PLDε基因在增加作物氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物分子育種和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了PLDε基因在增加作物氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量中的應(yīng)用，其中，所述PLDε基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或者與SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列相似性大于或等于60%。本發(fā)明還公開了一種增加油菜氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量的方法，試驗(yàn)證明，無論在氮饑餓或氮充足條件下，超表達(dá)AtPLDε均可以促進(jìn)油菜側(cè)根的生長與發(fā)生，并增強(qiáng)了油菜葉片組織細(xì)胞的生長和生物產(chǎn)量的提高，還可促進(jìn)油菜植株的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和同化代謝過程，具體表現(xiàn)在超表達(dá)植株N轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因NTR1.1和NTR2.1的表達(dá)量均明顯高于野生型，對氮的吸收率也顯著快于野生型。
【專利說明】PLD ε基因在增加作物氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物分子育種和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及PLD ε基因在增加作物氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氮營養(yǎng)的代謝與多種生物化學(xué)途徑緊密相關(guān)，也是所有生物體必需的元素之一。植物從土壤中吸收硝酸鹽、亞硝鹽及銨鹽，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)、同化供各種代謝途徑所需。許多研究表明植物根生長與N營養(yǎng)供給水平緊密相關(guān)。據(jù)觀察，當(dāng)外源硝酸鹽濃度充足時(shí)，擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目與正常條件下相比不會(huì)發(fā)生改變，但側(cè)根長卻比正常條件下的要增加2倍，而且這種增長要?dú)w因于植物根尖分身組織中單個(gè)細(xì)胞的增長。然而，低濃度的硝酸鹽則可以刺激植物側(cè)根數(shù)目的增加。此外，N營養(yǎng)的缺乏也降低了作物的光合作用效率，因此，為了提高作物的產(chǎn)量，氮肥的使用量正在逐年增加。然而，過多的氮肥的施用使得地下水及地表水中的N元素濃度嚴(yán)重超標(biāo)，江河、湖泊中的赤潮及藻類泛濫的現(xiàn)象也頻繁地發(fā)生。因此，減少氮肥的使用和提高作物對N營養(yǎng)的利用效率已經(jīng)成為了提高作物產(chǎn)量和減少N富營養(yǎng)化對環(huán)境污染的重要策略。
[0003]植物通過硝酸鹽還原酶和亞硝酸還原酶將硝酸鹽還原為銨離子，細(xì)胞再將銨離子利用并使N最終進(jìn)入植物代謝過程中。擬南芥中，有4種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與硝酸根的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收有關(guān)，它們分別是NRT1.1 (CHLl)，NRT1.2，NRT2.1,和NRT2.2 ;另有4種銨根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ΑΜΤ1.1, 1.2，1.3，1.5)也可促進(jìn)植物直接從土壤中吸收銨鹽。植物的N代謝受到硝酸鹽及N代謝產(chǎn)物的調(diào)控，且硝態(tài)氮及其代謝產(chǎn)物可能參與N信號(hào)過程。擬南芥ANRl基因缺失導(dǎo)致植株對硝酸鹽的敏感性發(fā)生了改變，并且在高N條件下，突變體植株的側(cè)根伸長受到抑制。此外，高濃度的銨鹽也可以抑制植物根的生長。擬南芥中有2種硝態(tài)氮吸收系統(tǒng)，分別是高親和性和低親和性系統(tǒng)。植物從外界吸收的硝態(tài)氮首先在胞質(zhì)內(nèi)由NR將其還原成亞硝態(tài)氮，然后亞硝態(tài)氮在質(zhì)體中由NiR再一`次將其還原為植物可以直接利用的銨態(tài)氮，銨態(tài)氮的同化則主要是通過谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶途徑來完成。植物對N營養(yǎng)的吸收需要有N轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及N信號(hào)傳感器的參與才能完成，因此細(xì)胞膜在N營養(yǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)中也起著重要的作用。然而，關(guān)于細(xì)胞膜如何介導(dǎo)N轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)N營養(yǎng)的途徑，以及植物細(xì)胞膜如何傳遞并調(diào)節(jié)植物對N營養(yǎng)信號(hào)的響應(yīng)機(jī)理尚不清楚。
[0004]磷脂雙分子層是細(xì)胞膜的主要骨架，在細(xì)胞響應(yīng)外界刺激的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。磷脂酶D (PLD)是一類催化水解膜磷脂的重要的磷脂酶，它可以通過影響膜磷脂成分及結(jié)構(gòu)來改變細(xì)胞膜對外界刺激的響應(yīng)。研究表明，在磷缺乏時(shí)，PLD ζ s缺失的植株可以減少主根的生長和促進(jìn)側(cè)根的延伸，其根內(nèi)的PC的含量降低、DGDG的含量升高(Li etal.，2006a)，且突變體 PLD ζ 2 根中 PA 的含量降低(Li et al.，2006a, Li et al.，2006b)，這些數(shù)據(jù)說明PLD ζ s可以通過水解細(xì)胞膜上的PC來完成細(xì)胞膜糖脂的合成并通過控制根的生長發(fā)育來調(diào)節(jié)植物對外界磷信號(hào)的響應(yīng)。PLD ε和PLD ζ s 一樣，它們都可以調(diào)控植物對外界環(huán)境中營養(yǎng)的應(yīng)答并影響植物根的生長。然而，不同的是PLDe調(diào)控的是植物對外界N營養(yǎng)信號(hào)的應(yīng)答，而PLD ζ s則是調(diào)控植物對外界P營養(yǎng)信號(hào)的應(yīng)答。在N營養(yǎng)缺乏條件下，PLDe缺失突變體根的生長受阻，而超表達(dá)PLDe則促進(jìn)根生長，而超表達(dá)PLD ε的植株則表現(xiàn)出在不同氮濃度條件下都可以促進(jìn)側(cè)根的伸長及側(cè)根數(shù)目的增加，但是卻只能在氮營養(yǎng)缺乏時(shí)促進(jìn)主根的生長。
[0005]擬南芥基因組含有的12個(gè)PLDs，其序列特征、生化特性、生理功能各不相同(Wanget al., 2006, Qin and Wang, 2002)。通過分析不同PLD突變體表明，某一特定PLD基因的缺失突變，其生物學(xué)功能難于被其它PLD所補(bǔ)償，說明植物的PLD家族的生物學(xué)復(fù)雜多樣，且各具特色。最近的研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶D的新成員PLDe參與了氮信號(hào)的感知和植物生長的調(diào)控。據(jù)分析，PLDe的序列最為獨(dú)特，盡管其轉(zhuǎn)錄水平相對較低，但其活性范圍比其它的PLD更廣，在微摩爾至毫摩爾的Ca2+濃度(μ M-mM Ca2+)條件下都有活性，可水解多種磷脂底物包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)及磷脂酰絲氨酸(PS)而產(chǎn)生信號(hào)分子PA。通過基因剔除和超表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)了這一獨(dú)特的磷脂酶PLD ε參與了氮信號(hào)感知并調(diào)節(jié)植物的生長，在氮肥充足的條件下，超表達(dá)(overexpression,縮寫0Ε)擬南芥植株的生物產(chǎn)量比對照野生型增加80%，而在氮素缺失的條件下，PLD ε剔除突變體(pld ε -1)的植株生長(包括根的生長)受到明顯抑制，而超表達(dá)植株的生長卻比野生型快，而用PA形成的抑制劑正丁醇則消除了超表達(dá)、突變體與野生型之間的表型差異。這些結(jié)果表明擬南芥PLD ε及其產(chǎn)生的PA在氮的感知和植物生長具有正調(diào)控作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了進(jìn)一步探索PLD ε是否能夠應(yīng)用于作物改良，提高植物氮營養(yǎng)的高效利用。將花椰菜花 葉病毒啟動(dòng)子35S調(diào)控下的PLDe基因?qū)肓舜盒杂筒似贩NWestar中，分析超表達(dá)AtPLD ε (從模式植物擬南芥中克隆的PLD ε基因)的油菜材料在氮營養(yǎng)的吸收、利用和同化過程中的效應(yīng)，及其對植株生長發(fā)育和油脂產(chǎn)量、品質(zhì)的影響，為作物氮高效高產(chǎn)的分子育種奠定基礎(chǔ)、創(chuàng)造新種質(zhì)材料。
[0007]其中，所述PLDe基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者與SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列相似性大于或等于60%。
[0008]一種增加油菜氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0009]I)種子的滅菌及萌發(fā):將油菜種子滅菌消毒后播種到M0培養(yǎng)基中，25°C下暗光培養(yǎng)5天得幼苗；
[0010]2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取含有從模式植物擬南芥中克隆的PLD ε基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落放到含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1_2天，離心，倒掉上清，用等體積的DM溶液重懸菌體并將菌液稀釋10倍；
[0011]3)外植體的制備和侵染:切取步驟I)的幼苗的下胚軸，將其在步驟2)配制好的菌液中侵染30min，使切口充分和菌液接觸；
[0012]4)愈傷組織的培養(yǎng):將侵染后的外植體轉(zhuǎn)到已滅菌的吸水紙上，待殘留的菌液吸干后將外植體轉(zhuǎn)到M1培養(yǎng)基中，25°C下暗光培養(yǎng)2天；然后轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)基中，在25°C下光照培養(yǎng)3周；再轉(zhuǎn)移到M3培養(yǎng)基中，以后每2-3周繼代一次，直至長出綠芽；將綠芽切下并轉(zhuǎn)入到M4培養(yǎng)基中，生根2-4周，得轉(zhuǎn)基因油菜幼苗并將其移栽到大田，[0013]其中，各培養(yǎng)基和DM溶液的配方及PH值如下:
[0014]M0 培養(yǎng)基:2.2g/L MS 粉末，10g/L 瓊脂粉，pH 值為 5.8-6.0 ；
[0015]M1培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激動(dòng)素，100 μ M乙酰丁香酮，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ;
[0016]M2培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2，4-二氯苯氧乙酸，
0.3mg/L激動(dòng)素，30 μ M硫代硫酸銀，300mg/L羧芐青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ；
[0017]M3 培養(yǎng)基:4.4g/L MS 粉末，10g/L 葡萄糖，0.25g/L 木糖，0.6g/L2_(N_ 嗎啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素,0.lmg/L吲哚乙酸,300mg/L羧節(jié)青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ；
[0018]M4培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧芐青霉素，9g/L瓊脂粉，pH值為 5.8 ;
[0019]DM 溶液:4.4g/L MS 粉末，30g/L 蔗糖，100 μ M 乙酰丁香酮，pH 值為 5.8。
[0020]本發(fā)明的積極效果:
[0021]1.無論在氮饑餓或氮充足條件下，超表達(dá)AtPLDe (從模式植物擬南芥中克隆的PLD ε基因)均可以促進(jìn)油菜側(cè) 根的生長與發(fā)生，并增強(qiáng)了油菜葉片組織細(xì)胞的生長和生物
廣量的提聞。
[0022]2.在田間生長條件下，超表達(dá)AtPLDe可促進(jìn)油菜營養(yǎng)生長、花期延遲，并導(dǎo)致OE單株種子產(chǎn)量高于野生型，多不飽和脂肪酸含量提高。
[0023]3.AtPLD ε可促進(jìn)油菜植株的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和同化代謝過程，具體表現(xiàn)在OE植株N轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因NTR1.1和NTR2.1的表達(dá)量均明顯高于WT，對氮的吸收率也顯著快于野生型，OE植株體內(nèi)調(diào)控氮同化代謝的硝酸還原酶(NR)和亞硝酸還原酶(NiR)活性也相應(yīng)地高于野生型植株。
[0024]4.在氮饑餓條件下，超表達(dá)AtPLDe可促進(jìn)油菜衰老葉片中的有機(jī)物質(zhì)向新葉轉(zhuǎn)運(yùn)，提聞植株體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的聞效再利用。
[0025]5.在氮饑餓條件下，超表達(dá)AtPLD ε植株的葉片MGDG含量降低，并伴隨著PC及PI含量的升高，表明PLD ε參與氮饑餓下的膜脂代謝過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1，PLD ε超表達(dá)載體構(gòu)建模式圖。
[0027]圖2，將0.3mM N條件下生長14天的植株轉(zhuǎn)移到3mM N條件下時(shí)，PLD ε -OECPLD ε超表達(dá)植株)和WT植株對N營養(yǎng)的吸收效率曲線圖。其中，N營養(yǎng)液每周更換一次。
[0028]圖3，PLD ε -OE和WT材料分別在0.3、3及15mM N營養(yǎng)液中生長11天后，檢測植株葉片蛋白消耗N03_和N02_的速度來檢測植株中NR及NiR酶的活性。期間，培養(yǎng)液每周更換一次。**表示與WT比較時(shí)，學(xué)生t值顯示具有極顯著性(P <0.01)。
[0029]圖4，PLD ε -OE及WT植株在0(Η20)、3和7.5mM N中生長7天后的根及下胚軸長、側(cè)根數(shù)及長度。*和**分別表示與WT比較時(shí)，學(xué)生t值顯示具有顯著性(P < 0.05)和極顯著性(P < 0.01)。
[0030]圖5，PLD ε -OE及WT植株在田間生長到143天時(shí)的表型。[0031]圖6，PLD ε -OE及WT單株植物的種子產(chǎn)量。英文字母表示用Duncan’ s多因素方差分析時(shí)(p〈0.05)的顯著性差異。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1:油菜遺傳轉(zhuǎn)化(暗光培養(yǎng)法)
[0033]種子的滅菌及萌發(fā):用75%酒精浸泡種子Imin后，用無菌水將種子沖洗一遍。然后用0.15%的HgCl2 (含0.1% (v/v) Tween20)消毒15min,再用無菌水沖洗3-5次；然后將種子播種到Mtl培養(yǎng)基中，每皿(直徑為3cm)均勻播種18粒種子。將培養(yǎng)皿放到無菌的塑料培養(yǎng)盒中，暗光條件下25°C培養(yǎng)5天。
[0034]農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取農(nóng)桿菌(GV3101，含有AtPLDa I基因質(zhì)粒的菌株，通過商業(yè)途徑購買)單菌落放到LB液體培(含50mg/L Km)養(yǎng)基中培養(yǎng)1_2天，最佳的侵染OD值為0.6-0.8。通過分光光度計(jì)檢測菌液在600nm吸收光條件下的濃度，當(dāng)OD值為0.6-0.8時(shí)將培養(yǎng)好的菌株在離心機(jī)中6000rpm離心IOmin,倒掉上清；用等體積的DM (DilutionMedium)液體重懸，再在同樣的條件下離心一次；棄上清,再用等體積的DM溶液懸浮。取2ml菌液，用20ml的DM溶液稀釋(1:10)(在滅菌的培養(yǎng)皿中進(jìn)行)。
[0035]外植體的制備和侵染:用無菌的鑷子和解剖刀切取暗光培養(yǎng)的幼苗的下胚軸，每個(gè)外植體的長度均勻?yàn)?.8cm左右，保持外植體的切口整齊。將切好的外植體浸泡在已經(jīng)配制好的菌液中，侵染30min，期間用移液器吸打4-5次，使切口充分和菌液接觸。
[0036]愈傷組織的培養(yǎng):將侵染后的外植體轉(zhuǎn)到已滅菌的吸水紙上，待殘留的菌液被吸干后將外植體轉(zhuǎn)到M1培養(yǎng)基中，每皿40-50個(gè)外植體，在同樣的暗光條件下共培養(yǎng)2天；將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)基中，在25°C、光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。以后的培養(yǎng)均在光照條件下進(jìn)行(25°C) ;3周后的外植體的愈傷組織基本上脫分化，將其轉(zhuǎn)到M3培養(yǎng)基中，以后每2-3周繼代一次，直至長出綠芽；將生長有明顯基節(jié)的綠芽切下并轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中，生根2-4周；從根生長良好的幼苗上取少量葉片,用shorty buffer法提取葉片DNA,并用PCR檢測植株中是否有PLD ε的插入；選擇少量未轉(zhuǎn)化成功的幼苗作為野生型(WT)，和PLDal超表達(dá)的苗一起移栽到大田并自交留種，以便為后續(xù)試驗(yàn)提供材料來源。
[0037]其中，各培養(yǎng)基和DM溶液的配方及PH值如下:
[0038]M0 培養(yǎng)基:2.2g/L MS 粉末，10g/L 瓊脂粉，pH 值為 5.8-6.0 ；
[0039]M1培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4_ 二氯苯氧乙酸，
0.3mg/L激動(dòng)素，100 μ M乙酰丁香酮，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ;
[0040]M2培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸，
0.3mg/L激動(dòng)素，30 μ M硫代硫酸銀，300mg/L羧芐青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ；
[0041]M3 培養(yǎng)基:4.4g/L MS 粉末，10g/L 葡萄糖，0.25g/L 木糖，0.6g/L2_(N_ 嗎啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素,0.lmg/L吲哚乙酸,300mg/L羧節(jié)青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ；
[0042]M4培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧芐青霉素，9g/L瓊脂粉，pH值為 5.8 ;
[0043]DM 溶液:4.4g/L MS 粉末，30g/L 蔗糖，100 μ M 乙酰丁香酮，pH 值為 5.8。[0044]實(shí)施例2:PLD ε轉(zhuǎn)基因植株的鑒定及表達(dá)
[0045](I)PLD ε轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
[0046]經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化的植株在仏培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根后，取適量的葉片提取DNA，用引物35S-p/PLD ε -A對葉片DNA進(jìn)行PCR檢測，同時(shí)以質(zhì)粒作為正對照，以WT的DNA為負(fù)對照，以判斷植株中是否成功轉(zhuǎn)入AtPLD ε基因。部分轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示出大部分植株都可以擴(kuò)增出與質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物大小一致片段，而僅有2個(gè)轉(zhuǎn)化植株及WT的DNAPCR后沒有目標(biāo)片段出現(xiàn)，說明了農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的PLD ε質(zhì)粒已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)化到油菜中。
[0047]在上述方法中，所用引物對的核苷酸序列如下所示:
[0048]弓丨物對35S-p/PLD ε -A:
[0049]正向引物35S-p5' -GAAGACGTTCCAACCACGT-3'，
[0050]反向引物PLDe-A5' -CTCGTCGTTCCACAACATTA-3'。
[0051](2)轉(zhuǎn)PLD ε基因植株RNA的表達(dá)
[0052]為了觀察AtPLDe在轉(zhuǎn)基因植株中的RNA的表達(dá)量，提取了轉(zhuǎn)化植株葉片的總RNA,并用2%的瓊脂糖膠檢測了 RNA的完整性。觀察到mRNA中的18s及28s均可清晰顯現(xiàn)。用分光光度計(jì)對RNA進(jìn)行濃度檢測后，按濃度倍數(shù)將其稀釋一致且用DNaseI降解其中的DNA，然后用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，并用BnActin基因調(diào)節(jié)cDNA的濃度至一致，通過半定量PCR分析PLD ε的轉(zhuǎn)錄水平。分別用BnActin及AtPLD ε的特異性引物BnRT-actin-F/R、At RT- ε -F/R對反轉(zhuǎn)錄出的cDNA進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖膠上電泳后紫外成像儀下成像。結(jié)果表明WT反轉(zhuǎn)錄出的cDNA中檢測不到AtPLD ε目標(biāo)片段，多數(shù)再生植株(卡那霉素抗性)均表達(dá)了外源的AtPLD ε mRNA片段。為進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)量，通過Real time PCR對其RNA`進(jìn)行了相對定量分析，發(fā)現(xiàn)在這些株系中AtPLD ε RNA的表達(dá)量比野生型上升了 150-700倍。這些數(shù)據(jù)表明了 AtPLDe基因在多數(shù)轉(zhuǎn)化油菜株系中得到超表達(dá)。
[0053]在上述方法中，所用分子標(biāo)記引物對的核苷酸序列如下所示:
[0054]引物對BnRT-actin-F/R:
[0055]正向引物BnRT-actin-FS' -TGTTCCCTGGAATTGCTGACCGTA-3'，
[0056]反向引物BnRT-actin-RS' -TGCGACCACCTTGATCTTCATGCT-3'。
[0057]引物對At RT-ε-F/R:
[0058]正向引物At RT-ε-F5' -GGGACACCGAGATTGCAATAGGTT-3'，
[0059]反向引物At RT-ε-R5' -AGCGATAACCGGTAAGCTTGGA-3'。
[0060](3)轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)的表達(dá)
[0061]PLD ε與HA及eYFP標(biāo)簽連接表達(dá)融合蛋白。為了驗(yàn)證AtPLD ε-OE株系中有AtPLD ε蛋白的表達(dá)，從油菜葉片中提取了蛋白質(zhì)，由于油菜中PLDe表達(dá)量較低，在用粗蛋白進(jìn)行抗體雜交時(shí)PVDF膜上沒有產(chǎn)物被顯色出來。因此，Iml的粗蛋白被純化和濃縮后，再與抗體進(jìn)行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)株系都有符合大小的蛋白產(chǎn)物出現(xiàn)，且產(chǎn)物的亮度與Real-time的結(jié)果比較吻合，即RNA表達(dá)量越高的株系其對應(yīng)蛋白產(chǎn)生的底物就越多。這些結(jié)果表明AtPLDe在轉(zhuǎn)基因油菜中表達(dá)成功。
[0062]利用AtPLD ε -OE及WT植株發(fā)芽4天的幼苗的側(cè)根被置于熒光顯微鏡下，當(dāng)將顯微鏡的熒光曝光時(shí)間調(diào)制300ms時(shí)，OE植株的根的細(xì)胞壁四周可以看到明顯的黃色熒光信號(hào)，而WT植株的根部則基本上沒有信號(hào)產(chǎn)生。此結(jié)果進(jìn)一步證明了 AtPLDe蛋白在油菜中得到表達(dá)。
[0063]實(shí)施例3 =PLD ε -OE植株增加N營養(yǎng)的吸收利用及種子產(chǎn)量
[0064](I)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1.1及NRT2.1的表達(dá)量分析
[0065]為了檢測PLD ε對N營養(yǎng)的吸收利用，用Real-time對植物中與N營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因NTR1.1及NTR2.1的表達(dá)量進(jìn)行了分析，數(shù)據(jù)表明:在氮嚴(yán)重缺乏(0.3mM N)條件時(shí)，0E24-2和0E37-2植株葉片中的NTR1.1表達(dá)量顯著高于野生型，分別是對應(yīng)WT植株的
4.5及1.5倍，而根中的則分別為1.5和1.3倍。當(dāng)植株生長于氮供給的正常水平(3mM N)條件下，OE中的NTR1.1的表達(dá)量是野生型40和26倍，根中的表達(dá)量則為0.7和1.9倍。在氮缺乏(0.3mM)條件下，0E24-2和0E37-2植株葉片中NTR2.1的表達(dá)量分別是WT的6.5和4.9倍，根中為5和2.3倍；而當(dāng)植株生長在3mM條件下時(shí)，0E24-2和0E37-2植株葉片中的NTR2.1表達(dá)量分別是WT中的35和10倍，根中的為4.7和2倍。此結(jié)果表明了不管在低濃度還是高濃度N營養(yǎng)條件下，OE植株葉及根中的N營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)量均高于其對應(yīng)的WT植株，此數(shù)據(jù)暗示了在油菜中超表達(dá)PLD ε可顯著促進(jìn)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0066](2) N營養(yǎng)的吸收效率
[0067]上述結(jié)果表明OE植株中與氮轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)量顯著高于其對應(yīng)WT，為分析其是否對N營養(yǎng)的吸收產(chǎn)生影響，因此通過測試培養(yǎng)液中Ν03_減少的速度，以測定OE植株是否具有較高的N營養(yǎng)吸收 能力。結(jié)果表明:與對應(yīng)的WT植株相比，PLDe-OE植株明顯具有高效吸收N營養(yǎng)的能力，特別是在24h后，OE植株顯示出比對應(yīng)的WT多吸收32.7%的NO3-(圖 2)。
[0068](3) PLD ε -OE植株中NR及NiR酶活性增強(qiáng)
[0069]由于OE植株中的NO3-吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，因此分別測定了植物葉片中的NO3-還原酶(NR)及NOf還原酶(NiR)的活性。發(fā)現(xiàn)在0.3、3及15mM N營養(yǎng)條件下，PLD ε -OE植株中NR的活性始終極顯著地高于其對應(yīng)的WT植株。然而，PLD ε -OE植株中NiR的活性僅于低N(0.3mMN)條件下才極顯著地高于其對應(yīng)的WT，在正?；蚋逳 (3、15mM N)條件下，PLD ε-OE植株中NiR的活性與其對應(yīng)的WT植株中的NiR活性無顯著性差別或者是不同OE株系之間表現(xiàn)較大差異，如在3mM N條件下，NiR活性在0E2-2中比對應(yīng)WT高，在0E37-2中卻比對應(yīng)WT低，而在0E24-2中則與對應(yīng)WT無差別(圖3)。此結(jié)果暗示著:在低N條件下，PLD ε的超表達(dá)可以提高OE植株中NR和NiR的活性；而在正?；蚋逳條件下，PLD ε的超表達(dá)仍然可以提高OE植株中NR的活性，但是卻不能改變NiR的活性。綜上結(jié)果，在氮缺乏條件下油菜表達(dá)AtPLD ε顯著促進(jìn)了氮的吸收、轉(zhuǎn)化和同化，增強(qiáng)了植株對氮的利用。
[0070](4) PLD ε -OE植株老葉中花青素含量增加和綠素含量降低
[0071]植物N營養(yǎng)吸收速率中的植株在低N (0.3mM N)條件下生長14天后，OE材料老葉(第3、4片葉)顏色與對應(yīng)的WT植株相同部位的葉片顏色明顯不同。因此，用0.1M的HCl提取了 OE及WT的第3片葉的花青素，并用分光光度計(jì)測量了花青素含量。結(jié)果表明從OE材料中提取的花青素含量明顯高于WT，0E2-2和0E24-2植株的花青素含量分別是WT的4.3和8.4倍。
[0072]同時(shí)，分析植株老葉和新葉(第I片葉)中的葉綠素的含量表明OE植株的新葉葉綠素a、b及c含量顯著或極顯著地高于WT植株，特別是葉綠素b的含量。然而，在衰老葉片中，OE植株的葉綠素a、b及c的含量卻比對應(yīng)的WT植株要低。這些結(jié)果表明PLD ε -OE材料在N缺乏條件下，植株老組織的衰老加快。此現(xiàn)象可能暗示著PLD ε -OE植株在低N條件脅迫時(shí)，通過加速植物老組織的衰老來提供新組織生長所需的營養(yǎng)，從而盡可能地維持植株的正常生存。
[0073](5)植株生物產(chǎn)量的變化
[0074]由于PLD ε -OE植株氮吸收高于WT植株，因此將PLD ε -OE及WT植株種植到含0.3、1.5、3及7.5禮N的MS培養(yǎng)液中生長，觀察其生物產(chǎn)量的變化。30天后，分別統(tǒng)計(jì)植株的葉及根的鮮重和干重發(fā)現(xiàn):生長在0.3mM N條件下的0E24-2葉片的鮮重及干重均比對應(yīng)的WT分別提高51.8%和65.4%，而0E37-2則分別增加38.7%和34.4%。而根的鮮重及干重在0E24-2中要比其WT的分別增加37.8%和27.2%，但是在0E37-2中則與WT無顯著差別。當(dāng)植株在1.5mM N條件下生長時(shí)，0E24-2葉片的鮮重及干重要比對應(yīng)WT的分別高46%和69.5%，0E37-2植株則分別提高17.9%和14.7% ;此時(shí)，根的鮮重及干重在0E24-2中要比其WT的分別增加79.5%和79.7%,而0E37-2植株則比WT提高48.7%和42.2%。
[0075]將植株生長在3mM N條件下時(shí)，0E24-2葉片的鮮重及干重要比對應(yīng)WT的分別增加33.4%和31.4%，0E37-2植株則分別提高33.9%和26.9%。而此時(shí)，根的鮮重及干重在0E24-2中要比其WT的分別增長了 13.2%和28.5%,而0E37-2植株則比WT增加27.8%和28.7%。隨著在N濃度增加到7.5mM時(shí)，0E24-2葉片的鮮重及干重要比對應(yīng)WT的分別增加38.5%和64.7%，0E37-2植株則分別提高13.3%和17.6% ;而此時(shí)，根的鮮重及干重在0E24-2中要比其WT的分別增加57.2%和26.1%，而0E37-2植株則比與WT的無顯著差別。
[0076]以上數(shù)據(jù)說明在氮缺乏或N正常條件下，OE植株均表現(xiàn)出比WT植株積累的更多生物產(chǎn)量更多或者持平，而且生物產(chǎn)量的積累并非隨著N營養(yǎng)濃度的增加而增加，而是當(dāng)植物生長在3mM N條件下時(shí)生物產(chǎn)量積累出現(xiàn)峰值，暗示著對于油菜栽培而言，最適宜的N濃度條件可能在3mM左右。 而且，OE與WT植株的生物產(chǎn)量積累在氮濃度為1.5mM的條件下差異最大。
[0077](6) PLD ε -OE植株葉面積、側(cè)根數(shù)及長度增加
[0078]為分析導(dǎo)致OE與WT植株生物產(chǎn)量出現(xiàn)差異的原因，對植物的葉片及根的形態(tài)進(jìn)行了分析。對生長在0.3、0.5、1.5、3及7.5禮N條件下15天后的植株進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)不同N濃度條件下，OE植株生長始終快于其對應(yīng)的WT植株。30天后，測量植株相似部位、相同葉齡的完全伸展葉片的寬度及長度，并計(jì)算葉面積。結(jié)果表明在不同N濃度條件下，OE材料葉片寬度及面積幾乎都極顯著高于其對應(yīng)的WTJS OE材料的葉片數(shù)量與WT植株之間沒有顯著差別。顯微鏡下觀察葉片表皮細(xì)胞及葉肉細(xì)胞的大小，結(jié)果顯示OE葉片表皮細(xì)胞及葉肉細(xì)胞的大小分別為對照WT的2倍，但超表達(dá)PLD ε對葉片組織中的粗蛋白含量的影響甚小，OE與WT之間無顯著差別。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明超表達(dá)AtPLDe可顯著促進(jìn)植物細(xì)胞的生長，進(jìn)而增強(qiáng)植株生長，提高生物產(chǎn)量。
[0079]前期觀察發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PLD ε可促進(jìn)根的生長，本研究還分析了生長于不同氮濃度(0、3、7.5mM N)營養(yǎng)液中PLD ε -OE及WT植株的根形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OE植株的側(cè)根數(shù)均顯著多于對應(yīng)的WT，且側(cè)根長度也明顯增長，PLD ε-OE植株的側(cè)根長在O (Η20)、3和7.5mMN的營養(yǎng)液中分別是其對應(yīng)的WT植株側(cè)根長的2-2.8,2.4-3.5及2.6-4.1倍。PLD ε -OE植株的側(cè)根數(shù)在O (H20)、3和7.5mM N的營養(yǎng)液中則分別是其對應(yīng)的WT植株的側(cè)根數(shù)的
1.6-7、1.7-4及2.4-8.4倍，而主根長度則沒有明顯差異。此外，OE植株幼苗下胚軸在整體上卻比其對應(yīng)的WT顯著性地變短(圖4)。由此可見，超表達(dá)PLDe可以促進(jìn)側(cè)根數(shù)及側(cè)根長度，從而提高植株對N營養(yǎng)的吸收利用，促進(jìn)植株生長。
[0080](7) PLD ε影響植物花期及生長
[0081]為了觀察PLD ε -OE植株在大田中的生長狀況，按照隨機(jī)區(qū)組的方法將PLD ε -OE純合體植株0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2與共分離的WT植株一起種植于田間。植株在田間生長到第55和105天時(shí)，OE植株明顯地比對應(yīng)的WT植株高大，同時(shí)觀察到第55天的OE植株的第3葉片寬度及葉面積均顯著大于WT。0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2葉片寬度分別比其對應(yīng)的WT增加38%、34%和25%，而除0Ε2-2外，其它OE材料的葉片數(shù)與WT相比基本相同。當(dāng)植株在田間生長到143天時(shí)，WT進(jìn)入開花期，而OE株型仍大于WT植株(圖5)。同時(shí)還觀察到OE材料的花期較WT推遲，當(dāng)WT開花率為80%時(shí)，OE材料0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2的開花率分別僅為0、20%和60%。PLD ε -OE材料的盛花期較WT推遲了 17-18天。由此表明超表達(dá)PLD ε可能延長花期，保證植株有更充足的營養(yǎng)生長。
[0082]收獲PLD ε -OE及WT成熟的植株并考察其相關(guān)農(nóng)藝性狀，數(shù)據(jù)表明:0Ε2-2、0Ε37_2及0Ε38-2材料的株高分別比其對應(yīng)WT增長7%、10%和17%，但是0Ε2-2及0Ε37-2植株的主花序長度卻顯著短于其對應(yīng)的WT，而0Ε38-2植株的主花序長度則比WT長。此外，0Ε2-2及0Ε38-2的有效分枝數(shù)分別比其對應(yīng)的WT增加30%和21% ;且0Ε2_2、0Ε37_2及0Ε38-2植株的主花序上的角果數(shù)分別比其對應(yīng)WT增加29%、20%和43%，整個(gè)植株的角果總數(shù)則分別比對應(yīng)WT植株提高73%、34%和98%。此數(shù)據(jù)暗示著PLD ε的超表達(dá)可促進(jìn)油菜的有效分枝和角果總數(shù)，從而提高單株種子產(chǎn)量。
[0083](8) PLD ε影響植物種子產(chǎn)量及油分
[0084]由于PLD ε -OE植株的角果數(shù)多于WT，因此調(diào)查了植株的角果長度、角果種子粒數(shù)、種子千粒重及植株單產(chǎn)。結(jié)果表明0Ε37-2及0Ε38-2的角果長度分別比其對應(yīng)WT植株增長53%和16%，而0Ε2-2則與WT的無差別；而0Ε2-2和0Ε38-2植株的角果種子粒數(shù)分別比其對應(yīng)的WT植株增加27%和49%，0Ε37-2則與WT無差別。種子的千粒重的數(shù)據(jù)則顯示除了 0Ε37-2比WT的高外，另外兩個(gè)OE材料的千粒重都顯著地低于WT?；谏鲜龈鱾€(gè)性狀的調(diào)查結(jié)果，0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2植株的種子單株產(chǎn)量分別比其對應(yīng)WT增產(chǎn)了 61%、105%和194%(圖6)。綜上所述，超表達(dá)PLDe導(dǎo)致的單株產(chǎn)量的增加源于多種產(chǎn)量性狀的累加，包括有效分枝數(shù)、角果長度和角果數(shù)。
[0085]超表達(dá)PLD ε顯著提高了油菜的種子產(chǎn)量，其是否對油脂含量和品質(zhì)產(chǎn)生影響值得關(guān)注。通過GC分析不同OE株系收獲的種子含油量及其組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 0Ε25植株的種子含油量表現(xiàn)出高于WT外，其余5個(gè)PLD ε -OE株系的種子含油量與WT沒有顯著差異。但OE種子油脂組分與WT存在明顯差異，OE材料種子油脂組分中多不飽和油酸(C18:2和C18:3)含量高于WT，而其飽和或單不飽和脂肪酸的積累(Λ ( I)卻低于WT。同時(shí)，OE材料的油脂二十碳烯酸(C20:l)和芥酸(C22:l)的含量也顯著低于WT，且有些OE株系的軟脂酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)及油酸(C18:l)的含量也低于WT。由此初步了解到超表達(dá)PLD ε對種子總油脂含量沒有明顯影響，卻改變了種子油脂組分，即OE材料種子的亞油酸(C18:2)及亞麻酸(C18:3)的含量增加，而飽和或單不飽和脂肪酸(Λ ( I)的含量降低。[0086](9) PLD ε -OE植物葉片脂成分發(fā)生變化
[0087]為了調(diào)查PLD ε對植物脂代謝的影響，提取了生長在0.3mM N條件下植物葉片的脂質(zhì)，用LC/MS進(jìn)行量化分析，結(jié)果表明OE植株中的單半乳糖甘油二酯(MGDG)含量顯著低于其對應(yīng)的WT植株，而OE植株葉片中的PC及PI的含量卻高于WT。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)引起MGDG含量減少主要是其?；N類C34:5、C36:4及C36:5的降低所致。而PC含量的增加是由C34:3、C36:2、C36:5和C36:6這些成分的增加而引起的，PI中的C34:2、C34:3和C36:3的含量則在不同的OE葉片中略高于WT。`
【權(quán)利要求】
1.PLD ε基因在增加作物氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量中的應(yīng)用，其中，所述PLD ε基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,或者與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相似性大于或等于60%。
2.一種增加作物氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量的方法，其特征在于:將在花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子35S調(diào)控下的PLD ε基因，通過轉(zhuǎn)基因手段將其整合到作物基因組中。
3.一種增加油菜氮營養(yǎng)高效利用及種子產(chǎn)量的方法，其特征在于包括以下步驟: .1)種子的滅菌及萌發(fā):將油菜種子滅菌消毒后播種到M0培養(yǎng)基中，25°C下暗光培養(yǎng)5天得幼苗； .2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取含有從模式植物擬南芥中克隆的PLDε基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落放到含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1_2天，離心，倒掉上清，用等體積的DM溶液重懸菌體并將菌液稀釋10倍； . 3)外植體的制備和侵染:切取步驟I)的幼苗的下胚軸，將其在步驟2)配制好的菌液中侵染30min，使切口充分和菌液接觸； .4)愈傷組織的培養(yǎng):將侵染后的外植體轉(zhuǎn)到已滅菌的吸水紙上，待殘留的菌液吸干后將外植體轉(zhuǎn)到M1培養(yǎng)基中，25°C下暗光培養(yǎng)2天；然后轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)基中，在25°C下光照培養(yǎng)3周；再轉(zhuǎn)移到M3培養(yǎng)基中，以后每2-3周繼代一次，直至長出綠芽；將綠芽切下并轉(zhuǎn)入到M4培養(yǎng)基中， 生根2-4周，得轉(zhuǎn)基因油菜幼苗并將其移栽到大田， 其中，各培養(yǎng)基和DM溶液的配方及PH值如下: M0培養(yǎng)基:2.2g/L MS粉末，10g/L瓊脂粉，pH值為5.8-6.0 ； M1培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸，.0.3mg/L激動(dòng)素，100 μ M乙酰丁香酮，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ; M2培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸，.0.3mg/L激動(dòng)素，30 μ M硫代硫酸銀，300mg/L羧芐青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ； M3培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L2_ (N-嗎啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素,0.lmg/L吲哚乙酸,300mg/L羧節(jié)青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L瓊脂糖，pH值為5.8 ； M4培養(yǎng)基:4.4g/L MS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧芐青霉素，9g/L瓊脂粉，pH值為5.8 ;DM溶液:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，100 μ M乙酰丁香酮，pH值為5.8。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103773798SQ201410007520
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】魯少平, 王學(xué)敏, 洪月云 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)