì)胞治療種類包括nk細(xì)胞、cik細(xì)胞、dc-cik細(xì)胞、til細(xì)胞、lak細(xì)胞、cart細(xì)胞等。所有這些經(jīng)誘導(dǎo)和擴增培養(yǎng)的免疫細(xì)胞的初始細(xì)胞來源都是外周血或臍血的單個核細(xì)胞，而且是直接分離培養(yǎng)。隨著年齡的增長，免疫細(xì)胞在體內(nèi)的活性也會隨之降低，所以在年輕時期凍存具有較高活性的免疫細(xì)胞，對于未來罹患腫瘤相關(guān)疾病的治療可以起到很好的保障，因此免疫細(xì)胞凍存及凍存后的復(fù)蘇培養(yǎng)具有非常大的意義。除此之外，隨著免疫細(xì)胞治療項目的逐步推廣，免疫細(xì)胞的遠(yuǎn)程運輸，長期保存問題就凸顯出來，也是細(xì)胞制備區(qū)域化進程中必須解決的問題。目前，細(xì)胞凍存主要是采取-196℃超低溫條件下的保存方案，在超低溫條件下，細(xì)胞的代謝功能停滯，但并未死亡。而細(xì)胞復(fù)蘇則主要采用凍存細(xì)胞在37℃快速解凍的方法，以恢復(fù)細(xì)胞的活性和功能。但是現(xiàn)有的免疫細(xì)胞凍存方法適用于凍存干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，對于免疫細(xì)胞，在凍存過程中則易形成冰晶損傷細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞活率低、細(xì)胞增殖數(shù)量不足、細(xì)胞易老化，存在效率低下，凍存質(zhì)量不高、細(xì)胞復(fù)蘇后活性差以及成活率不高等問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞凍存液，該免疫細(xì)胞凍存液能有效保護免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，微生物檢測指標(biāo)符合要求，延長了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞凍存方法，該免疫細(xì)胞凍存方法可以有效解決免疫細(xì)胞無法存儲、長時間運輸?shù)膯栴}，實現(xiàn)了免疫細(xì)胞的本地采集、異地制備以及即時復(fù)蘇的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜4-8ml右旋糖酐2-6ml細(xì)胞培養(yǎng)基10-30ml人血清白蛋白1-5ml人自體血漿60-100ml。所述二甲基亞砜為sigma型號為472301的二甲基亞砜。二甲基亞砜能提高細(xì)胞膜對水的通透性，降低溶液的冰點，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。右旋糖酐可以維持滲透壓和ph值，提供適宜細(xì)胞存活的介質(zhì)環(huán)境。本發(fā)明采用在免疫細(xì)胞凍存液中添加人血白蛋白作為細(xì)胞凍存穩(wěn)定劑使用，有利于在冷凍復(fù)蘇過程中調(diào)節(jié)滲透壓，對細(xì)胞保護作用好，并且凍存液成本低，可進一步提高凍存細(xì)胞的存儲穩(wěn)定性，避免由于細(xì)胞存儲供者血質(zhì)問題導(dǎo)致過程儲存活性不穩(wěn)定或細(xì)胞復(fù)蘇率下降。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用上述原料，并嚴(yán)格控制各原料的重量配比，制得的免疫細(xì)胞凍存液能有效保護免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，微生物檢測指標(biāo)符合要求，延長了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)基為x-vivo15培養(yǎng)基、aim-v培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基、rpmi-1640培養(yǎng)基、gt-t551培養(yǎng)基、gt-t561培養(yǎng)基和stemspan培養(yǎng)基中的任意一種。所述細(xì)胞培養(yǎng)基的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的細(xì)胞培養(yǎng)基即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為x-vivo15培養(yǎng)基、aim-v培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基或rpmi-1640培養(yǎng)基。aim-v培養(yǎng)基購于美國invitrogen公司，其中主要含有l(wèi)-谷氨酰胺、硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素等，用以保持免疫細(xì)胞活性，使得免疫細(xì)胞復(fù)蘇后能夠維持其細(xì)胞活性，并延長免疫細(xì)胞存活期。細(xì)胞培養(yǎng)基具有保持細(xì)胞滲透壓、酸堿平衡體系和提供營養(yǎng)等作用。優(yōu)選的，所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1500-2000rpm轉(zhuǎn)速下離心4-8min，取上層血漿在56-60℃溫度下滅活28-32min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2500-3500rpm轉(zhuǎn)速下離心15-25min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。人自體血漿為營養(yǎng)保護劑，其中包括血清蛋白、葡萄糖、無機鹽離子、胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素，類固醇激素等，不僅能夠為免疫細(xì)胞提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而且血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細(xì)胞免受機械損傷。本發(fā)明的細(xì)胞凍存液添加人自體血漿，人自體血漿與血清成分相似，亦含有免疫細(xì)胞生長所需的各種細(xì)胞因子及營養(yǎng)物質(zhì)，且屬于免疫細(xì)胞分離的副產(chǎn)物，方便獲取，不存在異源性，避免了外源血清存在的安全隱患。本發(fā)明中所述免疫細(xì)胞凍存液中含有的重組人白介素-2和人自體血漿具有顯著的協(xié)同作用，可以顯著提高免疫細(xì)胞的活性和復(fù)蘇后的存活率。本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中采用人自體血漿作為血清替代物，不含有動物血清，因此不會引入外源蛋白，降低了動物病原污染的可能性，也不會對人體過繼免疫治療產(chǎn)生影響。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類1-3g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8-1.2：1.5-2.5：2-4組成的混合物。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用海藻糖，可以減少二甲基亞砜的使用，保證細(xì)胞在接近冰點時胞內(nèi)的水分不會結(jié)晶，能有效的保護細(xì)胞，并有效降低細(xì)胞毒性。本發(fā)明添加α-1,4-葡聚糖能夠有效的降低凍存、復(fù)蘇中細(xì)胞的損傷，并能夠保證復(fù)蘇后細(xì)胞增殖的活力。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用香菇多糖和葡萄糖，可以保證復(fù)蘇后細(xì)胞增殖活力不受影響。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.2-0.6g和維生素c0.1-0.5g。所述非必須氨基酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非必須氨基酸即可，并無特殊的限制，本發(fā)明優(yōu)選為多種非必需氨基酸組合而成，更優(yōu)選為購買自gibco試劑的非必須氨基酸。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用非必須氨基酸和維生素c，可以保證復(fù)蘇后細(xì)胞增殖活力不受影響。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.2-0.6ml和聚乙二醇0.4-0.8ml。本發(fā)明在免疫細(xì)胞凍存液中添加聚乙二醇和1,2-丙二醇，可以替代現(xiàn)用的二甲基亞砜為基礎(chǔ)的凍存液，減少二甲基亞砜的用量，有效降低其對細(xì)胞毒性，維持細(xì)胞穩(wěn)定性，提高復(fù)蘇后直接應(yīng)用的安全性，適合用于細(xì)胞凍存復(fù)蘇后直接應(yīng)用。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素4000-8000u。所述重組人白介素可以采用注射用重組人白介素-2。通常，外周血的t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞膜表面均存在白介素-2(il-2)受體，il-2與其受體結(jié)合后可以調(diào)節(jié)該細(xì)胞的增生，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的生成；促進t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞的增殖、分化并能提高nk細(xì)胞的殺傷活性。然而，目前主要是將il-2作為體外刺激培養(yǎng)物用于免疫細(xì)胞的擴增培養(yǎng)，而本發(fā)明采用將重組人白介素-2(il-2)添加到免疫細(xì)胞凍存液中，可大幅度提高所述免疫細(xì)胞的活性穩(wěn)定性，使其保持原有細(xì)胞高活性，從而使免疫細(xì)胞很好地保持了細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，可有效解決細(xì)胞復(fù)蘇后直接應(yīng)用和進一步擴展的關(guān)鍵問題。本發(fā)明添加重組人白介素-2能夠有效維持細(xì)胞的活性，保證細(xì)胞復(fù)蘇后正常的生物學(xué)功能。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.3-0.7g和勃脈力a0.8-1.2g。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用白酒草皂苷r與二甲基亞砜結(jié)合制備免疫細(xì)胞的凍存液，可以降低二甲基亞砜的使用量，這種凍存液對凍存細(xì)胞有較好的保護作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用勃脈力a，可以維持電解質(zhì)平衡，使細(xì)胞處于一種比較溫和的更接近于體內(nèi)環(huán)境的溶液中。優(yōu)選的，所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.1-0.5ml和氯化鈉0.4-0.8g。所述青霉素和鏈霉素雙抗溶液為gibco青霉素和鏈霉素雙抗溶液gibco青霉素和鏈霉素雙抗溶液每毫升包含10000單位青霉素（堿）和10000μg鏈霉素（堿），利用0.85%鹽液形式的青霉素g（鈉鹽）和硫酸鏈霉素，其抗菌譜包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。青霉素和鏈霉素雙抗溶液可保證細(xì)胞儲存過程中處于無菌狀態(tài)，且對免疫細(xì)胞無不良影響，安全可靠。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液通過采用氯化鈉，可以維持電解質(zhì)平衡，使細(xì)胞處于一種比較溫和的更接近于體內(nèi)環(huán)境的溶液中。一種免疫細(xì)胞凍存方法，將免疫細(xì)胞加入到上述所述的免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序降溫至-78～-82℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。所述免疫細(xì)胞凍存液預(yù)先于2-8℃預(yù)冷，以降低二甲基亞砜溶于免疫細(xì)胞凍存液時升溫對細(xì)胞的損傷。所述免疫細(xì)胞的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意一種免疫細(xì)胞即可，并無特殊的限制。本發(fā)明中所述免疫細(xì)胞優(yōu)選為nk細(xì)胞、cik細(xì)胞或dc細(xì)胞。還可以為t細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或ntk細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液能有效保護免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，微生物檢測指標(biāo)符合要求，延長了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存液中采用人自體血漿作為血清替代物，不含有動物血清，因此不會引入外源蛋白，降低了動物病原污染的可能性，也不會對人體過繼免疫治療產(chǎn)生影響。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存復(fù)蘇后經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的存活率在96%以上，細(xì)胞保持無菌狀態(tài)，各項生物學(xué)指標(biāo)均滿足需求，與未凍存的單個核細(xì)胞誘導(dǎo)成免疫細(xì)胞培養(yǎng)增殖狀態(tài)相比無明顯差異，儲存效果良好，可應(yīng)用于臨床治療。本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存方法可以有效解決免疫細(xì)胞無法存儲、長時間運輸?shù)膯栴}，實現(xiàn)了免疫細(xì)胞的本地采集、異地制備以及即時復(fù)蘇的應(yīng)用。具體實施方式為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，實施方式提及的內(nèi)容并非對本發(fā)明的限定。實施例1一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜4ml右旋糖酐2ml細(xì)胞培養(yǎng)基10ml人血清白蛋白1ml人自體血漿60ml。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為x-vivo15培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1500rpm轉(zhuǎn)速下離心8min，取上層血漿在56℃溫度下滅活32min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2500rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類1g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.8：1.5：2組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.2g和維生素c0.1g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.2ml和聚乙二醇0.4ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素4000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.3g和勃脈力a0.8g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.1ml和氯化鈉0.4g。一種免疫細(xì)胞凍存方法，將免疫細(xì)胞加入到上述所述的免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序降溫至-78℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。實施例2一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜5ml右旋糖酐3ml細(xì)胞培養(yǎng)基15ml人血清白蛋白2ml人自體血漿70ml。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為aim-v培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1600rpm轉(zhuǎn)速下離心7min，取上層血漿在57℃溫度下滅活31min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2800rpm轉(zhuǎn)速下離心22min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類1.5g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:0.9：1.8：2.5組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.3g和維生素c0.2g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.2-0.6ml和聚乙二醇0.4-0.8ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素5000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.4g和勃脈力a0.9g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.2ml和氯化鈉0.5g。一種免疫細(xì)胞凍存方法，將免疫細(xì)胞加入到上述所述的免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序降溫至-79℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。實施例3一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜6ml右旋糖酐4ml細(xì)胞培養(yǎng)基20ml人血清白蛋白3ml人自體血漿80ml。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1800rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，取上層血漿在58℃溫度下滅活30min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3000rpm轉(zhuǎn)速下離心20min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類2g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1：2：3組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.4g和維生素c0.3g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.4ml和聚乙二醇0.6ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素6000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.5g和勃脈力a1g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.3ml和氯化鈉0.6g。一種免疫細(xì)胞凍存方法，將免疫細(xì)胞加入到上述所述的免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序降溫至-80℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。實施例4一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜7ml右旋糖酐5ml細(xì)胞培養(yǎng)基25ml人血清白蛋白4ml人自體血漿90ml。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為rpmi-1640培養(yǎng)基、gt-t551培養(yǎng)基或gt-t561培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，1900rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上層血漿在59℃溫度下滅活29min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3200rpm轉(zhuǎn)速下離心18min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類2.5g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.1：2.2：3.5組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.4g和維生素c0.3g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.4ml和聚乙二醇0.6ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素6000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.3-0.7g和勃脈力a0.8-1.2g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.3ml和氯化鈉0.6g。一種免疫細(xì)胞凍存方法，將免疫細(xì)胞加入到上述所述的免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序降溫至-81℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。實施例5一種免疫細(xì)胞凍存液，所述免疫細(xì)胞凍存液包括如下組分：二甲基亞砜8ml右旋糖酐6ml細(xì)胞培養(yǎng)基30ml人血清白蛋白5ml人自體血漿100ml。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為stemspan培養(yǎng)基。所述人自體血漿的制備方法為：將人體外周血置于無菌離心管中，2000rpm轉(zhuǎn)速下離心4min，取上層血漿在60℃溫度下滅活28min后，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，3500rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取上清，即為凍存用人自體血漿。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括糖類3g，所述糖類是由海藻糖、α-1,4-葡聚糖、香菇多糖和葡萄糖以重量比1:1.2：2.5：4組成的混合物。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括非必須氨基酸0.6g和維生素c0.5g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括丙二醇0.6ml和聚乙二醇0.8ml。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括重組人白介素8000u。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括白酒草皂苷r0.7g和勃脈力a1.2g。所述免疫細(xì)胞凍存液還包括青霉素-鏈霉素雙抗溶液0.5ml和氯化鈉0.8g。一種免疫細(xì)胞凍存方法，將免疫細(xì)胞加入到上述所述的免疫細(xì)胞凍存液中混合均勻，得到細(xì)胞重懸液，將細(xì)胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序降溫至-82℃后轉(zhuǎn)至-196℃液氮罐凍存。將實施例1-5的免疫細(xì)胞凍存液和免疫細(xì)胞凍存方法對免疫細(xì)胞進行凍存，經(jīng)1個月、3個月、6個月、12個月凍存后依次取出復(fù)蘇，檢測免疫細(xì)胞存活率，實驗結(jié)果如下表所示：細(xì)胞存活率實施例1實施例2實施例3實施例4實施例51個月（%）97.1897.2197.3297.2697.223個月（%）96.8596.9297.0596.9496.886個月（%）96.4296.4896.5396.5196.4512個月（%）96.0196.0496.1296.0896.06從上表可以看出，本發(fā)明的免疫細(xì)胞凍存液能有效保護免疫細(xì)胞免受冷凍損傷，安全性高，對細(xì)胞的損傷小，可以提高免疫細(xì)胞的復(fù)蘇成活率，復(fù)蘇后的成活率可以達到96%以上，且復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖數(shù)量大、細(xì)胞不易老化，并保證了免疫細(xì)胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)特性，且復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞均沒有可見異物、細(xì)菌、真菌、細(xì)菌內(nèi)毒素、支原體的污染，微生物檢測指標(biāo)符合要求，延長了免疫細(xì)胞的存活期，減少了免疫細(xì)胞表面抗原的丟失。上述實施例為本發(fā)明較佳的實現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12