本發(fā)明涉及園林植物生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種日本櫻花－染井吉野櫻組培快繁方法。

背景技術(shù)：

染井吉野櫻(學(xué)名:prunus×yedoensis)，又名東京櫻花，是國(guó)內(nèi)櫻花市場(chǎng)上炙手可熱的高檔櫻花品種，遺傳分析是由大島櫻和小松乙女櫻雜交產(chǎn)生，分別繼承了兩者花朵大和先花后葉的特點(diǎn)?；ㄆ?月中下旬，花朵有五枚花瓣，花色在花朵綻放時(shí)是淡紅色，而在完全綻放時(shí)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)白，整株在葉子長(zhǎng)出前就盛開(kāi)略帶淡紅色的白花，麗而不媚，繁茂如云。經(jīng)多年的選育提純，成為日本櫻花中的珍品，作為最受歡迎的櫻花而推廣到日本全國(guó)各地，被日本譽(yù)為櫻花之花王。

染井吉野櫻生長(zhǎng)健壯，樹(shù)形瀟灑，高度可達(dá)10至12米，是非常優(yōu)秀的櫻花品種，可孤植，可群植，也可作為行道樹(shù)栽植。在北至遼寧、南至廣東、東至上海、西至新疆等不同地域引種栽植并且生長(zhǎng)良好，大連、北京、成都、上海、江西等地都有生長(zhǎng)七十多年乃至百年的大樹(shù)。它耐旱性強(qiáng)，耐鹽堿，對(duì)土壤條件要求不嚴(yán)，各種土壤條件經(jīng)改良后都能正常生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)良好。因?yàn)槭侨斯びN，它無(wú)法自然結(jié)果繁衍，只能以插枝移植。但由于繁殖系數(shù)小，遠(yuǎn)不能滿足造景需要，嚴(yán)重影響了染井吉野櫻的的開(kāi)發(fā)利用。因此有必要建立完整的染井吉野櫻離體快繁體系，加速染井吉野櫻種苗繁育以滿足市場(chǎng)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種櫻花組培快速繁殖方法，本發(fā)明以染井吉野櫻半木質(zhì)化單芽莖段及扦插繁殖萌發(fā)的小芽為外植體，經(jīng)過(guò)外植體消毒、芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了吉野櫻組培快速繁殖方法，建立了染井吉野櫻組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為今后染井吉野櫻組織培養(yǎng)繁殖苗木，加速櫻花其他良種繁育滿足市場(chǎng)需求提供技術(shù)支持。

本發(fā)明櫻花組培快速繁殖方法中，所述外植體處理和消毒步驟包括：

a、選取健壯吉野櫻植株半木質(zhì)化單芽莖段作為外植體，先用洗衣粉水浸泡20-30min，再輕輕清洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗2-4h后置于超凈工作臺(tái)中；在鼓風(fēng)狀態(tài)下于超凈工作臺(tái)上先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)70-75％乙醇消毒8-15s后用無(wú)菌水清洗3-6次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞溶液消毒8-15min后用無(wú)菌水洗4-6次，最后用無(wú)菌紗布或無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水珠后轉(zhuǎn)接到芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；或

b、于冬末春初在壯齡樹(shù)上選擇一年生、生長(zhǎng)健壯、生活力旺盛的發(fā)育枝條，剪有飽滿芽的木質(zhì)化或半木質(zhì)化枝條作為插穗，插穗長(zhǎng)度為10—15厘米，有2-3個(gè)芽；溫室高架苗床上下鋪電加熱設(shè)施，上鋪10cm厚的基質(zhì)珍珠巖，扦插之前基質(zhì)及插穗都用1000ppm濃度的多菌靈或福爾馬林溶液消毒；插好之后采用電加熱促進(jìn)土壤升溫從而加快插穗發(fā)芽，同時(shí)10天后對(duì)穗條用500ppm濃度的多菌靈溶液進(jìn)行噴霧消毒減少有害微生物到最低狀態(tài)；待20天新芽長(zhǎng)到5-7cm左右時(shí)，切取幾近未木質(zhì)化的單芽莖段或頂芽作為外植體按a步驟進(jìn)行常規(guī)消毒后置于超凈工作臺(tái)中；在鼓風(fēng)狀態(tài)下在超凈工作臺(tái)上先用70-75％酒精消毒3s后，用無(wú)菌水清洗3-6次，再用0.1％升汞溶液消毒8min后用無(wú)菌水洗4-6次，最后用無(wú)菌紗布或無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水珠后轉(zhuǎn)接到芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

本發(fā)明方法中，所述芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟為：

將經(jīng)過(guò)外植體處理和消毒處理后的染井吉野櫻單芽莖段或頂芽切成1.5－2.5cm小段并接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在ms+ba0.5－1.0mg/l+naa0.02mg/l+tdz2.0－3.0mg/l+蔗糖20－30克/l+瓊脂5.5-6.5克/l中，先在22-25℃條件下全暗培養(yǎng)養(yǎng)5-7天，然后置于每天光照10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，25天左右繼代一次，直至誘導(dǎo)形成叢生芽。

本發(fā)明方法中，所述增殖壯苗培養(yǎng)步驟為：

將經(jīng)過(guò)芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的叢生芽分切成芽塊至增殖壯苗培養(yǎng)基(1/2ms+ba0.5－0.8+naa0.05-0.08)上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后置于每天光照10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000lx，培養(yǎng)溫度22-25℃的條件下培養(yǎng)，多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到健壯叢生芽。

本發(fā)明方法中，所述生根培養(yǎng)步驟為：

將增殖壯苗培養(yǎng)獲得的高度約為2.5-3.5cm的健壯芽分切接種到生根培養(yǎng)基(1/2ms+naa0.01-0.02)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在22-25℃左右條件下暗培養(yǎng)0-5天，然后置于光照10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)溫度為22-25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)30-35天即可出瓶。

本發(fā)明方法中，所述煉苗移栽步驟為：

將經(jīng)生根培養(yǎng)后獲得的高約3.5-5.5cm、生長(zhǎng)健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去蓋置于培養(yǎng)室光下煉苗3-5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，并用800-1000ppm多菌靈浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠巖＝7：3混合并用1000ppm多菌靈進(jìn)行噴淋過(guò)的基質(zhì)中；放于溫室培養(yǎng)，栽后前5-10天精心管護(hù)，每天至少分5次給幼苗噴霧澆水，保持葉面濕度，移栽成活率達(dá)80％以上。待幼苗成活后再移栽大田。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明通過(guò)無(wú)性快繁技術(shù)快速獲得大量染井吉野櫻優(yōu)良品種苗。以染井吉野櫻半木質(zhì)化單芽莖段為外植體，經(jīng)過(guò)外植體消毒、芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了染井吉野櫻組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為今后染井吉野櫻組織培養(yǎng)繁殖苗木，加速櫻花其他良種繁育滿足市場(chǎng)需求提供技術(shù)支持。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

(1)外植體處理和消毒：選取健壯吉野櫻植株半木質(zhì)化單芽莖段作為外植體，先用洗衣粉水浸泡20min，再輕輕清洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗2h后置于超凈工作臺(tái)中。在鼓風(fēng)狀態(tài)下于超凈工作臺(tái)上先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75％乙醇消毒12s后用無(wú)菌水清洗5次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％升汞溶液消毒15min后用無(wú)菌水洗6次，最后用無(wú)菌紗布或無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水珠后備用；該方法的污染率高，達(dá)到90％。

(2)芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(1)處理后的染井吉野櫻半木質(zhì)化單芽莖段切成1.5－2.5cm小段并接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ms+ba0.5+naa0.02+tdz2.0+蔗糖20克+瓊脂5.8)中，先在22-25℃條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，25天左右繼代一次，直至誘導(dǎo)形成叢生芽，叢生芽分化率為11.9；

(3)增殖壯苗培養(yǎng)基：將步驟(2)培養(yǎng)獲得的叢生芽分切至增殖壯苗培養(yǎng)基(1/2ms+ba0.8+naa0.08)上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000lx，培養(yǎng)溫度為22-25℃的條件下培養(yǎng)，25-30天切割一次，多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到高度約為2.5-3.5cm的健壯叢生芽；

(4)生根培養(yǎng)基：將步驟(3)獲得的健壯芽分切接種到生根培養(yǎng)基(1/2ms+naa0.02)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25℃左右條件下暗培養(yǎng)5天，然后置于光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)溫度為22-25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，一般20天就可生根，30天即可出瓶，30天后試管苗高約3.5-5.5cm，有5-8個(gè)不定根，根系粗壯。

(5)煉苗移栽：將步驟(4)獲得的生長(zhǎng)健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去蓋置于培養(yǎng)室光下煉苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，并用800ppm多菌靈浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠巖＝7：3混合并用1000ppm多菌靈進(jìn)行噴淋過(guò)的基質(zhì)中。放于溫室培養(yǎng)，栽后前5天精心管護(hù)，每天至少分5次給幼苗噴霧澆水，保持葉面濕度，移栽成活率達(dá)80％以上。待幼苗成活后再移栽大田。

實(shí)施例2：

(1)外植體處理和消毒：選擇溫室扦插所發(fā)出的新芽，切取小芽作為外植體先用洗衣粉水浸泡20min，再輕輕清洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗2h后置于超凈工作臺(tái)中。進(jìn)行常規(guī)消毒后帶至超凈工作臺(tái)中。在鼓風(fēng)狀態(tài)下先用70-75％酒精消毒3s后，用無(wú)菌水清洗3-6次，再用0.1％升汞溶液消毒8min后用無(wú)菌水洗4-6次，最后用無(wú)菌紗布或無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水珠后轉(zhuǎn)接到芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用該方法，污染率可以控制在20－30％以內(nèi)。

(2)芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(1)處理后的染井吉野櫻半木質(zhì)化單芽莖段切成1.5－2.5cm小段并接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ms+ba1.0+naa0.02+tdz2.0+蔗糖30克+瓊脂6.5)中，先在22-25℃條件下全暗培養(yǎng)養(yǎng)5天，然后置于每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，15天左右繼代一次，直至誘導(dǎo)形成叢生芽，叢生芽分化率為15.6；

(3)增殖壯苗培養(yǎng)基：將步驟(2)培養(yǎng)獲得的叢生芽分切至增殖壯苗培養(yǎng)基(1/2ms+ba0.5+naa0.05)上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后置于每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000lx，培養(yǎng)溫度為22-25℃的條件下培養(yǎng)，多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到高度約為2.5-3.5cm健壯叢生芽；

(4)生根培養(yǎng)基：將步驟(3)獲得的健壯芽分切接種到生根培養(yǎng)基(1/2ms+naa0.01)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后直接置于25℃左右條件下光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx，培養(yǎng)溫度為22-25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，一般20天就可生根，35天即出瓶；30天后試管苗高約3.5-5.5cm，有5-8個(gè)不定根，根系粗壯。

(5)煉苗移栽：將步驟(4)獲得的生長(zhǎng)健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去蓋置于培養(yǎng)室光下煉苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，并用1000ppm多菌靈浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠巖＝7：3混合并用1000ppm多菌靈進(jìn)行噴淋過(guò)的基質(zhì)中。放于溫室培養(yǎng)，栽后前10天精心管護(hù)，每天至少分5次給幼苗噴霧澆水，保持葉面濕度，移栽成活率達(dá)90％以上。待幼苗成活后再移栽大田。

針對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇，發(fā)明人經(jīng)大量的科學(xué)試驗(yàn)論證選出最適芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)表1。

表1不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基及不同激素組合對(duì)愈傷及不定芽誘導(dǎo)的影響(25天統(tǒng)計(jì)，每種培養(yǎng)基統(tǒng)計(jì)25瓶)

表中：

1號(hào)培養(yǎng)基采用王文房等人在《櫻花花柄的組織培養(yǎng)》(2006)文獻(xiàn)中描述的最佳配方ms+ba3.5+naa0.05，結(jié)果在我們?cè)囼?yàn)過(guò)程中與他們描述的一樣很易形成愈傷，但愈傷不能分化出不定芽，且后期易玻璃化。

2號(hào)或3號(hào)培養(yǎng)基采用賀愛(ài)利等人在《櫻花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展》(2010)提到的黃守印的較好配方1/2ms+ba1.0+iba0.01或1/2ms+kt1.0+iba0.01，在我們的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有一半的外植體可以產(chǎn)生愈傷，但愈傷分化出不定芽較少，為3.4和2.8；

4號(hào)培養(yǎng)基采用孟月娥等人在《一種紅葉櫻花組培快繁培養(yǎng)基及組培快繁方法》(2012)中提到的ms+ba1.0+3％蔗糖，試驗(yàn)結(jié)果是大部分可以產(chǎn)生愈傷，但不能分化出不定芽。

5號(hào)培養(yǎng)基采用蔣細(xì)旺等人在《一種櫻花組織培養(yǎng)和快速繁殖方法》中采用的最佳配方wpm+kt1.5+iba0.2+3％蔗糖，試驗(yàn)結(jié)果是不定芽分化率比較低，只有2.1。

6-9號(hào)培養(yǎng)基是我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)室其他木本植物的成功實(shí)例所進(jìn)行的遞度配方，近一半外植體能產(chǎn)生愈傷，很少的愈傷也能產(chǎn)生不定芽，但不定芽分化率都不超過(guò)5。

10號(hào)培養(yǎng)基是我們?cè)?1-13號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇單用tdz所做的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，單用tdz時(shí)，出愈率不超過(guò)50％，而且不定芽分化率僅為2.8；

11-13號(hào)培養(yǎng)基是我們?cè)?0號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，額外添加0.5、1.0、2.0三個(gè)遞度的ba，發(fā)現(xiàn)隨著ba濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)及不定芽分化率都不斷提高，但當(dāng)ba超過(guò)一定濃度時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率增加，但愈傷不定芽分化率反而又下降，因此我們將ms+ba0.5-1.0+tda2.0+naa0.02作為我們的最佳培養(yǎng)基激素組合。

應(yīng)當(dāng)理解本文所述的例子和實(shí)施方式僅為了說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)它做出各種修改或變化，在不脫離本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)的情況下，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。