本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)，特別涉及一種南方紅豆杉組織培養(yǎng)種苗繁育方法。

背景技術(shù)：

紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物。紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物,也是惟一可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。但是紫杉醇在紅豆杉植物中含量很低，因此市場上對于紅豆杉的需求很高。

紅豆杉植物常規(guī)的繁殖方式主要為扦插和播種兩種繁殖方式。但紅豆杉種子種皮厚，處于深休眠狀態(tài)，自然狀態(tài)下經(jīng)兩冬一夏才能萌發(fā)，天然更新能力弱，使得播種繁殖的難度較大；同時扦插枝條也由于生根條件苛刻，造成生根率較低，扦插成活率低。因此采用傳統(tǒng)的繁殖方式難易滿足紅豆杉的規(guī)?；a(chǎn)。

目前，公開號為cn1454465a的中國專利公開了一種紅豆杉種苗組織培養(yǎng)基及其種苗繁育方法，它包括營養(yǎng)劑、生長促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、微量元素配制而成。并將紅豆杉母體樹的嫩扦枝、或嫩枝（芽）葉經(jīng)機(jī)械粉碎后的組織細(xì)胞漿加入上述培養(yǎng)基中進(jìn)行組培。

這種培養(yǎng)方法未經(jīng)消毒，將嫩枝或嫩芽機(jī)械粉碎后，部分細(xì)胞被攪碎，未經(jīng)消毒殘留的細(xì)菌在恒溫培養(yǎng)的過程中，以破碎細(xì)胞為母體增殖，對培養(yǎng)基造成污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一目的是提供一種南方紅豆杉組織培養(yǎng)種苗繁育方法，其具有減少對培養(yǎng)基的污染的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種南方紅豆杉組織培養(yǎng)種苗繁育方法，步驟為：選取外植體，對外植體進(jìn)行表面消毒，接種到啟動培養(yǎng)基中并給以合適的環(huán)境條件進(jìn)行啟動培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中并給以合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行腋芽增殖培養(yǎng)，對增殖腋芽進(jìn)行分割并轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中給以合適培養(yǎng)條件進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的無根組培苗接種到生根培養(yǎng)基中并給予合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行生根誘導(dǎo)，所剪取的外植體保留有外植體的高增殖能力；

篩選剪取外植體包括如下步驟：

s1：選取外植體并對外植體消毒所需的苗木個體為生長年限為3～4年之間的健壯苗木個體，該苗木無病蟲害、無機(jī)械損傷、無葉片畸形；

s2：選取苗木個體于春季自然萌發(fā)的嫩梢，所述嫩梢中木質(zhì)素低于20%，所述嫩梢中的導(dǎo)管分子處于發(fā)育初期，為活細(xì)胞狀態(tài)；

s3：所選取的嫩梢長度在5cm至10cm之間；

s4：所述嫩梢生長于靠近苗木個體主干處的葉片呈螺旋狀排列的枝條上；

消毒處理包括如下步驟：

s1：采用酒精棉擦拭外植體表面；

s2:剪取擦拭過的外植體，所述外植體帶有葉片、嫩芽；

s3：將剪取的外植體置于流水下沖洗0.5h～1h；

s4：將沖洗后的外植體置于超凈工作臺中，采用醫(yī)用酒精消毒10～60s；

s5：將采用酒精消毒后的外植體采用無菌水沖洗2～4遍；

s6：將沖洗后的外植體采用漂白水消毒30min～60min，所述漂白水由一份體積的商品漂白水添加四份體積的無菌水勾兌配置而成；

s7：將漂白水消毒后的外植體采用無菌水沖洗3～4次。

通過采用上述技術(shù)方案，所選取的外植體中，導(dǎo)管尚未發(fā)育成熟，為活細(xì)胞，能夠分裂增殖，其木薄壁組織對外植體的難以起到阻礙分裂的作用。將外植體消毒能夠有效去除外植體表面的細(xì)菌，減小細(xì)菌污染培養(yǎng)基的可能性；同時，不對外植體進(jìn)行攪碎的操作，能夠減少破碎細(xì)胞的數(shù)量，以便降低細(xì)菌污染外植體的可能性，在后期的培養(yǎng)中，細(xì)菌的數(shù)量少，難以對培養(yǎng)基中的外植體起到污染、損害的作用，以利于外植體正常增殖，提高了實(shí)驗(yàn)成功的可能性，以便得到更高的生根率、成活率，便于批量生產(chǎn)。

進(jìn)一步設(shè)置：根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種南方紅豆杉組織培養(yǎng)種苗繁育方法，其特征在于：將消毒后的外植體置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中啟動培養(yǎng)，啟動培養(yǎng)包括如下步驟：

s1：將消毒后的外植體上部分葉片切除，切除部分為葉片總量的2\3；

s2:將除葉后的外植體切成段狀，每一段的長度限制在1cm～2cm；

s3：將切段后的外植體置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并置于22～25℃室溫下培養(yǎng)；

s4：培養(yǎng)室中設(shè)置光照條件，光照強(qiáng)度范圍為1500lux～2500lux；

s5：培養(yǎng)室中設(shè)置光照條件，光照周期為16小時光照，8小時暗培養(yǎng)；

s6：外植體在恒溫培養(yǎng)室中啟動培養(yǎng)4周～8周，腋芽萌發(fā)。

通過采用上述技術(shù)方案，在允許范圍內(nèi)，將葉片切除越多，外植體上用于葉片生長的能耗越少，所省能量能夠提供給分裂增殖中的細(xì)胞，使其具有充分的養(yǎng)分。留下部分葉片后，這些留下的葉片能夠進(jìn)行光合作用提供養(yǎng)分。20℃～28℃的恒溫為植物生長最合適的溫度，便于細(xì)胞生長。光照的周期性既能夠?qū)崿F(xiàn)植物的光合作用，也能夠?qū)崿F(xiàn)植物的呼吸作用，使植物正常生長，降低植物的死亡率，利于批量生產(chǎn)。

進(jìn)一步設(shè)置：所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分配比如下：

wpm2.7g/l

2ip1.0～3.5mg/l

蔗糖15～45g/l

瓊脂5.5～7.0g/l

所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的溶劑采用水，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為5.50～6.00；

通過采用上述技術(shù)方案，蔗糖為主要營養(yǎng)來源，瓊脂起到固定的作用，使培養(yǎng)基整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，利于植物在培養(yǎng)基中正常生長、利于后期批量成活、批量生產(chǎn)。

進(jìn)一步設(shè)置：對已經(jīng)過啟動培養(yǎng)的外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)包括如下步驟：

s1：將腋芽接種至固體增殖培養(yǎng)基中，并置于22～25℃室溫下培養(yǎng)；

s2：將接種至增殖培養(yǎng)基中的腋芽置于黑暗條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)40h～60h，然后再給予光照；

s3：對暗培養(yǎng)后的腋芽給光，光強(qiáng)范圍為1500～3000lux，光照周期為光照16小時，暗培養(yǎng)8小時；

s4：將腋芽增殖培養(yǎng)4周～8周；獲得團(tuán)芽；

s5：每4～8周將增殖得到的團(tuán)芽分割為單個芽；

s6：將分割得到的單個芽重新接種于固體增殖培養(yǎng)基中。

通過采用上述技術(shù)方案，腋芽具有高增殖性，將整團(tuán)腋芽放置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠盡量保持腋芽的原本的生長狀態(tài)，相較于切開或攪碎的操作，對外植體的損害更小。當(dāng)腋芽增殖到團(tuán)芽時，團(tuán)芽中的細(xì)胞種類已經(jīng)變多，易發(fā)生細(xì)胞變態(tài)，向成熟植株發(fā)展，此時將單個芽重新接種后，能夠繼續(xù)使用增殖能力最高的部分，達(dá)到高效增殖的目的；高效增殖后，成活數(shù)量隨之變多，以達(dá)到批量生產(chǎn)的目的。

進(jìn)一步設(shè)置：所述固體增殖培養(yǎng)基的成分配比如下：

wpm2.7g/l

2ip1.0～3.5mg/l

zt1.5～4.0mg/l

蔗糖20～30g/l

瓊脂5.0～7.0g/l

所述固體增殖培養(yǎng)基的ph值為5.50～6.00。

通過采用上述技術(shù)方案，2ip為異戊烯基腺嘌呤核苷，在生物試劑中，采用該濃度的配方，能夠使腋芽的增殖過程人為可控，增殖倍率為3～4倍，且芽體健壯，玻璃化率低于0.1%。

進(jìn)一步設(shè)置：對增殖得到的團(tuán)芽進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)包括如下步驟：

s1：將增殖培養(yǎng)所得的團(tuán)芽分割后轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基中；

s2：對分割后的團(tuán)芽提供光照，光強(qiáng)范圍為2000lux～3000lux，光照周期為光照16小時，暗培養(yǎng)8小時；

s3：將分割后的團(tuán)芽置于10℃～30℃的環(huán)境中；

s4：將分割后的團(tuán)芽培養(yǎng)5周～7周，得到生長高度為3cm的無根組培苗。

通過采用上述技術(shù)方案，分割后的團(tuán)芽具有高增殖能力，且團(tuán)芽中細(xì)胞種類多，此時細(xì)胞的狀態(tài)已經(jīng)確定，細(xì)胞能夠開始生長，直至團(tuán)芽長成完整植株，得到組培苗。培養(yǎng)5周及以上后，組培苗的生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定，不易發(fā)生死苗等現(xiàn)象，利于植物后期批量成活、批量生產(chǎn)。

進(jìn)一步設(shè)置：所述壯苗培養(yǎng)基的成分配比如下：

1/2wpm1.35g/l

蔗糖20～30g/l

瓊脂5.0～7.0g/l

活性炭0.5～1.0g/l

所述壯苗培養(yǎng)基的ph值為5.50～6.00。

通過采用上述技術(shù)方案，該配方能夠盡量保障團(tuán)芽在長成組培苗的過程中保持穩(wěn)定生長，活性炭的添加起到了吸附能力，使得培養(yǎng)基中的環(huán)境更整潔，利于植物在培養(yǎng)基中正常生長、利于后期批量成活、批量生產(chǎn)。

進(jìn)一步設(shè)置：對組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)包括如下步驟：

s1：選取莖段高度為2cm～4cm的無根組培苗，切取莖段底部0.3cm～0.5cm的莖段，豎直插入生根培養(yǎng)基；

s2：對莖段提供光照，光強(qiáng)范圍為2000lux～3000lux，光照周期為光照16小時，暗培養(yǎng)8小時；

s3：將莖段置于10～20℃的環(huán)境中；

s4：將莖段置于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周～6周；

s5：將莖段所處的環(huán)境替換為：20℃～30℃的環(huán)境，培養(yǎng)4周～8周，部分莖段獲得生根培養(yǎng)組培苗。

通過采用上述技術(shù)方案，生根培養(yǎng)的過程中，需要莖段處的細(xì)胞變態(tài)增殖，且光照周期提供給植物呼吸作用和光合作用的時間，以便植物產(chǎn)生和儲存能量。

作為本實(shí)施例中采用，所述生根培養(yǎng)基的成分配比如下：

wpm2.7g/l

iba0.5～1.0mg/l

2,4-d1.0～2.0mg/l

ac0.5～1.0g/l

蔗糖15～30g/l

瓊脂5.0～7.0g/l

所述生根培養(yǎng)基的ph值為5.50～6.00。

通過采用上述技術(shù)方案，該配方能夠促進(jìn)植物產(chǎn)生的根與植物體結(jié)構(gòu)相連，避免從愈傷組織上產(chǎn)生假性根，且生長出的根粗壯、無側(cè)根，能夠在移栽時降低損傷、快速成活，利于植物在培養(yǎng)基中正常生長、利于后期批量成活、批量生產(chǎn)。

一種南方紅豆杉組織培養(yǎng)種苗繁育方法，步驟為選取外植體，將外植體置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其特征在于：篩選剪取外植體保留有外植體的高增殖能力，再將外植體置于培養(yǎng)基內(nèi)之前，對外植體進(jìn)行消毒處理；

消毒處理包括如下步驟：

s1：調(diào)制消毒液體，所述消毒液體設(shè)置為含有5%～10%濃度雙氧水的無菌水；

s2：將外植體置于消毒液體中消毒10min～30min；

s3：采用無菌濾紙吸干外植體表面明水。

通過采用上述技術(shù)方案，能夠有效去除外植體上大部分的細(xì)菌，吸干表面明水后，還能夠減小明水將培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分沖淡、影響培養(yǎng)基內(nèi)百分比的可能性。這種操作方法能夠有效提高實(shí)驗(yàn)對象的生根率、成活率，相較于科研的高成本培養(yǎng)，這種方法在確保低成本的同時，能夠滿足批量生產(chǎn)的要求，利于商業(yè)化大批量生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：一種南方紅豆杉組織培養(yǎng)種苗繁育方法，依次為：選取外植體、對外植體進(jìn)行消毒、將外植體置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

外植體選取的步驟入下：

選擇生長年限為3～4年苗木個體的春季自然萌發(fā)的未木質(zhì)化的嫩梢，嫩梢取材長度為5～10cm，嫩梢中木質(zhì)素低于20%，其內(nèi)的導(dǎo)管分子處于發(fā)育初期，為活細(xì)胞狀態(tài)；本實(shí)施例中選取靠近主干生長的葉子呈螺旋狀排列的枝條為備用的外植體。

消毒方法包括如下步驟：

用酒精棉擦拭外植體表面灰塵，剪取的帶葉枝條在流水下沖洗0.5～1小時，本實(shí)施例中采用1小時，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺中用75%濃度的醫(yī)用酒精溶液消毒10～60秒，本實(shí)施例中采用30秒，再用無菌水沖洗2～4遍，本實(shí)施例中采用3遍；之后用1:6的漂白水，本實(shí)施例中采用1:4的比例（漂白水為白貓牌超市購買所得，1:4的比例是指1份體積的白貓漂白水勾兌4份體積的無菌水），消毒30～60min，本實(shí)施例中采用40分鐘；無菌水沖洗3～4次，本實(shí)施例中采用3次。

啟動培養(yǎng)步驟如下：

消毒后的外植體將葉片切除一部分，本實(shí)施例中采用切除2/3，外植體切成1cm～2cm的節(jié)段，本實(shí)施例中采用1.5cm，接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為22℃～25℃，本實(shí)施例中采用25℃；光照強(qiáng)度為1500～2500lux，本實(shí)施例中采用2000lux。光周期12～20/8h，本實(shí)施例中采用16/8h，即16小時光照，8小時暗培養(yǎng)；進(jìn)行啟動培養(yǎng)4～8周，本實(shí)施例中采用6周，休眠腋芽萌發(fā)，啟動培養(yǎng)完成；

啟動培養(yǎng)基包括如下配比的組分(以水為溶劑，每升水中含有如下物質(zhì)及濃度，下同)：

wpm2.7g/l

2ip1.0～3.5mg/l

蔗糖15～45g/l

瓊脂5.5～7.0g/l

ph值5.50～6.00，本實(shí)施例中采用5.90；

該配方能夠快速打破腋芽休眠，促進(jìn)腋芽萌發(fā)，同時能夠有效避免愈傷組織的產(chǎn)生。

2ip來源于市售進(jìn)口分裝2ip（中文名“異戊烯基腺嘌呤核苷”藥品，分析純）,烈性細(xì)胞分裂素類物質(zhì)；

增殖培養(yǎng)步驟如下：

將啟動培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽，接種于固體增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為22～25℃，本實(shí)施例中采用25℃，暗培養(yǎng)40～60小時，本實(shí)施例中采用48小時，然后給光照，光照強(qiáng)度范圍為1500～3000lux，本實(shí)施例中采用2000lux，光周期為12～20/8h，本實(shí)施例中采用16/8h，即16小時光照，8小時暗培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)4～8周，本實(shí)施例中采用6周，增殖倍率達(dá)3倍，獲得增殖出的團(tuán)芽，每4周將增殖出的團(tuán)芽分割成單個芽，并重新接種于增殖培養(yǎng)基中，擴(kuò)量增殖；

固體增殖培養(yǎng)基，包括如下配比的組分：

wpm2.7g/l

2ip1.0～3.5mg/l

zt1.5～4.0mg/l

蔗糖20～30g/l

瓊脂5.0～7.0g/l

ph值為5.50～6.00，本實(shí)施例中采用5.90；

2ip來源于市售進(jìn)口分裝2ip藥品，中文名為“異戊烯基腺嘌呤核苷”，分析純，進(jìn)口分裝；

zt來源于市售zt藥品，中文名為玉米素，分析純，進(jìn)口分裝；

該配方能夠保障腋芽增殖人為可控，增殖倍率為3～4倍，且芽體健壯，玻璃化率低于0.1%；

壯苗培養(yǎng)的步驟如下：

將在增殖培養(yǎng)基中增殖出的團(tuán)芽，分割后轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基中，光照2000～3000lux，本實(shí)施例中采用2500lux，光周期12～20/8h，本實(shí)施例中采用16/8h，，即16小時光照，8小時暗培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境溫度范圍為10～30℃，本實(shí)施例中采用20℃，培養(yǎng)5～7周，本實(shí)施例中采用6周，單個芽生長健壯，并且生長高度達(dá)到3cm，獲得壯苗培養(yǎng)的無根組培苗；

壯苗培養(yǎng)基，包括如下配比的組分：

1/2wpm1.35g/l

蔗糖20～30g/l

瓊脂5.0～7.0g/l

活性炭0.5～1.0g/l

ph值為5.50～6.00，本實(shí)施例中采用5.90；

生根培養(yǎng)的步驟如下：

將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的組培苗，高度達(dá)到2～4cm，本實(shí)施例中采用3～4cm的莖段，切除莖段底部0.3～0.5mm的莖段，本實(shí)施例中的切除長度為0.3mm；莖段插入生根培養(yǎng)基8～10mm，且將莖段豎直插入，光照1000～3000lux，本實(shí)施例中采用2000lux，光周期12～20/8h，本實(shí)施例中采用16/8h，即16小時光照，8小時暗培養(yǎng)；環(huán)境溫度為10～30℃，本實(shí)施例中采用18℃，培養(yǎng)2～6周，本實(shí)施例中采用4周；然后培養(yǎng)溫度調(diào)整到20～30℃，本實(shí)施例中采用25℃，再培養(yǎng)4～8周，本實(shí)施例中采用6周；50%的植株具有有效健壯根1～3條，根長20～40mm，無側(cè)根，即獲得生根培養(yǎng)組培苗；生根率為50%。

生根培養(yǎng)基生包括如下配比的組分：

wpm2.7g/l

iba0.5～1.0mg/l

2,4-d1.0～2.0mg/l

ac0.5～1.0g/l

蔗糖15～30g/l

瓊脂5.0～7.0g/l

ph值為5.50～6.00，本實(shí)施例中采用5.90；

iba來源于市售進(jìn)口分裝iba藥品，中文名為吲哚丁酸，分析純；

2,4-d來源于市售進(jìn)口分裝2,4-d藥品，中文名為2,4-二氯苯氧乙酸，分析純；

ac來源于市售進(jìn)口分裝ac藥品，中文名為活性炭，其狀態(tài)為超細(xì)粉末，材質(zhì)為竹炭；

該配方能夠促進(jìn)植物產(chǎn)生的根與植物體結(jié)構(gòu)相連，避免從愈傷組織上產(chǎn)生假性根，且生長出的根粗壯、無側(cè)根，能夠在移栽時降低損傷、快速成活。

實(shí)施例2：與實(shí)施例1的不同之處在于：本實(shí)施例中的消毒方法包括如下步驟：

采用雙氧水或次氯酸鈉消毒，消毒條件為：雙氧水濃度為5%～10%，本實(shí)施例中的濃度采用5%；消毒時間為10～30分鐘，本實(shí)施例中采用15分鐘；次氯酸鈉重量濃度為2%～15%，本實(shí)施例中采用5%，消毒時間為5～30分鐘，本實(shí)施例中采用15分鐘；再用無菌濾紙上吸干表面明水。

上述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實(shí)施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。