谷氨酸受體多肽基因應用的載體和方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了分離的多聚核苷酸和多肽，用于提高植物耐旱性和氮利用效率的重組DNA載體，含有這些重組DNA載體的植物或種子，以及利用這些重組DNA載體的方法。重組DNA載體含有植物中有功能的啟動子和與之連接的多聚核苷酸，其中，所述的多聚核苷酸編碼谷氨酸受體多肽。
【專利說明】谷氨酸受體多肽基因應用的載體和方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物育種和遺傳學，特別是，涉及用于提高植物非生物脅迫抗性(如干旱)和提高氮素利用效率的重組DNA載體。
[0002]發(fā)明背景
[0003]非生物脅迫是世界范圍內引起作物減產(chǎn)的主要原因，每年會造成主要作物減產(chǎn) 50 % 以上(Boyer，J.S.(1982) Science 218:443-448 ；Bray, E.A.等(2000) InBiochemistry and Molecular Biology of Plants, edited by Buchannan, B.B.Amer.Soc.Plant Biol.，pp.1158-1249)。干旱是所有非生物脅迫中影響作物產(chǎn)量最主要的因素，在植物生長發(fā)育階段，干旱會激活植物各種不同生理和發(fā)育變化。近年來，盡管對非生物脅迫響應的分子機制和植物耐旱性的遺傳調控網(wǎng)絡進行了廣泛的研究(Valliyodan，
B.Nguyen, H.T.(2006) Curr.0pin.Plant Biol.9:189-195 ；ffang, ff.等(2003) Planta218:1-14 ；Vinocur, B.和 Altman, A.(2005) Curr.0pin.Biotechnol.16: 123-132 ；Chaves,M.M.和 Oliveira, Μ.M.(2004) J.Exp.Bot.55:2365-2384 ；Shinozaki, K.等(2003) Curr.0pin.Plant Biol.6:410-417 ;Yamaguchi_Shinozaki, K.和 Shinozaki, K.(2005)TrendsPlant Sc1.10:88-94)，但是植物如何感受、傳導干旱脅迫信號和其耐旱性的生物化學和分子機制仍然是生物學研究中面臨的一個主要挑戰(zhàn)。
[0004]早期非生物脅迫響應分子方面的研究主要借助差異和/或加減法分析(Bray，E.A.(1993)Plant Physiol.103:1035-1040 ;Shinozaki, K.和 Yamaguch1-Shinozaki，K.(1997)Plant Physiol .115:327-334 ；Zhu, J.-K.等(1997)Crit.Rev.Plant Sc1.16:253-277 ；Thomashow, M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mo1.Biol.50:571-599);和其它的方法，如分離候選基因，分析脅迫條件下該基因的表達或活性產(chǎn)物，或進行特定脅迫條件下功能互補分析(Xiong, L.和Zhu, J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum 112:152-166)。另外，用于鑒定和分離調控基因突變體的正向和反向遺傳學研究為脅迫條件下基因表達的變化提供了證據(jù)(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum 112: 152-166)。
[0005]氮素的吸收在植物生長發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要的作用(Gallais等(2004)，J.Exp.Bot.55(396):295-306),植物吸收環(huán)境中的無機氮合成氨基酸,土壤可利用氮肥可以提高植物的產(chǎn)量，因此施用氮肥成為農(nóng)民提高栽培作物(如玉米)產(chǎn)量強有力的方法。在植物最佳生長發(fā)育階段，可利用氮素的缺失就成為了非生物脅迫?，F(xiàn)在，為了避免硝酸鹽對環(huán)境的污染，同時保持足夠的利潤，農(nóng)民希望減少氮肥的使用，同時植物的產(chǎn)量并不減少。因此培育氮利用效率高的植物新品種成為增加作物產(chǎn)量的一條重要途徑。
[0006]激活標簽可以用于鑒定影響植物性狀的基因，這一方法已經(jīng)用于模式植物擬南芥的研究中(Weigel,D.等(2000)Plant Physiol.122:1003-1013)。轉錄增強子序列的插入主要激活和/或提高鄰近內源基因的表達，因此該方法可以用于分離具有重要農(nóng)藝性狀表型的基因，包括提高非生物脅迫如干旱和低氮耐性的基因。
[0007]動物細胞中，谷氨酸受體(glutamate receptor, GLR)可以與谷氨酸結合,通過配體門控離子通道或G-蛋白偶聯(lián)的受體在主要興奮神經(jīng)傳遞素傳遞中發(fā)揮作用，植物中已經(jīng)鑒定有與 GLR-類似的基因(Davenport R.(2002) Annals of Botany 90:549-557)。GLRs在營養(yǎng)的吸收、運輸和信號轉導中發(fā)揮作用(Davenport R.(2002)Annals of Botany 90:549-557)，因此可以通過基因工程手段將GLRs基因轉入植物中提高植物的抗逆性，特別是在非生物脅迫如干旱，低溫和低氮條件下的耐性。
發(fā)明摘要
[0008]本發(fā)明包括以下具體實施例:
[0009]1.基因組中含有與至少一個調控元件連接的多聚核苷酸構建的重組DNA載體的植物，其中，所述多聚核苷酸編碼谷氨酸受體多肽，通過本發(fā)明中所述的GAP參數(shù)測定，可知上述谷氨酸受體多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少為85% ;所述植物與對照植物相比具有較高的耐旱性或較高的氮素利用效率。
[0010]2.基因組中整合有與至少一個調控元件連接的多聚核苷酸構建的重組DNA載體的植物，其中，所述多聚核苷酸編碼一個多肽，通過本發(fā)明中所述的GAP參數(shù)測定，可知其氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少為85% ;與對照植物相比，所述植物顯示至少一個農(nóng)藝性狀的變化；可選的，在水分限制條件下，與對照植物相比，植物顯示所述至少一個農(nóng)藝性狀的變化；所述農(nóng)藝性狀可以是籽粒產(chǎn)量或者生物量；所述的變化可以是增加。
[0011]3.上述I和2中所述的植物，可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0012]4.上述植物的種子，所述種子的基因組中整合有與至少一個調控元件連接的多聚核苷酸構建的重組DNA載體，其中，所述的多聚核苷酸編碼一個多肽，其氨基酸序列與序列表SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少為85%;所述種子長出的植物與對照植物相比，具有較高的耐旱性，或 至少一個農(nóng)藝性狀的變化，或兩者；所述至少一個農(nóng)藝性狀可以是氮素利用效率、籽粒產(chǎn)量、生物量或其組合；所述的變化可以是增加。
[0013]5.提高植物耐旱性的方法包括(a)使用與至少一個調控序列連接的多聚核苷酸構建的重組DNA載體轉化植物再生細胞，其中，所述多聚核苷酸編碼一個多肽，其氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9氨基酸序列的一致性至少為85% ； (b)由步驟(a)的植物再生細胞再生基因組中含有構建的重組DNA載體的轉基因植物；(c)獲得由步驟(b)獲得的再生植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因組中含有構建的重組DNA載體，且與野生型植物相比，所述子代植物具有較高的耐旱性。
[0014]6.評價植物耐旱性的方法包括(a)獲得轉基因植物，其中，轉基因植物的基因組中整合有與至少一個調控元件連接的多聚核苷酸構建的重組DNA載體，所述多聚核苷酸編碼一個多肽，其氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少為85% ；(b)獲得轉基因植株的子代植物，其中，子代植物的基因組中含有構建的重組DNA載體；(c)與對照植物相比，評價子代植物的耐旱性。
[0015]7.確定植物中至少一個農(nóng)藝性狀變化的方法:(a)獲得轉基因植物，其基因組中含有與至少一個調控元件連接的多聚核苷酸構建的重組DNA載體，其中所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9的氨基酸序列的一致性至少為85% ；(b)獲得轉基因植物的子代植物，其中，子代植物基因組中含有構建的重組DNA載體:(c)與對照植物對比，確定子代植物是否具有所述的至少一個農(nóng)藝性狀的變化；可選的，步驟(C)包括在水分限制條件下確定轉基因植物是否具有至少一個農(nóng)藝性狀的變化；所述的至少一個農(nóng)藝性狀可以是氮素利用效率、籽粒產(chǎn)量、生物量或者其組合；所述的變化可以是增加 。
[0016]8.上述5-7所述的任一方法，其中，植物可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0017]9.本發(fā)明中分離的多聚核苷酸包括(a)編碼多肽氨基酸序列與序列表中SEQ IDNO:5或9氨基酸序列的一致性至少為90%的核苷酸序列，(b)序列表中SEQ ID NO:4或8所示的核苷酸序列，(c)與(a)或(b)核苷酸序列完全互補的序列，其中，(c)序列與(a)或(b)序列的核苷酸數(shù)目相同且100%互補；所述多肽包括序列表中SEQ ID NO:5或9所示的氨基酸序列；所述核苷酸序列包括序列表中SEQ ID NO:4或8所示的核苷酸序列。
[0018]在具體實施例中，本發(fā)明主要揭示了與至少一個調控序列連接的本發(fā)明中分離的多聚核苷酸構建的重組DNA載體，和含有該重組DNA載體的細胞、植物或種子；所述細胞可以是酵母、昆蟲或植物細胞等真核細胞，也可以是細菌細胞等原核細胞。
[0019]附圖和序列表的簡要i兌明
[0020]下面的詳細說明、附圖和序列表有助于全面了解本發(fā)明。
[0021]圖1.水稻激活標簽突變體庫構建中使用的A-載體圖。四拷貝的CaMV 35S增強子(4 X CaMV 35S增強子)鄰近右邊界(RB)，LTP2: =DsRed鄰近左邊界(LB) ,UB1:: Hygr #為篩選標記重組DNA片段，15kb的間隔區(qū)位于4 X CaMV 35S增強子與Hyglr之間。Amplr表示氨芐青霉素抗性基因，Hyf表示潮霉素抗性基因，UBI為玉米泛素啟動子，LTP2為大麥脂轉移蛋白2啟動子，DsRed為礁珊瑚紅色熒光蛋白。
[0022]圖2.AHO1486水稻株系中T-DNA側翼序列和候選基因在9號染色體上的位置圖譜。T-DNA插入水稻基因組的9號染色體的15760218和15760298之間，T-DNA右邊界末端缺失22bp，左邊界的UBI啟動子缺失65bp。
[0023]圖3.AHO1486株系轉基因水稻不同組織中GLRl和GLR2激活表達水平的real-time PCR分析。Zhonghuall-WT代表野生型中花11, Zhonghuall-TC代表組織培養(yǎng)獲得中花11 ；R代表根，S代表莖，L代表葉。把對照水稻葉片中GLRl或GLR2基因的表達水平設為I, AHO1486株系根中GLRl基因的表達水平為17.74，莖中為3.95，葉中為58.83 (左圖)；AH01486株系根中GLR2基因的表達水平為1.00，莖中為1.45，葉中為38.45。
[0024]圖4.不同轉基因水稻株系葉片中GLR2表達水平的real-time PCR分析。對照水稻DP0005葉片中GLR2基因的表達水平設為1.00，各轉基因株系葉片中GLR2基因的表達水平如圖數(shù)字所示。
[0025]圖5.低氮處理期間GLR2轉基因水稻(DP0015)和對照水稻(DP0005)分蘗情況的照片。
[0026]圖6.過表達水稻GLR2基因提高了擬南芥(DP0015-5和DP0015-6)的耐旱性。A.DP0015-5和DP0015-6中GLR2基因的表達水平，B.復水第三天時擬南芥的存活率，C.復水第三天時擬南芥的生長狀況。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009轉化株。
[0027]圖7.過表達水稻GLRl基因提高了擬南芥(DP0025-13和DP0025-16)的耐旱性。A.DP0025-13和DP0025-16中GLRl基因的表達水平，B.復水第三天時擬南芥的存活率，C.復水第三天時擬南芥的生長狀況。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009轉化株。
[0028]圖8.水稻GLRl和GLR2氨基酸序列的比對。保守區(qū)是GLRl第三個外顯子編碼的G483-H842之間的359個氨基酸序列。
[0029]表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列編號
[0030]表2.T2代AHO1486水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0031 ] 表3.TO代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0032]表4.Tl代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0033]表5.T2代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在溫室條件下的耐旱性能分析
[0034]表6.Tl代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在溫室條件下的耐低氮性能分析(分蘗數(shù))
[0035]表7.Tl代CaMV 35S Pro:GLR2水稻株系在溫室條件下的耐低氮性能分析(SPAD值)
[0036]表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列編號
[0037]
【權利要求】
1.基因組中含有重組DNA載體的植物，其中，重組DNA載體包括至少一個調控元件，和與之相連的多聚核苷酸；根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為85% ;與對照植物相比，所述植物顯示增強的耐旱性和/或較好的氮素利用效率。
2.基因組中含有重組DNA載體的植物，其中，重組DNA載體包括至少一個調控元件，和與之相連的多聚核苷酸；根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為90% ;與對照植物相比，所述植物顯示增加的籽粒產(chǎn)量、生物量或兩者。
3.根據(jù)權利要求1或2，與所述對照植物相比，在水分限制或氮素限制條件下，所述植物顯示所述增加的籽粒產(chǎn)量、生物量或兩者。
4.根據(jù)權利要求1、2或3，所述植物選自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。
5.權利要求1、2、3或4植物收獲的種子，其中，所述種子的基因組中含有重組DNA載體，重組DNA載體包括至少一個調控元件，和與之相連多聚核苷酸；根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為90% ;與對照植物相比，由所述種子長出的植物顯示至少一個增加的性狀，如耐旱性、籽粒產(chǎn)量和生物量。
6.提高植物耐旱性的方法,其包括(a)將重組DNA載體轉入植物再生細胞，其中，重組DNA載體包括至少一個調控元件，和與之相連的多聚核苷酸，根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為90%;(b)由步驟(a)的植物再生細胞再生轉基因植物，其中轉基因植物的基因組中含有重組DNA載體；(c)獲得步驟(b)轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因組中含有重組DNA載體，與對照植物相比，所述子代植物顯示增強的耐旱性。
7.評價植物耐旱性的方法，其包括(a)獲得轉基因植物，其中，轉基因植物的基因組中含有重組DNA載體，所述的重組DNA載體包括至少一個調控元件，和與之相連的多聚核苷酸，根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為90% ;(b)獲得轉基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因組中含有重組DNA載體；(c)以不含有所述重組DNA載體的植物為對照，評價子代植物的耐旱性。
8.確定植物籽粒產(chǎn)量、生物量或兩者變化的方法，其包括(a)獲得轉基因植物，其中，轉基因植物的基因組中含有重組DNA載體，所述重組DNA載體包括至少一個調控元件，和與之相連的多聚核苷酸，根據(jù)GAP比對方法，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為90% ； (b)獲得轉基因植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因組中含有重組DNA載體；(c)測定子代植物的籽粒產(chǎn)量和/或生物量，并將所述測定與對照植物的籽粒產(chǎn)量和/或生物量進行比較。
9.根據(jù)權利要求8的方法，轉基因子代植物和對照植物的籽粒產(chǎn)量和/或生物量是在水分限制條件下測定的。
10.根據(jù)權利要求8或9的方法，與對照植物相比，轉基因子代植物的所述籽粒產(chǎn)量和/或生物量增加了。
11.根據(jù)權利要求6-10的任一方法，所述植物選自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜猜、棉花、大麥、粟、甘鹿和柳枝稷。
12.分離的多聚核苷酸包括(a)編碼影響植物耐旱性或氮素利用效率的多肽，根據(jù)GAP比對方法，所述多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性至少為90% ;和(b)核苷酸序列(a)的全長互補序列。
13.根據(jù)權利要求12，所述多肽的氨基酸序列包括序列表中SEQID NO:5或9。
14.根據(jù)權利要求12，所述核苷酸序列包括序列表中SEQID NO:4或8。
15.含有重組DNA載體的植物或種子，其中，重組DNA載體包括權利要求12-14中任意多聚核苷酸，和與之相連的調控序列。
16.含有增加內源多聚核苷酸表達的重組轉錄激活元件的水稻，其中，所述多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與序列表中SEQ ID NO:5或9所示氨基酸序列的一致性為90%。
17.權利要求16的水稻植物，載體包括序列表中SEQID NO:1所示的序列。
18.權利要求16或17的水稻，轉錄激活元件插入水稻基因組9號染色體的15760218和15760298之間。
19.權利要求16的水稻，內源多聚核苷酸編碼SEQID NO:9或5所示的多肽。
20.改善植物耐旱性或氮素利用效率的方法，其包括(I)將權利要求16-19任意水稻植株與另一個水稻植株進行雜交，產(chǎn)生的子代種子；(b)收獲和種植子代種子以獲得至少一個子代植株，所述后代水稻的9號染色體的15760218和15760298之間存在轉錄激活元件的插入；(c)將子代水稻與另`一個水稻品種雜交，產(chǎn)生至少一個回交子代種子；可選的，(d)多次重復步驟(b)和(C)，產(chǎn)生比所選水稻品種具有更高耐旱性和氮素利用效率的植物。
【文檔編號】A01H5/00GK103503777SQ201210236405
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月21日 優(yōu)先權日:2012年6月21日
【發(fā)明者】高陽, 劉敬梅, 劉軍華, D·F·羅薩爾特, 呂貴華, S·斯瓦桑卡, 王昌貴, 王偉, 王喜萍, 夏勉, 于昆 申請人:先鋒國際良種公司, 北京凱拓迪恩生物技術研發(fā)中心有限責任公司