本發(fā)明屬于放流標(biāo)志技術(shù)領(lǐng)域，涉及牙鲆魚的標(biāo)記方法,具體說(shuō)是一種牙鲆魚耳石元素標(biāo)記方法。

背景技術(shù)：

牙鲆是亞洲沿岸分布的唯一鲆科牙鲆魚，因其個(gè)體大，生長(zhǎng)速度快，味道鮮美，是東亞各國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)牙鲆魚。其回游距離短，是東亞各國(guó)增殖放流海水牙鲆魚主要品種之一。我國(guó)牙鲆增殖放流主要在山東、河北、遼寧和天津等省市，其中2016年僅遼寧省牙公開(kāi)招標(biāo)放流牙鲆數(shù)量為813萬(wàn)尾。近20年來(lái)，我國(guó)在牙鲆的繁育生物學(xué)、苗種培育及增殖放流等方面做了大量研究和工作，積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，但就增殖放流而言，其效果評(píng)估技術(shù)至今尚未成熟。其中主要原因之一是漁獲物中放流牙鲆多少、規(guī)格等信息獲取困難。對(duì)放流魚進(jìn)行標(biāo)記可為漁獲物中區(qū)分放流

牙鲆提供有力依據(jù)。

耳石是牙鲆魚內(nèi)耳自然生物礦化沉積形成的碳酸鈣結(jié)構(gòu)，是牙鲆魚形成最早的硬組織,其微細(xì)結(jié)構(gòu)可以用來(lái)判讀牙鲆魚的年齡等生物學(xué)信息，而沉積其中的元素信息則記錄了牙鲆魚過(guò)去生活過(guò)的環(huán)境信息。水環(huán)境中的化學(xué)元素通過(guò)牙鲆魚鰓部等組織進(jìn)入血液，血液傳輸?shù)壬磉^(guò)程沉積在耳石生長(zhǎng)輪上，形成元素環(huán)帶，即元素指紋（elementalfingerprints）。牙鲆魚生存在不同元素組成的水環(huán)境，其耳石元素組成不同，即元素指紋不同。耳石元素指紋標(biāo)記可對(duì)放流苗種全標(biāo)記，且一旦標(biāo)記不受外界影響，可以永久保存。耳石元素指紋標(biāo)記成本低，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便易操作，對(duì)放流苗種損傷小。因此，耳石元素指紋標(biāo)記已成為我國(guó)牙鲆魚放流標(biāo)記技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。

中國(guó)專利（專利號(hào)：zl201110172710.9）所公開(kāi)的標(biāo)記方法是：將茜素絡(luò)合物、魚用配合飼料混合，制成標(biāo)記飼料，然后喂養(yǎng)待標(biāo)記魚，從而可在標(biāo)記魚耳石上檢測(cè)到可識(shí)別的熒光標(biāo)記。它避免了其它標(biāo)記方法對(duì)魚體傷害較大，標(biāo)記遺失率高，標(biāo)記價(jià)格昂貴，保持率低，標(biāo)記數(shù)量有限等缺點(diǎn)。但上述技術(shù)中標(biāo)記方法存在的缺陷是，濃度較高時(shí)標(biāo)志魚存活率受到嚴(yán)重影響，最高會(huì)使標(biāo)志魚全部死亡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提供一種牙鲆魚耳石元素標(biāo)記方法，避免采用的標(biāo)記材料在濃度較高時(shí)導(dǎo)致死率高的問(wèn)題。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種牙鲆魚耳石元素標(biāo)記方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將六水氯化鍶與魚飼料混合均勻，使魚飼料中含有鍶元素，得到標(biāo)記飼料；

（2）使用所述標(biāo)記飼料投喂待標(biāo)記的牙鲆魚；

（3）每天投喂標(biāo)記飼料1-2次，投喂時(shí)間至少為3天；

（4）六水氯化鍶含量至少占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的0.8%。

對(duì)上述技術(shù)方案的改進(jìn)：所述步驟（4）中，所述六水氯化鍶含量占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的1%-10%。

對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（3）中，每天投喂標(biāo)記飼料2次，投喂時(shí)間為4-10天。

對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（1）中，所述魚飼料為顆粒飼料，以生物藻膠為粘合劑，1kg顆粒飼料使用10-15g生物藻膠，將至少8g六水氯化鍶及10-15g生物藻膠溶于100ml純水，混合均勻后倒入噴壺，均勻噴灑在1kg顆粒飼料上，室溫24h晾干。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

本發(fā)明采用投喂標(biāo)記飼料法，鍶元素能夠通過(guò)血液傳輸?shù)壬磉^(guò)程沉積在耳石生長(zhǎng)輪上，形成元素環(huán)帶，產(chǎn)生放流牙鲆耳石元素指紋標(biāo)記作用。耳石鍶元素指紋標(biāo)記穩(wěn)定性好，不受外界影響，可以永久保存。六水氯化鍶對(duì)待標(biāo)記魚無(wú)害，高低濃度致死率均很低。

附圖說(shuō)明

圖1是不同梯度組恢復(fù)30天牙鲆耳石定量線分析圖；

圖2是不同梯度組牙鲆耳石恢復(fù)30天鍶沉積狀況面分布圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述：

本發(fā)明一種牙鲆魚耳石元素標(biāo)記方法的具體實(shí)施方式，包括如下步驟：

（1）將六水氯化鍶與魚飼料混合均勻，使魚飼料中含有鍶元素，得到標(biāo)記飼料；

（2）使用所述標(biāo)記飼料投喂待標(biāo)記的牙鲆魚；

（3）每天投喂標(biāo)記飼料1-2次，投喂時(shí)間至少為3天；

（4）六水氯化鍶含量至少占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的0.8%。

優(yōu)選的，所述步驟（3）中，每天投喂標(biāo)記飼料2次，投喂時(shí)間為4-10天;所述步驟（4）中，所述六水氯化鍶含量占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的1%-10%。

以下為本發(fā)明的3個(gè)具體實(shí)施例：

實(shí)施例1：

（1）制作標(biāo)記飼料：魚飼料選用顆粒飼料，以生物藻膠為粘合劑，1kg顆粒飼料使用10-15g生物藻膠。將8g六水氯化鍶及10-15g生物藻膠溶于100ml純水，混合均勻后倒入噴壺，均勻噴灑在1kg顆粒飼料上，室溫24h晾干。實(shí)驗(yàn)用顆粒飼料為東丸飼料，規(guī)格為c0-c3；

（2）使用標(biāo)記飼料投喂待標(biāo)記的牙鲆魚，且保證無(wú)殘餌；

（3）每天上午8點(diǎn)和下午2點(diǎn)各投喂1次標(biāo)記飼料(或只在每天早上6點(diǎn)投喂1次標(biāo)記飼料)，單次投喂量按魚體總重的2%-3%投喂，投喂時(shí)間為10天；實(shí)驗(yàn)牙鲆魚初始平均體重2.64g，恢復(fù)30天平均體重10.89g；

（4）六水氯化鍶含量占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的0.8%；

（5）使用生物藻膠作為粘合劑防止氯化鍶擴(kuò)散至養(yǎng)殖水體，每天上午投喂結(jié)束放水清槽后，加水并保持24h流水，流速為30分鐘一個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例2：

（1）制作標(biāo)記飼料：魚飼料選用顆粒飼料，以生物藻膠為粘合劑，1kg顆粒飼料使用10-15g生物藻膠。將32g六水氯化鍶及10-15g生物藻膠溶于100ml純水，混合均勻后倒入噴壺，均勻噴灑在1kg顆粒飼料上，室溫24h晾干。實(shí)驗(yàn)用顆粒飼料為東丸飼料，規(guī)格為c0-c3；

（2）使用標(biāo)記飼料投喂待標(biāo)記的牙鲆魚，且保證無(wú)殘餌；

（3）每天每天上午8點(diǎn)和下午2點(diǎn)各投喂1次標(biāo)記飼料。單次投喂量按魚體總重2%-3%投喂，投喂時(shí)間為3天；實(shí)驗(yàn)牙鲆魚初始平均體重2.51g，恢復(fù)30天平均體重10.01g；

（4）六水氯化鍶含量占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的3.2%；

（5）使用生物藻膠作為粘合劑防止氯化鍶擴(kuò)散至養(yǎng)殖水體，每天上午投喂結(jié)束放水清槽后，加水并保持24h流水，流速為30分鐘一個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例3：

（1）制作標(biāo)記飼料：魚飼料選用顆粒飼料，以生物藻膠為粘合劑，1kg顆粒飼料使用10-15g生物藻膠。將64g六水氯化鍶及10-15g生物藻膠溶于100ml純水，混合均勻后倒入噴壺，均勻噴灑在1kg顆粒飼料上，室溫24h晾干。實(shí)驗(yàn)用顆粒飼料為東丸飼料，規(guī)格為c0-c3；

（2）使用標(biāo)記飼料投喂待標(biāo)記的牙鲆魚，且保證無(wú)殘餌；

（3）每天每天上午8點(diǎn)和下午2點(diǎn)各投喂1次標(biāo)記飼料。單次投喂量按魚體總重的2%-3%投喂，投喂時(shí)間為10天。實(shí)驗(yàn)牙鲆魚初始平均體重2.58g，恢復(fù)30天平均體重10.02g；

（4）六水氯化鍶含量占標(biāo)記飼料總質(zhì)量的6.4%；

（5）使用生物藻膠作為粘合劑防止氯化鍶擴(kuò)散至養(yǎng)殖水體，每天上午投喂結(jié)束放水清槽后，加水并保持24h流水，流速為30分鐘一個(gè)循環(huán)。

為了進(jìn)一步證明本發(fā)明的效果，本申請(qǐng)人做了如下實(shí)驗(yàn)：

一、材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)魚為2016年4月4日產(chǎn)魚卵培育所得,本實(shí)驗(yàn)于2016年6月24日在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站開(kāi)始進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖在300l玻璃鋼圓形水槽內(nèi)，每天上午8點(diǎn)和下午2點(diǎn)各投喂1次，實(shí)驗(yàn)設(shè)0、1、8、64g/kg等4個(gè)鍶標(biāo)記飼料梯度（六水氯化鍶g/顆粒飼料kg），持續(xù)標(biāo)記10天。各梯度組實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格一致，數(shù)量均為400尾。標(biāo)記期間，各梯度投喂量相同，且保證各梯度均為殘餌；上午投喂結(jié)束放水清槽后，加水并保持24h流水。標(biāo)記期間記錄各梯度實(shí)驗(yàn)魚死亡率，標(biāo)記后30d測(cè)量記錄實(shí)驗(yàn)魚生長(zhǎng)性狀并采集樣本，-20℃保存。各梯度組各選取2個(gè)樣本進(jìn)行耳石微化學(xué)分析。

2、耳石采集及前處理

從采集的樣本中選取大小相對(duì)一致實(shí)驗(yàn)魚采集耳石，不同恢復(fù)時(shí)間各梯度組取實(shí)驗(yàn)魚2尾。利用剪刀、尖頭鑷等工具將矢耳石取出后，在清水中清洗，用解剖針或細(xì)竹簽剔除耳石表面附著的有機(jī)質(zhì)后，再用酒精清洗，并在解剖鏡下觀察清洗效果。清洗干凈后放入48孔盒，38℃烘干備用。為增加可比性，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用左矢耳石進(jìn)行元素指紋分析。

將耳石標(biāo)本放在包埋盒底座上，用細(xì)竹簽在底座上方點(diǎn)一小滴ab膠，將備好的耳石放在ab膠上，輕輕按壓耳石使耳石平穩(wěn)固定在底座上。固定好的耳石標(biāo)本室溫靜置20分鐘后，用環(huán)氧樹脂（epofix，struers公司；rensin與hardener質(zhì)量比7:1）包埋。包埋后放入烘箱，38℃烘干12小時(shí)以上。將凝固好的包埋塊放在載玻片的ab上，用食指用力按壓包埋塊，將ab膠內(nèi)氣泡擠出，固定2小時(shí)后使用金剛石磨輪的碾磨機(jī)（discoplan-ts型，struers公司）切割碾磨。切割后標(biāo)本經(jīng)初（500目砂輪）、精磨（1200目砂紙）打磨至耳石核心暴露，用磨拋機(jī)（rotopol-35，丹麥struers公司）裝備織布機(jī)拋光盤配合拋光液拋光，至耳石表面無(wú)明顯劃痕。樣品放入millo-q水中超聲清洗5分鐘后，自然條件下晾干24小時(shí)，完全干燥后，使用真空鍍膜機(jī)（jee-420，日本電子株式會(huì)社）蒸鍍碳膜（36a，25s）。

3、耳石元素指紋分析方法

使用日本電子株式會(huì)社的jxa-8100型電子探針微區(qū)分析儀（epma）進(jìn)行耳石sr和ca的微化學(xué)分析。自耳石核心沿最長(zhǎng)徑至耳石邊緣的一條直線進(jìn)行定量線分析（linetransectanalysis）。epma的參數(shù)設(shè)定：加速電壓為15kv，電子束電流為2.0×10-8a；束斑直徑為2μm，每點(diǎn)駐留時(shí)間15s；以間距4μm連續(xù)進(jìn)行打點(diǎn)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)樣品使用碳酸鈣（caco3）和鈦酸鍶（srtio3）。所有耳石線分析完后再進(jìn)行面分析（mappinganalysis）。這時(shí)，epma加速電壓和電子束電流分別為15kv，5.0×10-7a，束斑直徑為2μm，每點(diǎn)駐留時(shí)間為30ms，像素為4×4μm。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、不同梯度組牙鲆耳石定量線分析的sr/ca比值

圖1所示為不同梯度組恢復(fù)30d牙鲆耳石定量線分析對(duì)比，結(jié)果顯示：0g/kg、1g/kg梯度組均保持相對(duì)穩(wěn)定的sr/ca值，未出現(xiàn)sr/ca值高峰，說(shuō)明1g/kg梯度組未形成明顯的鍶元素指紋標(biāo)記。8g/kg和64g/kg梯度組分別形成1-2個(gè)sr/ca值波峰，說(shuō)明8g/kg和64g/kg梯度組均形成了明顯的鍶元素指紋標(biāo)記。

圖1、圖2中，bdhfe-1為對(duì)照組1，bdhfe-2為對(duì)照組2，bdhfe-3為1g/kg-1組，bdhfe-4為1g/kg-2組，bdhfe-5為8g/kg-1組，bdhfe-6為8g/kg-2組，bdhfe-7為64g/kg-1組，bdhfe-8為64g/kg-2。

進(jìn)一步分析得知，bdhfe-5在距離耳石核心的780-904μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高波峰峰值為10.18；bdhfe-6在距離耳石核心的780-956μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高波峰峰值為10.73；bdhfe-7在距離耳石核心的640-724μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高波峰峰值為62.60；bdhfe-8在距離耳石核心的560-684μm處耳石區(qū)段形成波峰，最高波峰峰值為143.64。8g/kg梯度組鍶峰值為正常均值倍數(shù)為2.14-2.22，64g/kg梯度組鍶峰值為正常均值倍數(shù)上升至6.60-18.27，表明隨濃度的增加，鍶元素在耳石上的沉積明顯增強(qiáng)；也說(shuō)明牙鲆幼魚連續(xù)10d投喂8g/kg及以上氯化鍶含量的標(biāo)記飼料，鍶在耳石上的沉積出現(xiàn)顯著變化，即8g/kg及以上氯化鍶含量的標(biāo)記飼料可對(duì)牙鲆幼魚耳石進(jìn)行鍶元素指紋標(biāo)記。

2、不同梯度組牙鲆耳石上鍶元素的面分布

對(duì)標(biāo)記后恢復(fù)30d的0、1、8、64g/kg梯度組鍶元素在耳石上沉積的面分布進(jìn)行上機(jī)分析，結(jié)果如圖2所示。0、1g/kg梯度組耳石上未出現(xiàn)“高鍶環(huán)帶”。bdhfe-5～bdhfe8均出現(xiàn)了紅色“高鍶環(huán)帶”，與耳石本底顏色對(duì)比明顯。即8g/kg和64g/kg梯度組可對(duì)牙鲆幼魚耳石進(jìn)行明顯鍶元素指紋標(biāo)記。但64g/kg梯度組“高鍶環(huán)帶”較8g/kg梯度組的寬，且64g/kg梯度組“高鍶環(huán)帶”外延至耳石邊緣顏色較8g/kg梯度組黃，鍶含量較8g/kg梯度組高。

三、結(jié)論：

外源鍶可對(duì)牙鲆耳石進(jìn)行元素指紋標(biāo)記。不同劑量六水氯化鍶對(duì)牙鲆幼魚耳石元素指紋標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，獲得8g/kg及以上劑量六水氯化鍶即可對(duì)牙鲆幼魚耳石進(jìn)行元素指紋標(biāo)記。

研究結(jié)果表明牙鲆魚對(duì)鍶的敏感性較小，恢復(fù)30d，1g/kg、8g/kg梯度組全長(zhǎng)差異不顯著，0g/kg、64g/kg梯度組全長(zhǎng)差異不顯著，1g/kg、8g/kg梯度組與0g/kg、64g/kg梯度組全長(zhǎng)差異顯著。（p<0.05）標(biāo)記期間，各梯度組均未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)魚死亡。鍶對(duì)牙鲆魚生長(zhǎng)和死亡沒(méi)有負(fù)面影響。

外源鍶可對(duì)較小規(guī)格牙鲆規(guī)?；瘶?biāo)記，標(biāo)記暴露時(shí)間短，成本低廉，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、易操作，標(biāo)記效果清晰穩(wěn)定，能夠區(qū)分放流群體和自然群體，很好滿足了魚類放流標(biāo)志要求。

當(dāng)然，上述說(shuō)明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)所作出的變化、改型、添加或替換，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。