本發(fā)明涉及應用生物技術(shù)原理人工培育真菌的技術(shù)領域，具體涉及蛹蟲草的培育，更具體地涉及一種蛹蟲草多孢雜交育種的方法及其應用。

背景技術(shù)：

蛹蟲草（cordycepsmilitaris）隸屬于真菌界（fungi）、子囊菌門（ascomycota）、子囊菌綱（ascomycetes）、糞殼菌亞綱（sordariomycetidae）、肉座菌目（hypocreales）、麥角菌科（clavicipitaceae）、蟲草屬（cordyceps）。蛹蟲草是非常著名的藥食兩用的子囊真菌，也是獲得蟲草素的主要來源，具有很高的開發(fā)利用價值。近年來，隨著野生冬蟲夏草資源的日漸枯竭，其價格不斷攀升，從而促使人們尋找野生冬蟲夏草的替代品。由于蛹蟲草具有與冬蟲夏草相近的藥用與食用價值，加之蛹蟲草更容易馴化，因此受到人們越來越多的關注。

蛹蟲草的生物活性成分主要是蟲草素、蟲草酸和多糖。蟲草素是蛹蟲草的次生代謝產(chǎn)物，為腺苷酸類似物，是從真菌中分離出的第一個核苷酸類抗菌素，具有抑制腫瘤、抗驚厥、抗焦慮等多種藥用價值。

在相關技術(shù)中，通常都是以蛹蟲草的菌種開始培養(yǎng)繁殖，進而得到蟲草素、多糖和蟲草酸。常見的蛹蟲草菌種在培養(yǎng)過程中，首先制作固體試管種再將試管種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)一定時間，得到液體母種，得到的液體母種經(jīng)過擴培后或直接接種到子實體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。一般而言，蛹蟲草菌種在培養(yǎng)生長過程中會用到固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及子實體培養(yǎng)基；其中固體培養(yǎng)基包括：20%馬鈴薯，5%葡萄糖，3%瓊脂粉；液體培養(yǎng)基包括：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.09%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂；子實體固體培養(yǎng)基包括：25%大米或麥子，2.0%蛋白胨，0.07%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂。

此外，一方面，蛹蟲草就是一種退化特別快的菌種，如果培養(yǎng)基營養(yǎng)不全，就會導致產(chǎn)量低、退化快；另一方面，蛹蟲草的生長是一個退化的過程，是人工難以控制的。

為此，需要探索一種培育優(yōu)良蛹蟲草菌種的方法，并為其生長提供營養(yǎng)全面的培養(yǎng)基，以期獲得有活力且退化慢的菌種，進而培育得到產(chǎn)量高、有益成分含量豐富的子實體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種蛹蟲草多孢雜交育種的方法，包括以下步驟：

1）將蛹蟲草的孢子彈射至固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)得到蛹蟲草的多孢菌種；

2）將所述多孢菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到斜面菌種；

3）將所述斜面菌種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)得到種子液。

通過本發(fā)明獲得的蛹蟲草多孢雜交菌種活力高、發(fā)菌快，可減少菌種的退化，進一步培養(yǎng)可獲得高產(chǎn)、蟲草素含量高的子實體。

進一步，步驟1）所述的固體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，瓊脂0.6-0.8份，水50-60份。

更進一步，步驟1）所述的固體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.4份，葡萄糖0.95份，瓊脂0.7份，水56份。

進一步，步驟2）所述的斜面培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，瓊脂0.8-1份，水50-60份。

更進一步，步驟2）所述的斜面培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.93份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.045份，瓊脂0.82份，水56。

進一步，步驟3）所述的液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，維生素b10.0009-0.02份。

更進一步，步驟3）所述的液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.96份，蛋白胨0.43份，酵母浸粉0.43份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.0112份。

進一步，所述培養(yǎng)基中的蛋白胨的總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%；所述培養(yǎng)基中的水為礦泉水或者蒸餾水，ph值為6-7。

本發(fā)明使用的培養(yǎng)基為能夠為蛹蟲草菌種或子實體的生長提供全面營養(yǎng)的培養(yǎng)基，其可市售獲得，或者按照已有文獻自制。作為一種更優(yōu)的實施方式，優(yōu)選其含有本發(fā)明所列的培養(yǎng)基組成，這些培養(yǎng)基提供了最合適的碳氮比，營養(yǎng)較其他現(xiàn)有的培養(yǎng)基更為全面，使蛹蟲草在發(fā)菌過程中發(fā)菌快，穩(wěn)定，減少了菌種的退化。

進一步，所述步驟1）在20-22℃培養(yǎng)2天。

進一步，所述步驟2）在20-22℃培養(yǎng)7-8天。

進一步，所述步驟3）在20-22℃下以200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)5-6天。

本發(fā)明還提供以上任一項所述的蛹蟲草多孢雜交育種的方法在蛹蟲草培養(yǎng)中的應用。

本發(fā)明提供一種培育蛹蟲草的方法，包括將以上任一項所述的蛹蟲草多孢雜交育種的方法制備的種子液接種到子實體培養(yǎng)基，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

進一步，所述子實體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：大米和/或麥子25-35份，蛋白胨0.27份，磷酸二氫鉀0.096份，硫酸鎂0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

更進一步，所述子實體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：大米和/或麥子30份，蛋白胨0.27份，磷酸二氫鉀0.096份，硫酸鎂0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

進一步，子實體培養(yǎng)包括以下步驟：

4）將所述種子液接種到子實體培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)，長出菌絲體；

5）將所述菌絲體轉(zhuǎn)色培養(yǎng)，得到長有原基的菌絲體；

6）將所述長有原基的菌絲體進行子實體培養(yǎng)，至采收。

進一步，所述步驟4）避光培養(yǎng)（例如置于暗培室中培養(yǎng)）的溫度為20-22℃，培養(yǎng)8-10天。

進一步，所述步驟5）轉(zhuǎn)色培養(yǎng)的溫度為20-22℃，濕度為70%，每天通風（例如置于通風房中培養(yǎng)）4-5小時，光照12-16小時，培養(yǎng)4-5天。

進一步，所述步驟6）子實體培養(yǎng)的溫度為20-25℃，培養(yǎng)35-40天。

具體實施方式

本發(fā)明提供的蛹蟲草為有性繁殖，遺傳性較好，孢子粉含量高、產(chǎn)量高，子實體粗壯品相好，其中含有的蟲草素及多糖在抗炎、抗癌及增強免疫力等方面起到重要作用。具體地，本發(fā)明比現(xiàn)有菌種的培育方法和傳統(tǒng)配方的培養(yǎng)基發(fā)菌快，污染率降低達15%，采收的子實體的蟲草素含量為1.5%-2%，比無性繁殖的草高20%，產(chǎn)量比無性繁殖的草高10%-15%。

在多孢雜交育種的過程中，不同生長階段的蛹蟲草菌種采取不同的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其中，將孢子彈射到固體培養(yǎng)基上之后，通過一定時間的培養(yǎng)，得到多孢子種，再將得到的多孢子種轉(zhuǎn)接到斜面試管培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)一段時間后得到斜面菌種，再將斜面菌種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)液中，通過培養(yǎng)一段時間得到液體菌種，將液體菌種再轉(zhuǎn)接到子實體培養(yǎng)基中，并進行暗培養(yǎng)后就會得到菌絲體，菌絲體通過轉(zhuǎn)色培養(yǎng)以及子實體培養(yǎng)之后即可得到產(chǎn)量高、蟲草素高的子實體。通過以上描述可知，本發(fā)明提供的蛹蟲草多孢雜交育種的栽培方法，在培養(yǎng)過程中，蛹蟲草菌種在不同階段采取了不同的培養(yǎng)條件，通過不同的培養(yǎng)條件，控制了蛹蟲草菌種不同時期的生長特性，使得菌種能夠穩(wěn)定、高效的繁殖和生長，因此其產(chǎn)量高，蟲草素含量大。

固體培養(yǎng)基、斜面試管培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)液和子實體栽培培養(yǎng)基分別為蛹蟲草在不同的階段提供了不同的營養(yǎng)，進而確保菌種的生長活力和適應栽培的目標需求。每種培養(yǎng)基都是按照不同的營養(yǎng)成分按照優(yōu)選的重量比例組合而成。固體培養(yǎng)基、斜面試管培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)液和子實體栽培培養(yǎng)基主要以供應碳氮源的方式為蛹蟲草不同階段提供生長繁殖所需的營養(yǎng)。此外，在固體培養(yǎng)基中，葡萄糖和馬鈴薯為蛹蟲草提供了生長所需要的碳源；而斜面培養(yǎng)基中加入了磷酸二氫鉀，使酸堿度進行了緩沖，維持了更好的生長條件；接下來的液體培養(yǎng)液更全面為斜面菌種提供了營養(yǎng)物質(zhì)，進而得到液體菌種再通過子實體培養(yǎng)基培養(yǎng)之后得到菌絲體；菌絲體轉(zhuǎn)色培養(yǎng)后得到產(chǎn)量高、蟲草素含量高的蛹蟲草子實體。由于四種培養(yǎng)基均含有提供蛹蟲草生長的碳源和氮源，因此培養(yǎng)基的營養(yǎng)會決定蛹蟲草后期的活性和蟲草素的形成。

在本發(fā)明中，液體培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉可使菌種的遺傳性得以良好的保持，減少菌種在不同培養(yǎng)基中的退化。

各培養(yǎng)基的原料都經(jīng)過嚴格篩選，如蠶蛹粉、蛋白胨、大米和小麥都要求質(zhì)量過關，并有正規(guī)的生產(chǎn)廠家；馬鈴薯的采購更嚴格，要求無腐爛、無霉變、無發(fā)芽、無損傷、無綠變、完整無損傷的新鮮馬鈴薯，其蛋白質(zhì)含量不低于3%，淀粉含量不低于13%-15%；蛋白胨的總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%；選用的大米和小麥都無異味、無雜質(zhì)、無霉變、無蛀蟲，且淀粉含量不低于20%，蛋白質(zhì)含量不低于3%-5%。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供一種蛹蟲草多孢雜交育種及培育蛹蟲草的方法，包括：分別配制固體培養(yǎng)基、斜面試管培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)液和子實體栽培培養(yǎng)基；將蛹蟲草的孢子彈射到固體培養(yǎng)基上，并在20-22℃培養(yǎng)2天；再將固體培養(yǎng)基的菌種轉(zhuǎn)接到斜面試管培養(yǎng)基中，在20-22℃培養(yǎng)7-8天；將所述斜面菌種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)液中，在20-22℃下以200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)5-6天得到種子液；將所述種子液轉(zhuǎn)接到子實體培養(yǎng)基上，放置到暗培室避光培養(yǎng)8-10天，得到菌絲體；將菌絲體轉(zhuǎn)色，進行子實體培養(yǎng)，培育可得到高產(chǎn)、蟲草素含量高的子實體。

在一個更具體的實施方案中，所述固體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.4份，葡萄糖0.95份，瓊脂0.7份，水56份；所述斜面培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.93份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.045份，瓊脂0.82份，水56份；所述液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.96份，蛋白胨0.43份，酵母浸粉0.43份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.0112份；所述子實體栽培培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：大米和/或麥子30份，蛋白胨0.27份，磷酸二氫鉀0.096份，硫酸鎂0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但這些內(nèi)容不應理解為對本發(fā)明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領域的常規(guī)操作進行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養(yǎng)基的組分購自北京奧博星。

實施例

1）配制固體培養(yǎng)基，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1190ml，然后分別加入20g葡萄糖、15g瓊脂粉，溶解攪拌均勻分裝在500l的三角瓶中，每瓶約90ml，將裝有液體的三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，然后取出待其凝固備用。

選取無菌培養(yǎng)的成熟的蛹蟲草2株，將蛹蟲草消毒，將消毒好的蟲草倒掛在固體培養(yǎng)基三角瓶中，在避光培養(yǎng)2天便可孢子彈落，落在培養(yǎng)基的孢子經(jīng)過2天的培養(yǎng)即可得到固體多孢子菌種。

各培養(yǎng)基的配制嚴格控制質(zhì)量和數(shù)量，例如馬鈴薯以200g最佳，為了使其有效的營養(yǎng)得到更好的釋放，應在制作過程中把馬鈴薯切成小塊，此外配制所需要的水為礦泉水，滅菌時溫度控制在121℃，滅菌時間不要超過30min。

2）配制斜面試管培養(yǎng)基，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1180ml，然后分別加入葡萄糖19.6g、磷酸二氫鉀2.0g、硫酸鎂0.95g、瓊脂17.3g，溶解攪拌均勻分裝在試管中，將裝有液體的試管放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，然后取出15°斜放待其凝固備用。

將試管放置超凈工作臺上消毒30分鐘，然后將固體多孢子菌種轉(zhuǎn)接至斜面試管培養(yǎng)基中，在21℃培養(yǎng)7天，即可得到斜面試管種。

3）配制液體培養(yǎng)液，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1137ml，然后分別加入葡萄糖20g、蛋白胨9g、酵母浸粉9g、磷酸二氫鉀2.0g、硫酸鎂1.0g、脫脂蠶蛹粉2g、b10.24g，溶解攪拌均勻分裝在三角瓶中，將裝有液體的三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，然后取出放涼備用。其中，加入蠶蛹粉可使菌種的遺傳性得以良好的保持，減少菌種在不同培養(yǎng)基中的退化。

將液體培養(yǎng)液放置超凈工作臺上消毒30分鐘，然后將斜面試管菌種轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)液中，在21℃下以200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)6天得到種子液。

4）配制子實體培養(yǎng)基，包括：小麥300g，加入蛋白胨2.7g、磷酸二氫鉀0.96g、硫酸鎂0.96g、葡萄糖2.7g，攪拌加入水580ml，高溫123℃滅菌50分鐘，放涼后備用。

將子實體培養(yǎng)基放入超凈工作臺滅菌30分鐘，然后將液體菌種轉(zhuǎn)接到子實體培養(yǎng)基中，放置到暗培室避光培養(yǎng)9天，培養(yǎng)溫度21℃，得到菌絲體。將菌絲體轉(zhuǎn)移至可通風的房間轉(zhuǎn)色，房間溫度為20℃，每天通風4小時，光照11小時，培養(yǎng)2-3天。暗培養(yǎng)及轉(zhuǎn)色的房間濕度控制在70%-80%，轉(zhuǎn)色之后培養(yǎng)基就會出現(xiàn)原基分化，出現(xiàn)小刺芽，這時再培養(yǎng)30天，溫度為20-22℃，即可得到高產(chǎn)的子實體。子實體長到約8-10cm，子實體表面有粉狀物形成時即可采收。

根據(jù)本實施例提供的多孢雜交育種法，采收子實體的蟲草素的平均含量為1.8%（由國家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測天津站測得），比市售無性繁殖的草高20%，子實體產(chǎn)量比無性繁殖的草高15%。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的科技人員本發(fā)明可以有更多改變和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進均包含在本發(fā)明內(nèi)。