本發(fā)明屬于植物無(wú)性繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種翠竹果實(shí)組培消毒及愈傷誘導(dǎo)增殖方法。
背景技術(shù)：
：翠竹(pleioblastusdistichus)是禾本科(poaceae)苦竹屬(pleioblastus)的優(yōu)良地被類觀賞植物，其葉翠綠，且極耐修剪，目前在園林綠化上的應(yīng)用需求越來(lái)越大，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值也越來(lái)越高[張春霞，駱仁祥，丁興萃，等.翠竹的組織培養(yǎng)和快速繁殖[j].植物生理學(xué)通訊，2010，46(5)：477-478]。翠竹原產(chǎn)日本，于20世紀(jì)80年代引入南京，2015年3月份首次開(kāi)花，5月果實(shí)成熟[林樹(shù)燕，范婷婷，姜明云，等3種(品種)地被竹花器官形態(tài)特征及學(xué)名訂正[j].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2017，41(1)：189-193]。竹類植物由于開(kāi)花周期長(zhǎng)、種子可育率低、開(kāi)花后大面積死亡現(xiàn)象，因此加強(qiáng)種質(zhì)資源的保存和遺傳多樣性的保護(hù)是竹類遺傳育種的基礎(chǔ)。竹子組織培養(yǎng)快繁技術(shù)以其快速高效、便于操作和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，對(duì)于優(yōu)良竹種種質(zhì)資源的保存與大規(guī)模擴(kuò)繁起到了重要作用[張敏，盧義山，蔣澤平，等.竹子組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[j].江蘇林業(yè)科技，2007，34(5)：40-45]。關(guān)于竹類植物果實(shí)種胚的研究已越來(lái)越多，但果實(shí)消毒和愈傷誘導(dǎo)增植的瓶頸極大地限制了竹類植物組培的研究。組培實(shí)驗(yàn)顯示，翠竹是一種較易組培的一種混生竹，因此建立其種胚體系對(duì)于混生竹類來(lái)說(shuō)具有非常重要的研究意義。因此通過(guò)低成本、操作簡(jiǎn)便的種子消毒方法以及高效的愈傷增殖配方進(jìn)行組培實(shí)驗(yàn)無(wú)疑是一種高效低廉的種胚選擇方式。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種翠竹果實(shí)組培消毒及愈傷誘導(dǎo)增殖方法，克服組培污染率高，愈傷誘導(dǎo)增殖困難等問(wèn)題，具有成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種翠竹果實(shí)組培消毒及愈傷誘導(dǎo)增殖的方法，包括以下步驟：1)5月中旬，在翠竹果實(shí)成熟期間，于天氣晴朗的時(shí)候采集翠竹成熟果實(shí)，將采集的果實(shí)立即進(jìn)行處理；2)剝?nèi)ス麑?shí)內(nèi)、外稃片，用洗潔精清洗果實(shí)表面，流水沖洗，再用多菌靈溶液浸泡果實(shí)，最后于流水下沖洗，待用；3)在無(wú)菌操作臺(tái)上，用酒精浸泡果實(shí)，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用升汞浸泡，無(wú)菌水沖洗數(shù)次消毒；4)將消毒后的材料接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：ms培養(yǎng)基+2,4-d1.5～3mg/l+kt0.3～1mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠；5)將愈傷組織在增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基組成為：ms培養(yǎng)基+2,4-d1～3mg/l+6-ba0.5～1.5mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。步驟2)中，于流水下沖洗0.5h，再用0.5％的多菌靈溶液浸泡果實(shí)0.5h，最后于流水下沖洗2h，待用。步驟3)中，在無(wú)菌操作臺(tái)上，用70％的酒精浸泡果實(shí)30s，無(wú)菌水沖洗4次，再用0.1％的升汞浸泡7min，無(wú)菌水沖洗4次。步驟4)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：ms培養(yǎng)基+2,4-d1.5～2mg/l+kt0.3～0.5mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。步驟4)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：ms培養(yǎng)基+2,4-d1.5mg/l+kt0.5mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。步驟5)中，增殖培養(yǎng)基組成為：ms培養(yǎng)基+2,4-d1～3mg/l+6-ba0.5～1.5mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。步驟5)中，增殖培養(yǎng)基組成為：ms培養(yǎng)基+2,4-d1mg/l+6-ba1mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。本發(fā)明的翠竹果實(shí)組培消毒及愈傷誘導(dǎo)增殖方法，針對(duì)竹類植物果實(shí)組培污染率極高，愈傷誘導(dǎo)增殖困難等問(wèn)題，探索出翠竹果實(shí)組培消毒及愈傷誘導(dǎo)增殖方法。該方法主要是包括采集→預(yù)處理→消毒→愈傷誘導(dǎo)→愈傷增殖。按此方法進(jìn)行翠竹果實(shí)組培，污染率較低，成活率高，愈傷誘導(dǎo)率高，增殖快。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的翠竹果實(shí)組培消毒及愈傷誘導(dǎo)增殖的方法，是一種優(yōu)良的竹類植物果實(shí)組培技術(shù)，有效解決竹類植物果實(shí)在組培過(guò)程中常出現(xiàn)的污染率高，愈傷誘導(dǎo)增殖困難和低成活率等典型問(wèn)題，顯著提高翠竹果實(shí)成活率，愈傷組織誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)，使用本發(fā)明翠竹果實(shí)組培成活率達(dá)88％，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)50％，愈傷增殖倍數(shù)達(dá)8倍，為建立和完善混生竹組培體系的奠定基礎(chǔ)，為翠竹大面積推廣栽培提供可靠保障。附圖說(shuō)明圖1是帶稃片的翠竹果實(shí)圖；圖2是去稃片的翠竹果實(shí)圖；圖3是愈傷誘導(dǎo)1周后，露出胚根圖；圖4是愈傷誘導(dǎo)2周后，形成愈傷圖；圖5是愈傷誘導(dǎo)1.5個(gè)月后的愈傷圖；圖6是愈傷誘導(dǎo)4個(gè)月后的愈傷圖；圖7是愈傷增殖2個(gè)月后的愈傷圖；圖8是愈傷增殖4個(gè)月后的愈傷圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1翠竹果實(shí)外植體選擇隨著翠竹果實(shí)生長(zhǎng)的過(guò)程，于天氣晴朗的時(shí)候，采集生長(zhǎng)健壯而無(wú)病蟲(chóng)害的翠竹未成熟果實(shí)、成熟果實(shí)，帶回。將部分成熟果實(shí)陰干，于4℃冰箱里儲(chǔ)存。本實(shí)施例共設(shè)4個(gè)處理。將新鮮采集的翠竹未成熟果實(shí)、成熟果實(shí)、4℃保存2個(gè)月以及4℃保存6個(gè)月的成熟果實(shí)消毒后，接種于起始培養(yǎng)基上(起始培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2,4-d2mg/ml+kt1mg/ml+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠)。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，15d后統(tǒng)計(jì)污染率，25d后統(tǒng)計(jì)成活率。結(jié)果如表1所示，從污染率來(lái)看，處理1的結(jié)果雖然污染率最低，為5.3％，但是其出愈率為0。這說(shuō)明未成熟的翠竹果實(shí)不適宜誘導(dǎo)愈傷。處理3和4中，污染率較高且出愈率低，甚至為0，說(shuō)明隨著種子儲(chǔ)存的時(shí)間增長(zhǎng)，污染率提高，出愈率降低。由此可見(jiàn)，新鮮采集的翠竹果實(shí)為形成愈傷的最佳外植體。表1不同外植體選擇對(duì)外植體培養(yǎng)的影響因此，根據(jù)上述結(jié)果，應(yīng)于5月中旬，翠竹果實(shí)成熟期間，于天氣晴朗的時(shí)候采集翠竹成熟果實(shí)，將新鮮采集的果實(shí)立即進(jìn)行預(yù)處理。實(shí)施例2翠竹果實(shí)外植體消毒將新鮮采集的翠竹果實(shí)，剝?nèi)?nèi)、外稃片(如圖1、2)，加入約半勺洗潔精，清洗果實(shí)表面，于流水下沖洗0.5h；用0.5％的多菌靈溶液浸泡，于流水下沖洗2h，帶入無(wú)菌操作臺(tái)上，用70％的酒精浸泡果實(shí)30s，無(wú)菌水沖洗4次，再用0.1％的升汞浸泡，無(wú)菌水沖洗4次。本實(shí)施例共設(shè)6個(gè)處理。消毒方式為：0.5％的多菌靈消毒0、0.5h和0.1％的升汞消毒5、7、9min組合，共設(shè)6種處理。消毒后的果實(shí)接種于起始培養(yǎng)基上(起始培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2,4-d2mg/ml+kt1mg/ml+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠)。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，15d后統(tǒng)計(jì)污染率，25d后統(tǒng)計(jì)成活率。結(jié)果如表2所示，隨著0.1％的升汞處理時(shí)間的增長(zhǎng)，污染率降低，成活率升高，但是處理3，雖然污染率最低，達(dá)12.6％，但是其出愈率降低。因?yàn)橄緯r(shí)間過(guò)久對(duì)果實(shí)的胚形成了傷害。另外，使用0.5％的多菌靈0.5h比不使用的污染率明顯降低，成活率升高。由此可見(jiàn)，處理2為最佳消毒方法。表2不同消毒劑處理不同時(shí)間對(duì)外植體培養(yǎng)的影響因此，翠竹果實(shí)最佳的消毒方法為：洗潔精清洗，流水沖洗0.5h，0.5％的多菌靈溶液浸泡0.5h，流水沖洗2h，70％的酒精浸泡30s，無(wú)菌水沖洗4次，0.1％的升汞浸泡7min，無(wú)菌水沖洗4次。實(shí)施例3翠竹果實(shí)愈傷誘導(dǎo)本實(shí)施例選擇ms為基本培養(yǎng)基，使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2.4-d和kt組合誘導(dǎo)翠竹果實(shí)產(chǎn)生愈傷，以實(shí)施例2的最佳消毒方法處理過(guò)的果實(shí)為試驗(yàn)材料進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，于25±2℃，光照3000lx，14h/d中進(jìn)行培養(yǎng)，每7d觀察1次，統(tǒng)計(jì)愈傷的誘導(dǎo)率，觀察并記錄愈傷的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果如表3所示，翠竹果實(shí)愈傷誘導(dǎo)的最佳激素配方是處理4，即：ms+2,4-d1.5mg/l+kt0.5mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，處理1-9中，出愈率均不低，說(shuō)明這些處理均能誘導(dǎo)形成愈傷。其中，處理4出愈率最高，為最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。愈傷誘導(dǎo)1周后，露出胚根，如圖3所示；愈傷誘導(dǎo)2周，形成愈傷，如圖4所示；愈傷誘導(dǎo)1.5個(gè)月后的愈傷，如圖5所示；愈傷誘導(dǎo)4個(gè)月后的愈傷圖，如圖6所示。表3不同激素配比對(duì)翠竹果實(shí)愈傷誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理2,4-dkt出愈率11.5mg/l0.3mg/l63％22mg/l0.3mg/l62.4％33mg/l0.3mg/l61.6％41.5mg/l0.5mg/l68.9％52mg/l0.5mg/l62.4％63mg/l0.5mg/l58.7％71.5mg/l1mg/l52％82mg/l1mg/l50.9％93mg/l1mg/l45.1％實(shí)施例4翠竹果實(shí)愈傷增殖將誘導(dǎo)出的愈傷轉(zhuǎn)接到愈傷增殖培養(yǎng)基上，愈傷增殖培養(yǎng)基選擇ms為基本培養(yǎng)基，使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2.4-d和6-ba組合，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，于25±2℃，光照3000lx，14h/d中進(jìn)行培養(yǎng)，每一個(gè)月觀察1次，統(tǒng)計(jì)愈傷的增殖率，觀察并記錄愈傷的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果如表4示，翠竹果實(shí)愈傷增殖的最佳激素配方是處理4：ms+2,4-d1mg/l+6-ba1mg/l+30g/l蔗糖+2.5g/l結(jié)冷膠。對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，隨著2,4-d濃度的增加，增殖倍數(shù)降低，隨著6-ba濃度的增加，增殖倍數(shù)先增加后降低。處理4愈傷增殖倍數(shù)最高，為最佳愈傷增殖培養(yǎng)基。愈傷增殖2個(gè)月后的愈傷圖，如圖7所示；愈傷增殖4個(gè)月后的愈傷圖，如圖8所示。表4不同激素配比對(duì)愈傷增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理2,4-d6-ba4個(gè)月后愈傷增值倍數(shù)11mg/l0.5mg/l7.0倍22mg/l0.5mg/l6.6倍33mg/l0.5mg/l5.4倍41mg/l1mg/l8.1倍52mg/l1mg/l7.3倍63mg/l1mg/l6.5倍71mg/l1.5mg/l7.5倍82mg/l1.5mg/l6.1倍93mg/l1.5mg/l5.4倍綜上所述，整個(gè)培養(yǎng)歷經(jīng)8個(gè)月，形成大量的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷。當(dāng)前第1頁(yè)12