一、技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種青貯玉米的四倍體誘導(dǎo)方法，屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域
二、
背景技術(shù)：
青貯玉米大多數(shù)品種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、單位面積生物學(xué)產(chǎn)量較高，具有氣味芳香、柔軟多汁、適口性好、原料中營(yíng)養(yǎng)成分保存多、損失少等特點(diǎn)，是奶牛、肉牛一年四季特別是冬春季節(jié)的優(yōu)良飼料。在“秸稈畜牧業(yè)”的形勢(shì)下，對(duì)于滿足奶牛、肉牛養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的飼草料需求，緩解草場(chǎng)壓力，青貯玉米在生產(chǎn)和利用上具有較大的潛力，也是解決我國(guó)糧飼供需矛盾，實(shí)現(xiàn)糧飼有效性供給的較好途徑。
自然界廣泛存在植物多倍體現(xiàn)象，多倍體具有繁茂性、碩大性、適應(yīng)力強(qiáng)、生物產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，一直是育種家長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。同源多倍體育種已在葡萄(宗樺，2008)、蘋果(康喜亮，2011)、水稻(符策強(qiáng)，2013)、扁蓿豆(王璐，2014)等多種作物中取得成功。但同源四倍體玉米應(yīng)用于生產(chǎn)的報(bào)道還未見。四倍體玉米株型較大、葉片寬大肥厚、莖和根較粗壯、以及多果穗等特性，是極佳的青貯飼料來(lái)源。但是同源四倍體玉米誘導(dǎo)方法的報(bào)道較少，秋水仙素對(duì)種芽進(jìn)行誘變是較為常見的方法。然而，在過去的研究中，同源四倍體玉米研究最重要的技術(shù)性難題就是染色體組多倍化的誘導(dǎo)頻率太低，以至于同源四倍體玉米的種質(zhì)資源相當(dāng)有限。同源四倍體玉米的誘導(dǎo)頻率太低的主要原因應(yīng)該歸咎于傳統(tǒng)的種芽誘導(dǎo)技術(shù)和玉米種胚的形態(tài)結(jié)構(gòu)，其原因主要包括以下兩個(gè)方面：
(1)種芽的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，在種芽的生長(zhǎng)點(diǎn)外圍還包裹著胚芽鞘、不完全葉、第一片真葉、第二片真葉等多個(gè)組織，加倍溶液需要經(jīng)過多個(gè)組織才能滲透到種芽的生長(zhǎng)點(diǎn)并對(duì)其細(xì)胞產(chǎn)生染色體組多倍化的誘導(dǎo)作用，因此加倍溶液滲透到種芽的生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞位置的難度較大。
(2)在種芽?jī)?nèi)具有不同染色體組倍性的生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)度不一致，即二倍體分生細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育上比多倍體分生細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)，以致二倍體分生細(xì)胞所產(chǎn)生的一大批子細(xì)胞限制了多倍體分生細(xì)胞及其子細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育速度，最后只能由大部分二倍體分生細(xì)胞所產(chǎn)生的一大批子細(xì)胞完成植株的形態(tài)建成，因此當(dāng)代植株的玉米果穗被誘導(dǎo)的幾率很低。
以上兩方面原因?qū)е吕脗鹘y(tǒng)的種芽誘導(dǎo)法獲得同源四倍體玉米的頻率較低，因此探索一種提高四倍體青貯玉米誘導(dǎo)率的加倍技術(shù)，為四倍體青貯玉米研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于現(xiàn)有技術(shù)四倍體青貯玉米誘導(dǎo)頻率太低的問題，本發(fā)明采用萌動(dòng)期誘導(dǎo)和幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)相結(jié)合，建立一種四倍體青貯玉米的誘導(dǎo)方法。該方法可以顯著提高同源四倍體青貯玉米的誘導(dǎo)頻率，以期在最短的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)制出更多的同源四倍體青貯玉米新種質(zhì)，提高育種效率，縮短育種年限。
1.誘導(dǎo)方法：
(1)浸種：以二倍體玉米為試驗(yàn)材料，20-25℃條件下浸泡24h。4℃條件下浸泡12h，移至20-25℃條件下浸泡2-3h，重復(fù)本步驟。
(2)加倍溶液萌動(dòng)期處理：倒掉清水，加入加倍溶液中，4℃的冰箱中放置12h。
(3)紅外線照射：用清水沖洗種子，利用紅外線燈(50hz)照射20-30s，20-25℃條件下清水浸泡24h。
(4)加倍溶液苗期處理：將種子種植在育苗盆中，正常管理，待幼苗長(zhǎng)至3-4葉時(shí)利用注射器向幼苗莖中的生長(zhǎng)點(diǎn)注射加倍溶液0.5ml，間隔12h注射一次，共注射2-3次。
(5)倍性檢測(cè)及移栽：待幼苗長(zhǎng)至五葉時(shí)，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測(cè)，記錄檢測(cè)結(jié)果，并將檢測(cè)后的幼苗進(jìn)行移栽。
2.有益效果
與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的四倍體青貯玉米誘導(dǎo)方法具有如下優(yōu)勢(shì)：
(1)將侵泡在清水中的種子，反復(fù)置于4℃和20-25℃，能有效提高種子活性，提高加倍效率；采用紅外線照射提高細(xì)胞內(nèi)酶的活性，促進(jìn)種子萌發(fā)；加倍溶液中加入0.3％的二甲基亞砜可以提高細(xì)胞膜的通透性，從而提高秋水仙素的誘導(dǎo)效率。
(2)將加倍溶液直接注入幼苗的生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞，間隔12h處理一次，處理2-3次，這有助于提高不同染色體組倍性的生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞的加倍概率，提高多倍體分生細(xì)胞及其子細(xì)胞的數(shù)目，從而提高多倍體幼苗的誘導(dǎo)頻率。
四、附圖說明
圖1加倍溶液注射幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞
圖2加倍后胚芽變化情況，表1流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色體加倍結(jié)果，表2品種間加倍率的方差分析
圖3加倍后植株田間表現(xiàn)
五、具體實(shí)施方式
(1)浸種：將青貯玉米的種子平鋪放入玻璃培養(yǎng)皿中，加入清水至剛剛沒過種子，20-25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出培養(yǎng)皿，放入4℃的冰箱中12h，移至20-25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3h，重復(fù)本步驟。
(2)加倍溶液萌動(dòng)期處理：將培養(yǎng)皿中的清水倒掉，加入加倍溶液，沒過種子即可，4℃的冰箱中放置12h。
(3)紅外線照射：用清水沖洗種子，利用紅外線燈(50hz)每皿照射20-30s，加入清水后，在20-25℃培養(yǎng)24h。
(4)加倍溶液苗期處理：將種子種植在育苗盆中，正常管理，待幼苗長(zhǎng)至3-4葉時(shí)利用1ml注射器向幼苗莖中的生長(zhǎng)點(diǎn)部位注射加倍溶液0.5ml，直至溶液從葉心中滲出，間隔12h注射一次，共注射2-3次。注射方法如圖1所示。
(5)倍性檢測(cè)及移栽：待幼苗長(zhǎng)至五葉時(shí)，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示，每次檢測(cè)30株，三次重復(fù)，遼單527，遼單青貯178和遼原一號(hào)加倍率分別為36.3％，20.5％和21％。品種間的f統(tǒng)計(jì)量值為2.55，對(duì)應(yīng)的p值為0.139，因此在0.05水平下認(rèn)為不同品種間的加倍率差異不顯著(表2)。加倍后，胚芽變得粗壯(圖2)。將檢測(cè)后的幼苗進(jìn)行移栽，比較不同倍性間植株差異(圖3)。其中加倍后的四倍體植株(a)要高于對(duì)照組(b)，同時(shí)葉面積和葉片厚度也有一定增加；而經(jīng)過秋水仙素處理后未加倍成功的植株(c)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。