本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過飲食誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病動(dòng)物模型的建立方法。
背景技術(shù)：
由于不同動(dòng)物之間存在種屬差異，鼠類需要成本較低，操作方便易行，糖尿病動(dòng)物模型中常選鼠類做為造模對(duì)象。我國患者有90%屬于Ⅱ型糖尿病，針對(duì)Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的構(gòu)造，大多選擇嚙齒類動(dòng)物。哺乳動(dòng)物中靈長類、小型豬等種屬與人類較接近，但因研究造價(jià)高，操作不易，故較少研究。當(dāng)前應(yīng)用廣泛的糖尿病動(dòng)物模型主要分為：實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型、自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因和基因提出糖尿病動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型中最為常見的是鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型。關(guān)于造模過程中STZ的用量并不統(tǒng)一，為了更好的提高造模成功率和降低STZ引起的毒性作用，需要相對(duì)精確地控制STZ的注射劑量。對(duì)于STZ的劑量考量和造模穩(wěn)定性困難較大。注射化學(xué)藥物的劑量較大易造成小鼠死亡，故多選大鼠。有報(bào)道稱SD大鼠糖尿病造模成功率高于Wistar鼠（P＞0.05），且Wistar鼠造模過程中會(huì)出現(xiàn)自發(fā)緩解現(xiàn)象，綜上，本發(fā)明研究對(duì)象選擇為SD大鼠。
自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型主要是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)過任何人工處置，由于基因突變或者在自然條件下發(fā)生的異常表現(xiàn)通過遺傳育種保留下來的動(dòng)物模型。常選擇ob/ob小鼠、db/db小鼠、GK大鼠和CD大鼠等。轉(zhuǎn)基因和基因剔除糖尿病動(dòng)物模型表現(xiàn)為外周胰島素抵抗和β細(xì)胞分泌胰島素功能受損。
本發(fā)明主要是以SD大鼠為研究對(duì)象，模擬2型糖尿病人群不良飲食習(xí)慣（長期高脂高糖飲食的飲食習(xí)慣）所致的Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型，開發(fā)出更接近人類Ⅱ型糖尿病的動(dòng)物模型對(duì)推動(dòng)糖尿病的機(jī)制研究和藥物研發(fā)具有重要意義。目前人群研究發(fā)現(xiàn)糖尿病人群年齡年輕化，本發(fā)明試驗(yàn)中大鼠開始造模周齡換算為人類大約在20歲左右，建模成功時(shí)間換算約為人類35歲左右，這一特點(diǎn)較為符合糖尿病發(fā)病人群特征。
SD大鼠單純高脂高糖飼料誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型在國內(nèi)未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，模擬2型糖尿病人群長期高脂高糖的不良飲食習(xí)慣，提供一種長期高脂高糖飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)單純高脂高糖飲食Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的方法，旨在解決目前各種化學(xué)物造模給動(dòng)物帶來的副作用大，穩(wěn)定性差的問題。
本發(fā)明通過飲食誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病動(dòng)物模型的建立方法，具體方法如下述：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用SPF級(jí)SD大鼠，體重150g±10g，20只/組，雌雄各半；隨機(jī)分為普通飼料對(duì)照組 C、高脂高糖飼料造模組 CH；普通組飼料：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白質(zhì)，12.05%脂肪；高脂高糖組飼料：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白質(zhì)，23.53%脂肪；
實(shí)驗(yàn)監(jiān)測周期為180天，每日按照大鼠體重的10%給予飼料，分組后均進(jìn)行普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后對(duì)照組給予普通飼料，造模組給予高脂高糖飼料；
180天試驗(yàn)期間，每周觀察大鼠一般活動(dòng)狀況及體重變化，每10天監(jiān)測攝食和飲水情況，每30天監(jiān)測體重一次，分別于0周、4周禁食12小時(shí)后尾靜脈取血監(jiān)測空腹血糖水平變化，自第8周開始，每周監(jiān)測一次空腹血糖，并于第90天 OGTT監(jiān)測糖耐量水平；
分別在90天和180天后，每組隨機(jī)選取10只大鼠處死，全自動(dòng)生化分析儀監(jiān)測大鼠血糖、血脂水平，ELISA檢測胰島素水平，取適量胰腺組織做HE染色觀察胰腺病理改變。
本發(fā)明采取長期高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)單純高脂高糖飲食Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的建造，該方法可以更好的模擬人群Ⅱ型糖尿病發(fā)病發(fā)展特征，與化學(xué)性糖尿病造模相比，更具有科學(xué)意義。
具體實(shí)施方式
為了讓本發(fā)明的目的、技術(shù)方案實(shí)施以及優(yōu)勢更加清楚具體，一下結(jié)合發(fā)明實(shí)驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該指出，以下描述內(nèi)容僅僅是針對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明采取長期高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠誘導(dǎo)單純高脂高糖Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的建造，該方法可以更好地模擬人群Ⅱ型糖尿病發(fā)病發(fā)展特征，與化學(xué)性糖尿病造模相比，更具有科學(xué)意義。
本發(fā)明中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF級(jí)SD大鼠，20只雌鼠，20只雄鼠，體重均為（150±10）g，由第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0005。實(shí)驗(yàn)開始實(shí)施之前各組大鼠血糖、體重均無差異（p＞0.05），血糖≤5mmol/L。所有大鼠均飼養(yǎng)于聚丙烯鼠籠，雌雄分籠，5只/籠。動(dòng)物房條件：溫度：20-25℃，濕度：55%-65%，光照周期：12h。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)周期為180天，每日按照10g/100g.BW的攝食量給予飼料。分組后大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)照組給予普通飼料，造模組給予高脂高糖飼料。飼料均由第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通飼料功能比：63.02%碳水化合物，24.93%蛋白質(zhì)，12.05%脂肪；高脂高糖飼料供能比：66.14%碳水化合物，10.33%蛋白質(zhì)，23.53%脂肪。
本發(fā)明試驗(yàn)中，各組大鼠均飲用去離子水，自由飲水。動(dòng)物墊料4天更換一次。動(dòng)物福利均符合“the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animal”要求，所有實(shí)驗(yàn)方案都經(jīng)過中心動(dòng)物福利和使用委員會(huì)的審查和同意。
AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司），TD4X離心機(jī)（重慶松朗儀器有限公司），Aligent 1100高效液相色譜儀（美國Aligent公司），DM4000B顯微鏡觀察（德國Leica Microsystems GmbH公司）。
本發(fā)明試驗(yàn)中，誘導(dǎo)單純高脂高糖飲食Ⅱ型糖尿病大鼠模型詳述如下：
（1） 體重變化
在試驗(yàn)期間，每30天監(jiān)測體重變化。
（2）空腹血糖水平和胰島素水平
在試驗(yàn)期間，分別于0周、4周、8周禁食12小時(shí)后尾靜脈取血監(jiān)測空腹血糖水平變化，自第8周開始，每周監(jiān)測一次空腹血糖；第90天、180天監(jiān)測胰島素水平。
本發(fā)明試驗(yàn)中空腹血糖的檢測均采用血糖儀進(jìn)行檢測，胰島素水平檢測均用大鼠胰島素ELISA試劑盒分析。
a.提前準(zhǔn)備好監(jiān)測所需儀器和試劑，如酶標(biāo)儀、移液槍、ddH2O、和EP管等。
b.血清制備：室溫血液自然凝固4h，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。吸取上清。
c.操作步驟：與大鼠胰島素ELISA試劑盒步驟一致。
d.計(jì)算方法：取標(biāo)準(zhǔn)品OD值除空白孔OD值外作七點(diǎn)圖，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))用curve expert1 .3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，將樣品OD值代入方程式，計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)得樣品實(shí)際濃度。
（3）口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glueose tolerance test，OGTT)
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)于90天 大鼠禁食12h后。按2 mg/kg劑量灌胃,給予50%葡萄糖溶液，分別于葡萄糖負(fù)荷后0 min,15 min，30 min，45 min,60 min，120 min采血用血糖分析儀測定0 min，15 min，30 min，60 min ，120 min血液樣本中的葡萄糖水平，繪制OGTT曲線。
（4）各組大鼠胰腺組織病理改變
本發(fā)明試驗(yàn)中通過HE染色后鏡下觀察胰腺組織的形態(tài)學(xué)變化。
a.大鼠麻醉后，開腹取新鮮胰腺組織，稱取胰腺濕重，計(jì)算胰腺系數(shù)=胰腺重量(g)/體重(g)×100%。取適量胰腺組織于10%多聚甲醛溶液中固定。
b.將固定好的胰腺組織制成5μm 厚的石蠟切片，連續(xù)切片，乙醇梯度脫水，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織病理變化。
本發(fā)明試驗(yàn)中，判斷Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型建造成功的標(biāo)準(zhǔn)：
長期以來，實(shí)驗(yàn)性嚙齒類大、小鼠1 型糖尿病動(dòng)物模型血糖值的確立標(biāo)準(zhǔn)各文獻(xiàn)報(bào)道不一，近年來通過國內(nèi)外學(xué)者的深入研究，已基本傾向于認(rèn)定空腹或非空腹血糖值>11.1 mmol L 或>16.7 mmol L , 還要伴有胰島素抵抗等Ⅱ 型糖尿病特征, 通過灌胃葡萄糖耐量試驗(yàn), 依據(jù)空腹和葡萄糖負(fù)荷后結(jié)果來判斷。
目前, 多數(shù)參照人類Ⅱ 型糖尿病血糖診斷水平，作為實(shí)驗(yàn)性嚙齒類大、小鼠1型糖尿病動(dòng)物模型成模標(biāo)準(zhǔn)。
數(shù)據(jù)錄入SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)方法選擇兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
（6）結(jié)果分析
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：（1）一般情況：實(shí)驗(yàn)過程中C組大鼠精神狀態(tài)，飲水?dāng)z食正常，活動(dòng)靈敏，皮毛潔白，墊料5天更換一次；CH組飲水?dāng)z食變化不明顯，自12周后，行動(dòng)稍顯遲緩，皮毛逐漸泛黃，失去光澤。墊料易潮濕，平均3天更換一次。
（2）體重：在30、60、90、120、150、180天體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但表現(xiàn)出隨著時(shí)間的推移CH組體重均大于C組的趨勢，且差值逐漸增大。
（3）空腹血糖水平：在第0周、4周、8周空腹血糖水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；從第10周開始，CH組血糖值均大于C組（P＜0.05）；從15周開始C組血糖水平（6.17±0.48 mmol/L）正常，CH組血糖水平（10.24±0.90 mmol/L）上升，CH組17周血糖水平（11.19±1.04 mmol/L）,18周CH組血糖水平（12.46±0.64 mmol/L），之后一直維持較高水平。從17周開始，結(jié)合下述OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為糖尿病動(dòng)物模型造模成功。
（4）胰島素水平：90天時(shí)，CH組血清胰島素水平（18.51±0.79 mU/L）低于C組（19.02±0.91 mU/L），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；180天胰島素水平CH組（15.85±0.57 mU/L）低于C組（19.26±0.75 mU/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
（5）OGTT：糖耐量異常。
(6)胰腺病理改變：90天，C組中胰腺組織細(xì)胞胞質(zhì)緊密，排列整齊，未見細(xì)胞水腫、壞死等病變；CH組胰腺組織細(xì)胞胞質(zhì)疏松，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞水腫、壞死，胰腺細(xì)胞出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，少數(shù)胰島體積變小。180天，C組中胰腺組織細(xì)胞胞質(zhì)緊密，排列整齊，少量細(xì)胞可見水腫現(xiàn)象，均無壞死、炎癥細(xì)胞浸潤；CH組胰腺細(xì)胞大面積腫脹、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，胰島體積變小。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇SD大鼠，種屬純正，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最為常見的大鼠類別，該動(dòng)物模型可向外界提供一定的參考。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為長期（180天）嚙齒動(dòng)物單純高脂高糖飲食誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病模型，與人群糖尿病的發(fā)生、發(fā)展較為接近。且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病相關(guān)癥狀和機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變也與人類相似，動(dòng)物模型穩(wěn)定性較好，更有助于糖尿病機(jī)制及藥物治療研究。本實(shí)驗(yàn)分別觀察了90天、180天各指標(biāo)的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明了動(dòng)物模型的穩(wěn)定性。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中高脂高糖飼料的配方，是經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)調(diào)整后的新配方，既符合糖尿病患病危險(xiǎn)人群的膳食結(jié)構(gòu)，也解決了由于配方不合理導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)少食、厭食等狀況出現(xiàn)。
應(yīng)當(dāng)指出，綜上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。