本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒葡萄組培苗快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
葡萄良種苗木繁育體系建設(shè)，是我國當(dāng)前葡萄產(chǎn)業(yè)中的突出問題。長期以來，葡萄苗木生產(chǎn)、銷售和運輸缺乏管理部門的有效監(jiān)督，加之利益的驅(qū)使，導(dǎo)致苗木質(zhì)量參差不齊，尤其是品種純正、高質(zhì)量、脫毒良種苗木生產(chǎn)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。近年來，植物的組織培養(yǎng)廣泛應(yīng)用在釀酒葡萄快速繁殖中，通過組織培養(yǎng)，不僅可以加快繁殖速度，而且還可以有效地去除病毒，獲得無病毒苗木。同時，釀酒葡萄外植體類型、培養(yǎng)基、溫度與濕度、光照強(qiáng)度以及接種操作等內(nèi)外因素都會影響組培苗的生長和繁殖速度；另外，在實際生產(chǎn)中，不同釀酒葡萄品種需要不同培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)。因此，有必要針對不同釀酒葡萄品種篩選最適宜的培養(yǎng)條件，降低操作難度，建立釀酒葡萄組培快繁體系，為生產(chǎn)快速提供優(yōu)質(zhì)苗木。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對釀酒葡萄組培苗生產(chǎn)過程中，不同品種需要不同培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)周期長、根系弱和操作難度等問題，本發(fā)明提供了一種釀酒葡萄組培苗快速繁殖的方法，可實現(xiàn)同時增殖多個品種、縮短培養(yǎng)周期、高效率的組培快繁，為生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)葡萄苗木。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
一種釀酒葡萄組培苗快速繁殖的方法，包括如下步驟：
s1、按培養(yǎng)基配方分別配制50倍大量元素母液，100倍微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、iaa和青霉素母液，其中鈣鹽與大量元素母液分開配制，并貼上標(biāo)簽，冷藏保存待用；
s2、在搪瓷盆中分別加入75g蔗糖、23g瓊脂，然后再加入蒸餾水4l，加熱至沸騰，期間不斷攪拌；
s3、加入母液至搪瓷盆中，充分混合均勻，煮沸3分～5分鐘后，加蒸餾水定容至5l，然后用1.0mol/l的hcl或者1.0mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph值至5.8；
s4、將制作好的培養(yǎng)基均勻的分裝到200ml的組培瓶中、擰緊封口蓋或者150ml的三角瓶中、加棉塞、牛皮紙包裹、用棉線繩扎緊；然后放在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，條件為121℃，20分鐘；取出放在推車中待用；
s5、在無菌接種室內(nèi)，選用無菌培養(yǎng)的成株無毒苗，剪取莖段，要求莖段帶有一個芽，莖段下部不能少于0.5cm，莖段上帶有1～2片完整葉片，接種在上述培養(yǎng)基上，每瓶3～5個莖段；培養(yǎng)溫度為25～28℃，濕度85％以上，光照強(qiáng)度為2500～3500lux，光源為led燈，光照培養(yǎng)16小時，黑暗培養(yǎng)8小時。
本發(fā)明具有以下有益效果；
(1)可實現(xiàn)同時增殖多個品種，包括赤霞珠、梅鹿輒、霞多麗和黑比諾等品種；
(2)培養(yǎng)周期短，經(jīng)過20～30天的培養(yǎng)，即可進(jìn)行馴化移栽。
(3)根系發(fā)達(dá)，培養(yǎng)第30天時，組培苗根系多、粗壯，且有較多須根，有利于馴化移栽，提高成活率。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1(以黑比諾為例)：
步驟一、培養(yǎng)基的選擇：
b5+4.6g/l瓊脂+15g/l蔗糖+0.1mg/liaa+50mg/l青霉素，ph＝5.8。
步驟二、培養(yǎng)基的具體制作步驟(以5l培養(yǎng)基熬制為例)：
(1)母液的配制，按培養(yǎng)基配方分別配制50倍大量元素母液，100倍微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、iaa和青霉素母液，其中鈣鹽與大量元素母液分開配制，并貼上標(biāo)簽，冷藏保存待用。
(2)培養(yǎng)基的熬制，分別在搪瓷盆中加入75g蔗糖、23g瓊脂，然后再加入蒸餾水4l，加熱至沸騰，期間不斷攪拌；再分別加入大量元素和鈣鹽母液各100ml，微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、iaa和青霉素各50ml至搪瓷盆中，充分混合均勻，煮沸3分～5分鐘。
(4)加蒸餾水定容至5l，然后用1.0mol/l的hcl或者1.0mol/l的naoh溶液調(diào)ph值至5.8。
(5)培養(yǎng)基分裝與滅菌，將制作好的培養(yǎng)基均勻的分裝到150ml的三角瓶中，每瓶50～60ml；加棉塞、牛皮紙包裹、用棉線繩扎緊；然后放在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，條件為121℃，20分鐘；冷卻后取出放在推車中待用。
步驟三、接種培養(yǎng)
在無菌接種室內(nèi)，選用無菌培養(yǎng)的成株無毒苗，剪取莖段，要求莖段帶有一個芽，莖段下部不能少于0.5cm，莖段上帶有1～2片完整葉片，接種在上述培養(yǎng)基上，每瓶3～4個莖段；培養(yǎng)溫度為25～28℃，濕度85％以上，光照強(qiáng)度為2500～3500lux，光照培養(yǎng)16小時，黑暗培養(yǎng)8小時。期間及時處理污染的組培苗。培養(yǎng)25～30天即可進(jìn)行組培苗移栽。
以下結(jié)合相應(yīng)的試驗數(shù)據(jù)對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
試驗1不同濃度iaa對釀酒葡萄組培苗生長的影響：以b5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加4.6g/l瓊脂、15g/l蔗糖，iaa設(shè)置0mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l和0.2mg/l4個梯度，滅菌前調(diào)節(jié)ph為5.8。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為25～28℃，濕度85％以上，光照強(qiáng)度為2500～3500lux，光源為led燈，光照培養(yǎng)16小時，黑暗培養(yǎng)8小時。試驗結(jié)果見表1：
表1不同濃度iaa對釀酒葡萄組培苗生長的影響(培養(yǎng)30天的數(shù)據(jù))
試驗2不同濃度青霉素對釀酒葡萄組培苗生長的影響：在試驗1的基礎(chǔ)上，以b5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加4.6g/l瓊脂、15g/l蔗糖，青霉素設(shè)置0mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l和75mg/l5個梯度，滅菌前調(diào)節(jié)ph為5.8。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為25～28℃，濕度85％以上，光照強(qiáng)度為2500～3500lux，光照培養(yǎng)16小時，黑暗培養(yǎng)8小時。試驗結(jié)果見表2：
表2不同濃度青霉素對釀酒葡萄組培苗生長的影響(培養(yǎng)30天的數(shù)據(jù))
實施例2(以赤霞珠為例)：
步驟一、培養(yǎng)基的選擇：
b5+4.6g/l瓊脂+15g/l蔗糖+0.1mg/liaa+50mg/l青霉素，ph＝5.8。
步驟二、培養(yǎng)基的具體制作步驟(以5l培養(yǎng)基熬制為例)：
(1)母液的配制，按培養(yǎng)基配方分別配制50倍大量元素母液，100倍微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、iaa和青霉素母液，其中鈣鹽與大量元素母液分開配制，并貼上標(biāo)簽，冷藏保存待用。
(2)培養(yǎng)基的熬制，分別在搪瓷盆中加入75g蔗糖、23g瓊脂，然后再加入蒸餾水4l，加熱至沸騰，期間不斷攪拌；再分別加入大量元素和鈣鹽母液各100ml，微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、iaa和青霉素各50ml至搪瓷盆中，充分混合均勻，煮沸3分～5分鐘。
(4)加蒸餾水定容至5l，然后用1.0mol/l的hcl或者1.0mol/l的naoh溶液調(diào)ph值至5.8。
(5)培養(yǎng)基分裝與滅菌，將制作好的培養(yǎng)基均勻的分裝到200ml的組培瓶中，每瓶70～80ml；擰緊封口蓋；然后放在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，條件為121℃，20分鐘；冷卻后取出放在推車中待用。
步驟三、接種培養(yǎng)
在無菌接種室內(nèi)，選用無菌培養(yǎng)的成株無毒苗，剪取莖段，要求莖段帶有一個芽，莖段下部不能少于0.5cm，莖段上帶有1～2片完整葉片，接種在上述培養(yǎng)基上，每瓶4～5個莖段；培養(yǎng)溫度為25～28℃，濕度85％以上，光照強(qiáng)度為2500～3500lux，光照培養(yǎng)16小時，黑暗培養(yǎng)8小時。期間及時處理污染的組培苗。培養(yǎng)20～30天即可進(jìn)行組培苗移栽。
采用上述實例的組織培養(yǎng)方法得到的釀酒葡萄組培苗不僅根系發(fā)達(dá)，利于馴化移栽；而且也縮短了培養(yǎng)周期，降低了生產(chǎn)成本，獲得了優(yōu)質(zhì)、無毒、高質(zhì)量苗木，能滿足生產(chǎn)的需要。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。