本發(fā)明涉及一種大豆孢囊線蟲抗性篩選方法。

背景技術(shù)：

大豆孢囊線蟲(soybeancystnematode，scn，heteroderaglycinesichinohe)是一種植物寄生線蟲，主要寄生在豆科植物的根部，嚴重阻礙植株的生長，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，造成巨大的經(jīng)濟損失。

目前，選用大豆抗孢囊線蟲品種是最經(jīng)濟有效的手段，而篩選大豆孢囊線蟲抗病品種主要通過溫室盆栽法，即普遍采用的塑料缽柱法和pvc管法，即將滅菌的沙和土按照體積比1:1比例混合后裝入營養(yǎng)缽或pvc管，把1粒大豆種子種植在混合好的沙土中，萌發(fā)后，待子葉展開后接種大豆孢囊線蟲二齡幼蟲，接種21天后，用大量的清水輕柔的沖洗大豆的根部，將泥沙沖洗干凈后統(tǒng)計根上孢囊數(shù)目。

現(xiàn)有方法存在以下問題：1)、由于大豆是種植在沙土中，統(tǒng)計孢囊數(shù)需要用大量的水沖洗，且沖洗時需要格外小心避免孢囊掉落，但仍會有部分孢囊損失，需要大量勞動力，且操作時間長；2)、大豆根不易徹底沖洗干凈，為統(tǒng)計孢囊數(shù)目增加難度，統(tǒng)計出來的孢囊數(shù)平行性差；3)、脫落在土中的雄蟲難以獲得；4)、群體遺傳抗性研究需要進行大批量植株后代篩選，而營養(yǎng)缽以及pvc管占用空間大；5)、試驗過程需要大量的滅菌沙和土，沙和土的運輸、篩選、滅菌和裝灌環(huán)節(jié)多，并且耗時耗人力。另外，對大豆孢囊線蟲侵染、致病機理方面的深入研究過程中，需要大量的大豆孢囊線蟲二齡幼蟲、雌蟲、雄蟲或孢囊，用沙土法繁殖需要空間大，耗時耗力。所以需要一種簡易的，省時省力省空間的培養(yǎng)方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法存在統(tǒng)計孢囊數(shù)目難度大，費時費力，雄蟲難以獲得，培養(yǎng)占用空間大的問題，提供能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法。

本發(fā)明能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法，包括以下步驟：

一、首先將雙層濾紙重疊放置于培養(yǎng)袋內(nèi)，培養(yǎng)袋開口向上，濾紙上部與培養(yǎng)袋開口處高度一致；所述培養(yǎng)袋為扁平的塑料袋；

二、用移液器向培養(yǎng)袋加入無菌水9～11ml，使培養(yǎng)袋中的濾紙充分浸濕，且保證培養(yǎng)袋底部有少量無菌水存留；

三、將大豆幼苗移到浸濕的濾紙上部，使幼苗的根部通過濾紙的空隙放入培養(yǎng)袋中，保持子葉高于培養(yǎng)袋的上邊緣，然后將培養(yǎng)袋豎直放入夾子內(nèi)，每個夾子中放置兩個培養(yǎng)袋，然后將夾子懸掛在培養(yǎng)架上，再將整個培養(yǎng)架置于培養(yǎng)箱中，光照周期為：16h光照，8h黑暗，晝夜溫度分別為24℃和22℃，每天向每個培養(yǎng)袋內(nèi)澆無菌水3-5ml，每三天向每個培養(yǎng)袋內(nèi)澆5～6ml霍格蘭氏營養(yǎng)液，每天保持培養(yǎng)袋底部略有存水，濾紙保持濕潤，第二天存水恰好蒸發(fā)完為宜。

四、植株繼續(xù)生長5-7天，之后從夾子中取出培養(yǎng)袋，向大豆的主根和側(cè)根周圍均勻滴入3ml100條/ml的大豆孢囊線蟲二齡幼蟲懸浮液，然后將培養(yǎng)袋水平放置在培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，24h后取出培養(yǎng)袋豎直放入培養(yǎng)架的夾子中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)光照培養(yǎng)15～21天；

五、用無菌水在培養(yǎng)袋內(nèi)沖洗根表面，然后將培養(yǎng)袋內(nèi)的無菌水收集至滅菌的容器中，完成雄蟲收集，在接種大豆孢囊線蟲21天后，將培養(yǎng)袋內(nèi)的濾紙連同大豆的整個根系取出，剪去地上部分，平鋪在實驗臺上，進行孢囊數(shù)目統(tǒng)計，然后根據(jù)孢囊數(shù)目和感病對照品種的孢囊數(shù)目比較確定大豆孢囊線蟲抗性品種，除去用于統(tǒng)計的孢囊數(shù)的樣品，剩余的樣品在接種大豆孢囊線蟲40-45天收集成熟孢囊，用于后續(xù)的研究。

其中確定大豆孢囊線蟲抗性品種的方法為：根據(jù)schmittandshannon，1992劃分方法，雌蟲指數(shù)(femaleindex，fi)<10為抗，fi＝10-30為中抗，fi＝31-60為中感，fi>60為感病。

進一步的，所述濾紙的長為15～18cm，寬為12～14cm。

進一步的，所述培養(yǎng)袋的長為17～19cm，寬為16～18cm。

進一步的，所述培養(yǎng)袋的材質(zhì)為塑料。

進一步的，所述大豆幼苗為在蛭石中萌發(fā)3-5天的，全株長7～9cm的幼苗。

進一步的，步驟三所述培養(yǎng)架包括底板、側(cè)柱、支撐桿、懸掛桿和提手，所述底板為矩形底板，底板的四個角上分別豎直設(shè)置4個側(cè)柱，所述支撐桿水平設(shè)置在側(cè)柱的上部，支撐桿的兩端分別與相鄰的兩個側(cè)柱固定連接，側(cè)柱上對稱設(shè)置2個支撐桿，所述懸掛桿水平設(shè)置在側(cè)柱的上部，懸掛桿的兩端分別與相鄰的兩個側(cè)柱固定連接，側(cè)柱上對稱設(shè)置2個懸掛桿，所述懸掛桿與支撐桿相鄰，所述支撐桿上部分別設(shè)有提手。

進一步的，所述培養(yǎng)架中懸掛桿的長度為39～40cm，支撐桿的長度為32～33cm。

步驟三所述夾子包括橫梁和本體，所述本體包括上封頁、下封頁和連接上封頁和下封頁的背脊，所述上封頁和下封頁與背脊相反的一側(cè)分別設(shè)有橫梁，所述橫梁的兩段分別設(shè)有掛鉤。

進一步的，所述夾子中背脊的長度為29～30cm，橫梁和背脊之間的距離為23～24cm。

所述夾子放置在培養(yǎng)架上是通過橫梁的兩端搭在兩側(cè)懸掛桿上實現(xiàn)的。

步驟四中所述暗培養(yǎng)的條件為：晝夜溫度分別為24℃和22℃，濕度80％。

步驟四中所述光照培養(yǎng)的條件為：晝夜溫度分別為24℃和22℃，濕度80％，光照周期：16h光照，8h黑暗，光照強度為18000lx。

本發(fā)明的有益效果：

采用本發(fā)明培養(yǎng)大豆孢囊線蟲，可以直接觀測孢囊線蟲發(fā)育狀態(tài)，快速收集干凈的大豆孢囊線蟲雄蟲，統(tǒng)計孢囊數(shù)不需要水沖洗，減少操作步驟，孢囊清晰易于觀察統(tǒng)計，非常直觀，節(jié)省時間、空間和人力，結(jié)果平行性好。

1、本發(fā)明方法無需在沙土中種植，本方法的大豆根無需清洗，統(tǒng)計孢囊數(shù)不需要用水沖洗，不會損失孢囊。操作簡單，用時短，統(tǒng)計出來的孢囊數(shù)平行性好；

2、本方法中雄蟲不會脫落在土中，因此容易獲得；

3、本方法將大豆種植在扁平的培養(yǎng)袋中，無需營養(yǎng)缽以及pvc管，占用空間?。?/p>

4、本方法不需要沙土，省去了運輸、裝罐等環(huán)節(jié)，而且能夠容易的分離大豆孢囊線蟲二齡幼蟲、雌蟲、雄蟲或孢囊，省時省力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明方法中培養(yǎng)架及夾子的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為觀察大豆孢囊線蟲在大豆根部從接種后10天到40天的一個孢囊發(fā)育過程圖；

圖3為從培養(yǎng)袋中收集的干凈的雄蟲；

圖4為本方法培養(yǎng)后的大豆根系照片；

圖5為溫室盆栽法培養(yǎng)后的大豆根系照片。

具體實施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法，包括以下步驟：

一、首先將雙層濾紙重疊放置于培養(yǎng)袋內(nèi)，培養(yǎng)袋開口向上，濾紙上部與生長袋開口處高度一致；

二、用移液器向培養(yǎng)袋加入無菌水9～11ml，使培養(yǎng)袋中的濾紙充分浸濕，且保證培養(yǎng)袋底部有少量無菌水存留；

三、將大豆幼苗移到浸濕的濾紙上部，使幼苗的根部通過濾紙的空隙放入培養(yǎng)袋中，保持子葉高于培養(yǎng)袋的上邊緣，然后將培養(yǎng)袋豎直放入夾子內(nèi)，每個夾子中放置兩個培養(yǎng)袋，然后將夾子懸掛在培養(yǎng)架上，再將整個培養(yǎng)架置于培養(yǎng)箱中，光照周期為：16h光照，8h黑暗，晝夜溫度分別為24℃和22℃，每天向每個培養(yǎng)袋內(nèi)澆無菌水3-5ml，每三天向每個培養(yǎng)袋內(nèi)澆5～6ml霍格蘭氏營養(yǎng)液，每天保持培養(yǎng)袋底部有1～2ml的存水，濾紙保持濕潤；

四、植株繼續(xù)生長5-7天，之后從夾子中取出培養(yǎng)袋，向大豆的主根和側(cè)根周圍均勻滴入3ml100條/ml的大豆孢囊線蟲二齡幼蟲懸浮液，然后將培養(yǎng)袋水平放置在培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)；24h后取出培養(yǎng)袋豎直放入培養(yǎng)架的夾子中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)光照培養(yǎng)15～21天；其中暗培養(yǎng)的條件為：晝夜溫度分別為24℃和22℃，濕度80％；光照培養(yǎng)的條件為：晝夜溫度分別為24℃和22℃，濕度80％，光照周期：16h光照，8h黑暗，光照強度為18000lx；

五、用無菌水在培養(yǎng)袋內(nèi)沖洗根表面，然后將培養(yǎng)袋內(nèi)的無菌水收集至滅菌的容器中，完成雄蟲收集，在接種大豆孢囊線蟲21天后，將培養(yǎng)袋內(nèi)的濾紙連同大豆的整個根系取出，剪去地上部分，平鋪在實驗臺上，進行孢囊數(shù)目統(tǒng)計，然后根據(jù)孢囊數(shù)目和感病對照品種的孢囊數(shù)目比較確定大豆孢囊線蟲抗性品種，除去用于統(tǒng)計的孢囊數(shù)的樣品，剩余的樣品在接種大豆孢囊線蟲40-45天收集成熟孢囊，用于后續(xù)的研究。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述濾紙的長為15～18cm，寬為12～14cm。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述培養(yǎng)袋的長為17～19cm，寬為16～18cm。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述培養(yǎng)袋的材質(zhì)為塑料。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三中所述大豆幼苗為在蛭石中萌發(fā)3-5天的，全株長7～9cm的幼苗。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式六：結(jié)合圖1說明本實施方式，本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三所述培養(yǎng)架包括底板1、側(cè)柱2、支撐桿3、懸掛桿4和提手5，所述底板1為矩形底板，底板1的四個角上分別豎直設(shè)置4個側(cè)柱2，所述支撐桿3水平設(shè)置在側(cè)柱2的上部，支撐桿3的兩端分別與相鄰的兩個側(cè)柱2固定連接，側(cè)柱2上對稱設(shè)置2個支撐桿3，所述懸掛桿4水平設(shè)置在側(cè)柱2的上部，懸掛桿4的兩端分別與相鄰的兩個側(cè)柱2固定連接，側(cè)柱2上對稱設(shè)置2個懸掛桿4，所述懸掛桿4與支撐桿3相鄰，所述支撐桿3上部分別設(shè)有提手5。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式六不同的是：所述培養(yǎng)架中懸掛桿4的長度為39～40cm，支撐桿3的長度為32～33cm。其它與具體實施方式六相同。

具體實施方式八：結(jié)合圖1說明本實施方式，本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三所述夾子包括橫梁6和本體7，所述本體7包括上封頁8、下封頁9和連接上封頁8和下封頁9的背脊10，所述上封頁8和下封頁9與背脊10相對的一側(cè)分別設(shè)有橫梁6，所述橫梁6的兩端分別設(shè)有掛鉤61。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式八不同的是：所述背脊10的長度為29～30cm，橫梁6和背脊10之間的距離為23～24cm。其它與具體實施方式八相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式六至九之一不同的是：所述夾子放置在培養(yǎng)架上是通過橫梁6的兩端搭在兩側(cè)懸掛桿4上實現(xiàn)的。其它與具體實施方式六至九之一相同。

具體實施方式十一：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟五中確定大豆孢囊線蟲抗性品種的方法為：根據(jù)schmittandshannon,1992劃分方法，雌蟲指數(shù)<10為抗，fi＝10-30為中抗，fi＝31-60為中感，fi>60為感病。

下面對本發(fā)明的實施例做詳細說明，以下實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1：

本實施例能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法，具體是按以下步驟完成的：

一、首先將雙層濾紙重疊放置于培養(yǎng)袋內(nèi)，培養(yǎng)袋開口向上，濾紙上部與培養(yǎng)袋開口處高度一致；其中濾紙的長為16cm，寬為12.8cm，培養(yǎng)袋的長為17.8cm，寬為16.5cm；

二、用5ml的移液器向培養(yǎng)袋加入無菌水10ml，使培養(yǎng)袋中的濾紙充分浸濕，且保證培養(yǎng)袋底部有少量無菌水存留；

三、將已在蛭石中萌發(fā)5天的大豆品種東升1號，全株長8cm左右的大豆幼苗移到浸濕的濾紙上部，使幼苗的根部通過濾紙的空隙放入培養(yǎng)袋中，保持子葉高于培養(yǎng)袋的上邊緣，然后將培養(yǎng)袋豎直放入夾子內(nèi)，每個夾子中放置兩個培養(yǎng)袋，然后將夾子懸掛在培養(yǎng)架上，再將整個培養(yǎng)架置于培養(yǎng)箱中，光照周期為：16h光照，8h黑暗，晝夜溫度分別為24℃和22℃，每天向每個培養(yǎng)袋內(nèi)澆無菌水3ml，每三天向每個培養(yǎng)袋內(nèi)澆5ml霍格蘭氏營養(yǎng)液，每天保持培養(yǎng)袋底部略有存水，濾紙保持濕潤，第二天存水恰好蒸發(fā)完為宜。

四、植株繼續(xù)生長6天，側(cè)根長至5cm左右，之后從夾子中取出培養(yǎng)袋，用1ml移液器向大豆的主根和側(cè)根周圍均勻滴入3ml100條/ml的大豆孢囊線蟲二齡幼蟲懸浮液，然后將培養(yǎng)袋水平放置在培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，24h后取出培養(yǎng)袋豎直放入培養(yǎng)架的夾子中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)光照培養(yǎng)20天；其中暗培養(yǎng)的條件為：晝夜溫度分別為24℃和22℃，濕度80％；光照培養(yǎng)的條件為：晝夜溫度分別為24℃和22℃，濕度80％，光照周期：16h光照，8h黑暗，光照強度為18000lx；

五、用無菌水在培養(yǎng)袋內(nèi)沖洗根表面，然后將培養(yǎng)袋內(nèi)的無菌水收集至滅菌的容器中，完成雄蟲收集，在接種大豆孢囊線蟲21天后，將培養(yǎng)袋內(nèi)的濾紙連同大豆的整個根系取出，剪去地上部分，平鋪在實驗臺上，進行孢囊數(shù)目統(tǒng)計，然后根據(jù)孢囊數(shù)目和感病對照品種的孢囊數(shù)目比較確定大豆孢囊線蟲抗性品種，除去用于統(tǒng)計的孢囊數(shù)的樣品，剩余的樣品在接種大豆孢囊線蟲45天收集成熟孢囊，用于后續(xù)的研究。

其中確定大豆孢囊線蟲抗性品種的方法為：根據(jù)schmittandshannon，1992劃分方法，雌蟲指數(shù)(femaleindex，fi)<10為抗，fi＝10-30為中抗，fi＝31-60為中感，fi>60為感病。

另外，以傳統(tǒng)的營養(yǎng)缽培養(yǎng)法作為對照組，營養(yǎng)缽培養(yǎng)法除采用灌裝了沙土的營養(yǎng)缽代替培養(yǎng)袋外，其他培養(yǎng)條件與生長袋培養(yǎng)法一致。

步驟三所述培養(yǎng)架包括底板1、側(cè)柱2、支撐桿3、懸掛桿4和提手5，所述底板1為矩形底板，底板1的四個角上分別豎直設(shè)置4個側(cè)柱2，所述支撐桿3水平設(shè)置在側(cè)柱2的上部，支撐桿3的兩端分別與相鄰的兩個側(cè)柱2固定連接，側(cè)柱2上對稱設(shè)置2個支撐桿3，所述懸掛桿4水平設(shè)置在側(cè)柱2的上部，懸掛桿4的兩端分別與相鄰的兩個側(cè)柱2固定連接，側(cè)柱2上對稱設(shè)置2個懸掛桿4，所述懸掛桿4與支撐桿3相鄰，所述支撐桿3上部分別設(shè)有提手5。

所述培養(yǎng)架中懸掛桿4的長度為39.5cm，支撐桿3的長度為32.5cm。

步驟三所述夾子包括橫梁6和本體7，所述本體7包括上封頁8、下封頁9和連接上封頁8和下封頁9的背脊10，所述上封頁8和下封頁9與背脊10相對的一側(cè)分別設(shè)有橫梁6，所述橫梁6的兩端分別設(shè)有掛鉤61。

所述背脊10的長度為29.8cm，橫梁6和背脊10之間的距離為23.3cm。

所述夾子放置在培養(yǎng)架上是通過橫梁6的兩端搭在兩側(cè)懸掛桿4上實現(xiàn)的。

本實施例所述的100條/ml二齡幼蟲懸浮液為大豆孢囊線蟲(heteroderaglycinesichinohe)。

觀察大豆孢囊線蟲在大豆根部從接種后10天到40天(dpi)的一個孢囊發(fā)育過程如圖2。從培養(yǎng)袋中收集的干凈的雄蟲如圖3。本實施例方法培養(yǎng)后的大豆根系照片如圖4。對照組的溫室盆栽法培養(yǎng)后的大豆根系照片如圖5。

通過計算可知：采用本方法培育相同植株數(shù)量的大豆孢囊線蟲與營養(yǎng)缽培養(yǎng)相比節(jié)省空間約73.5％，同等接種量，相同大豆品種東升1號孢囊數(shù)統(tǒng)計，營養(yǎng)缽培養(yǎng)法統(tǒng)計的孢囊數(shù)范圍35-151個，采用本方法統(tǒng)計的孢囊數(shù)范圍32-68個，雖然最高數(shù)目低于營養(yǎng)缽培養(yǎng)統(tǒng)計的孢囊數(shù)目，但采用該方法孢囊的生長易于觀察，調(diào)查結(jié)果的平行性明顯好于傳統(tǒng)的營養(yǎng)缽法，同時實驗操作時間節(jié)省40％-50％左右。

實施例2：

采用與實施例1相同的方法培養(yǎng)大豆感病對照品種lee、抗病品種peking和抗線2號，同時傳統(tǒng)的營養(yǎng)缽培養(yǎng)法作為對照組。

通過計算可知：同等接種量的情況下，感病對照品種lee統(tǒng)計得到的孢囊數(shù)范圍66-87，抗病品種peking以及抗線2號統(tǒng)計得到的孢囊數(shù)均為0，雖然最高數(shù)目低于營養(yǎng)缽培養(yǎng)統(tǒng)計的孢囊數(shù)目，但抗感能夠很好的被區(qū)分，且采用該方法調(diào)查結(jié)果的平行性明顯好于傳統(tǒng)的營養(yǎng)缽法，同時實驗操作時間節(jié)省40％-50％左右。