本發(fā)明屬于植物種植領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法。

背景技術(shù)：

在農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化和集約化生產(chǎn)的今天，工業(yè)污染和城市垃圾大量向農(nóng)業(yè)環(huán)境轉(zhuǎn)移，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長(zhǎng)期大量不合理使用新型農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)，畜禽排泄物中獸用藥物殘留等的增加，使農(nóng)業(yè)環(huán)境正面臨著一系列嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞的問(wèn)題，土壤污染逐年加劇，其中重金屬cd對(duì)土壤的污染是目前世界上需要解決的一大問(wèn)題。

在我國(guó)南方地區(qū)，特別是湘南地區(qū)，由于農(nóng)業(yè)和工業(yè)面源污染，以及土壤成土母質(zhì)cd²⁺(cd)背景值高等問(wèn)題，導(dǎo)致了較為嚴(yán)重的土壤cd污染，明顯影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。且專家指出，土壤污染造成有害物質(zhì)在農(nóng)作物中積累，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，引發(fā)各種疾病，最終危害人體健康。因此，降低農(nóng)作物中鎘的積累量，提升農(nóng)作物的抗逆性勢(shì)在必行。

在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，生長(zhǎng)狀況好的作物抗逆性差，抗逆性強(qiáng)的作物生長(zhǎng)狀況不佳，作物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和抗環(huán)境非生物脅迫永遠(yuǎn)是一個(gè)矛盾。因此，在非生物脅迫環(huán)境中種植作物，就必需同時(shí)考慮作物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和抗環(huán)境脅迫能力，使其得以協(xié)調(diào)，從而獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益。然而，對(duì)于在非生物脅迫尤其是重金屬脅迫的條件下增強(qiáng)植物抗性的同時(shí)提高植物nue的研究很少，在此之前還沒(méi)有一種方法能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)調(diào)控和環(huán)境非生物脅迫的調(diào)控相協(xié)調(diào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種同時(shí)提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)抑制clca通道蛋白活性的方式來(lái)改變no3^-在細(xì)胞質(zhì)和液泡中的分配比例，從而改變能量的分配，在提高植物nue的同時(shí)增強(qiáng)植物抗cd脅迫能力。其方案具體是提供一種同時(shí)提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法，包括如下步驟：培育幼苗，進(jìn)行移栽培養(yǎng)，將培養(yǎng)后得到的作物置于環(huán)境非生物鎘脅迫模擬池中，將含有氯離子通道抑制劑的抑制劑溶液噴灑到作物葉片上進(jìn)行抑制處理，噴灑的量以該溶液完全濕潤(rùn)所有葉片為準(zhǔn)。

方法原理：(1)氯離子通道抑制劑噴灑到葉片可以抑制clca通道蛋白的活性；(2)clca通道蛋白的活性被抑制后，no3^-能更多地分配在植物細(xì)胞質(zhì)中，液泡累積no3^-所需的能量減少，從而可以使更多地能量用于將cd區(qū)隔到植物液泡中；(3)更多no3^-分配到細(xì)胞質(zhì)中能提高其利用效率，并且由于no3^-向液泡累積減少，所需質(zhì)子泵提供的能量減少，能量的重新分配導(dǎo)致cd向液泡的累積增多，從而提高了植物對(duì)cd的抗性。

no3^-是陸生植物主要的氮源，no3^-在硝酸還原酶(nr)的作用下可以代謝為銨鹽，通過(guò)谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(gs-gogat)循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?，而谷氨酸可以進(jìn)一步生成其他的氨基酸，從而參與構(gòu)建蛋白質(zhì)、核苷酸、葉綠素等各類分子。在植物的細(xì)胞內(nèi)，no3^-一部分被還原利用，一部分轉(zhuǎn)運(yùn)至植物的液泡內(nèi)儲(chǔ)存起來(lái)。細(xì)胞質(zhì)中no3^-的濃度為3-5mol·m^-3，而在占據(jù)了成熟細(xì)胞體積60％-95％的液泡中no3^-的濃度為30-50mol·m^-3，no3^-在液泡膜質(zhì)子泵(v-atpase和v-ppase)提供能量的前提下，在clca轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下累積到植物液泡中，雖然液泡內(nèi)有no3^-的大量累積，但液泡內(nèi)不含有nr，不能被植物吸收利用，因此，液泡被稱為no3^-的儲(chǔ)存庫(kù)。而細(xì)胞質(zhì)中存在nr，是硝態(tài)氮的還原場(chǎng)所，被稱為硝態(tài)氮的代謝庫(kù)。改變no3^-在植物細(xì)胞質(zhì)和液泡中的分配，使更多比例的no3^-分配到細(xì)胞質(zhì)中能提高植物對(duì)no3^-的代謝，從而提高植物的氮素利用效率(nue)。

液泡占據(jù)了植物成熟細(xì)胞體積的60％-95％，不僅是許多營(yíng)養(yǎng)元素的儲(chǔ)存器官，也是存儲(chǔ)和解毒非必需有毒重金屬元素cd的主要細(xì)胞器。cd脅迫條件下，雖然植物細(xì)胞壁能阻擋一部分cd進(jìn)入植物細(xì)胞，但仍有一部分cd會(huì)在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)植物螯合肽合成酶被激活形成植物螯合肽螯合鎘，降低其有效性和毒性，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中。液泡占據(jù)了植物細(xì)胞體積的大部分，并且液泡內(nèi)不存在具有生理活性的酶類物質(zhì)，因此液泡區(qū)隔化作用成為了植物緩解cd毒害最普遍有效的機(jī)制，而這一解毒機(jī)制同樣依賴于液泡膜質(zhì)子泵以及各類cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。例如，作為hma家族成員中的一員，oshma3是定位在水稻根部液泡膜上負(fù)責(zé)將cd轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，研究表明，oshma3的過(guò)表達(dá)能有效降低水稻籽粒中cd累積和提高植物對(duì)cd的抗性；atcax4是定位在液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在煙草中表達(dá)這兩種基因能提高煙草對(duì)cd²⁺、zn²⁺和mn²⁺三種重金屬離子的抗性，同時(shí)能降低cd向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。

no3^-和cd向液泡的累積一方面依賴于各自的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，一方面均需要液泡膜質(zhì)子泵提供跨膜運(yùn)輸?shù)哪芰?。植物液泡膜上存在的兩類功能和物理特性完全不同的質(zhì)子泵，共同致力于跨膜△h⁺的建立，并通過(guò)定位在植物液泡膜的cd²⁺/h⁺和2no3^-/h⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行液泡cd和no3^-的累積，其中液泡內(nèi)、外的質(zhì)子(h⁺)濃度梯度通過(guò)液泡膜質(zhì)子泵提供能量得以維持。可見(jiàn)，液泡膜質(zhì)子泵是液泡cd和no3^-累積的能量來(lái)源，同時(shí)調(diào)控著液泡cd和no3^-的累積。

液泡膜質(zhì)子泵活性的調(diào)控還可以顯著影響植物的抗環(huán)境非生物脅迫，比如重金屬脅迫等。植物過(guò)表達(dá)v-ppase基因可以增強(qiáng)其抗環(huán)境非生物脅迫能力，比如鹽脅迫、淹水、干旱和低溫脅迫等。例如，大麥幼苗根部施用微量v-atpase活性抑制劑(5nmbafilomycin)就顯著加劇了大麥的cd脅迫(5μm)程度。抑制液泡膜質(zhì)子泵的活性能有效增加細(xì)胞質(zhì)中no3^-的比例，從而提高植物的nue，但當(dāng)質(zhì)子泵活性的受到抑制時(shí)，植物對(duì)非生物脅迫的抗性變?nèi)?。由此可?jiàn)，植物氮素利用效率的提高和抗非生物脅迫的增強(qiáng)是一對(duì)矛盾，無(wú)法通過(guò)改變質(zhì)子泵活性來(lái)調(diào)節(jié)，但通過(guò)改變clca通道蛋白的活性，即使用氯離子通道抑制劑能有效調(diào)節(jié)這一對(duì)矛盾。從理論上來(lái)講，所有的作物液泡膜上都存在轉(zhuǎn)運(yùn)no^3-的clca通道蛋白，因此本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)所有作物都能產(chǎn)生相同的技術(shù)效果。

上述的方法，優(yōu)選的，所述幼苗為油菜幼苗。

優(yōu)選的，將油菜籽粒浸種于體積分?jǐn)?shù)為20％的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒30～50min，用蒸餾水沖洗3～6次后在玻璃網(wǎng)室的土培中發(fā)芽，所用營(yíng)養(yǎng)液為賀格蘭德完全營(yíng)養(yǎng)液，每5天澆一次營(yíng)養(yǎng)液，每次澆100ml，玻璃網(wǎng)室中晝夜平均溫度29℃/19℃，自然濕度和光照，光照強(qiáng)度為205～230ue/(m²·s)。

優(yōu)選的，所述賀格蘭德完全營(yíng)養(yǎng)液的組分及含量包括kno34～6mmol·l^-1、kh2po40.5～1.5mmol·l^-1、mgso46～8mmol·l^-1、ca(no3)2·4h2o4～6mmol·l^-1、fe-edta2～4mmol·l^-1、b0.4～0.6mg·l^-1、mn0.4～0.6mg·l^-1、zn0.04～0.06mg·l^-1、cu0.01～0.03mg·l^-1和mo0.005～0.015mg·l^-1。

優(yōu)選的，所述油菜幼苗的移栽密度為8000株/畝。

優(yōu)選的，所述油菜幼苗進(jìn)行抑制處理的時(shí)期為油菜移栽后的幼苗期到角果發(fā)育期。

優(yōu)選的，所述環(huán)境非生物鎘脅迫模擬池中鎘脅迫濃度為50～200μmol·l^-1cdcl2；

優(yōu)選的，所述抑制劑溶液中，氯離子通道抑制劑的濃度為50～100nmol·l^-1；所述抑制劑溶液的噴灑頻率為每6～10天噴灑一次。

油菜中的研究表明，液泡膜質(zhì)子泵活性抑制劑處理以后液泡膜質(zhì)子泵活性顯著降低(活性降低30％以上)，原生質(zhì)體中液泡no3^-的儲(chǔ)存比例從93％左右下降到80％左右，促使更大比例的no3^-分配到細(xì)胞質(zhì)中得以代謝，顯著降低了植物組織中no3^-含量，同時(shí)顯著提高了植物的氮素利用效率(nue)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法所使用的氯離子通道抑制劑能夠有效地抑制clca通道蛋白的活性，從而改變no3^-在細(xì)胞質(zhì)和液泡中的分配，進(jìn)一步調(diào)節(jié)能量的分配，從而為同時(shí)提高作物nue和抗cd脅迫能力提供可行的調(diào)節(jié)手段，具體表現(xiàn)為：

(1)目前還沒(méi)有一種方法能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)調(diào)控和環(huán)境非生物脅迫的調(diào)控相協(xié)調(diào)，而本方法采用噴施氯離子通道(clcs)抑制劑可以將作物的抗逆性與硝態(tài)氮的分配調(diào)控相結(jié)合；

(2)現(xiàn)有的技術(shù)可以通過(guò)調(diào)節(jié)液泡膜質(zhì)子泵活性促使更多的no3^-分配到細(xì)胞質(zhì)中，從而提高植物的nue，但質(zhì)子泵活性的降低勢(shì)必會(huì)削弱植物抗cd脅迫能力，抗環(huán)境非生物脅迫和nue是一個(gè)對(duì)立的矛盾，而本方法通過(guò)改變液泡膜no3^-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性調(diào)節(jié)液泡no3^-的分配，從而改變能量的分配，在nue提高的同時(shí)增強(qiáng)植物抗cd脅迫能力。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中在100umol·l^-1的鎘處理下噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中在100umol·l^-1的鎘處理下未噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中油菜葉綠素相對(duì)降解率對(duì)比圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中油菜丙二醛含量的對(duì)比圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中油菜脯氨酸含量的對(duì)比圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中油菜氮素利用效率的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體實(shí)施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另有特別說(shuō)明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買得到或者可通過(guò)現(xiàn)有方法制備得到。

實(shí)施例：

一種同時(shí)提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法，以油菜為例，包括以下步驟：

(1)將油菜籽粒浸種于體積分?jǐn)?shù)為20％的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒30～50min，用蒸餾水沖洗3～6遍以后在玻璃網(wǎng)室的土培中發(fā)芽，所用營(yíng)養(yǎng)液為賀格蘭德完全營(yíng)養(yǎng)液，每5天澆一次營(yíng)養(yǎng)液，每次澆100ml，玻璃網(wǎng)室中晝夜平均溫度29℃/19℃，自然濕度和光照，光照強(qiáng)度為205～230ue/(m².s)；賀格蘭德完全營(yíng)養(yǎng)液的組分及含量包括kno34～6mmol.l^-1、kh2po40.5～1.5mmol.l^-1、mgso46～8mmol.l^-1、ca(no3)2·4h2o4～6mmol.l^-1、fe-edta2～4mmol.l^-1、b0.4～0.6mg.l^-1、mn0.4～0.6mg.l^-1、zn0.04～0.06mg.l^-1、cu0.01～0.03mg.l^-1和mo0.005～0.015mg.l^-1。

(2)作物的非生物脅迫處理：油菜幼苗的移栽(采用育苗移栽方法)，9月30日前后按照第一步所述方法育苗，一個(gè)月以后移栽到環(huán)境非生物脅迫的模擬池中(模擬池中的鎘脅迫100μmol·l^-1cdcl2)，每小區(qū)10m²(長(zhǎng)5m,寬2m)，按8000株/畝的密度進(jìn)行移栽，共3個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列，按苗期、抽薹期、開(kāi)花期、角果發(fā)育期和成熟期這5個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行劃分，于當(dāng)年的5月中旬收獲，苗期移栽返青后補(bǔ)施尿素5kg/畝，適期灌水并追施薹花肥，春季結(jié)合春灌追施蕾薹肥尿素7.5kg/畝。

(3)抑制劑的施用：移栽后的油菜氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的處理，同時(shí)含有50nmol·l^-11-抑制劑溶液于每次的上午10點(diǎn)均勻的噴灑到油菜的葉片上，噴灑的量以生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液完全濕潤(rùn)所有葉片為準(zhǔn)，從移栽后的幼苗期開(kāi)始每6天均勻的噴灑一次直到進(jìn)入油菜的角果發(fā)育期結(jié)束。

測(cè)定結(jié)果：

移栽后的油菜氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的處理，同時(shí)含有50nmol·l^-11-抑制劑溶液于每次的上午10點(diǎn)均勻的噴灑到油菜的葉片上，噴灑的量以生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液完全濕潤(rùn)所有葉片為準(zhǔn)，從移栽后的幼苗期開(kāi)始每6天均勻的噴灑一次直到進(jìn)入油菜的角果發(fā)育期結(jié)束。取30～60天的油菜幼苗拍照并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明，由圖1和圖2可以看出，噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗在100umol·l^-1的鎘處理下葉片比不噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗偏綠；同時(shí)測(cè)定了葉綠素、丙二醛以及脯氨酸的含量，結(jié)果表明，在cd脅迫條件下，與未噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜相比，噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜葉綠素降解率和丙二醛含量較低(圖3和圖4)，而脯氨酸含量更高(圖5)，并且都達(dá)到了顯著差異，這些測(cè)定結(jié)果均表明噴施效氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜有更高的抗cd脅迫能力，此外還測(cè)定了未噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)和噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜的氮素利用效率，結(jié)果表明，在cd脅迫條件下，噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜具有更高的氮素利用效率(nue)(圖6)。