本發(fā)明涉及到一種定量和預(yù)測組培苗硝酸鹽代謝能力及氮同位素分餾值的方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

硝酸鹽是植物組織培養(yǎng)過程中一種很重要的氮源，硝酸鹽在植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用。此外，硝酸鹽具有營養(yǎng)和生理調(diào)節(jié)功能。硝酸鹽可以作為大多數(shù)植物種類組織培養(yǎng)的唯一氮源。

硝酸鹽的代謝主要發(fā)生在葉片和根部。然而，在植物組織培養(yǎng)的增殖階段，由于組培苗沒有根的生成。因此，硝酸鹽主要在葉片進行代謝。此外，在硝酸鹽代謝過程中起著重要作用的硝酸還原酶是一種底物誘導(dǎo)酶，硝酸還原酶的活力受到硝酸鹽供應(yīng)的影響。因此，利用組培苗研究植物硝酸鹽代謝能力大小具有很大的優(yōu)勢。定量和預(yù)測組培苗硝酸鹽代謝能力可為植物組培培養(yǎng)基的選擇以及施肥提供科學(xué)依據(jù)。

傳統(tǒng)的植物硝酸鹽代謝能力測定是通過測定植物硝酸還原酶的活力來獲得的。但是，傳統(tǒng)測定硝酸還原酶的方法較為復(fù)雜，且操作繁瑣。而且所需樣品材料較多，這對組織培養(yǎng)的植物來說，葉片材料的供應(yīng)存在較大難度。而目前發(fā)展起來的穩(wěn)定氮同位素技術(shù)圓滿解決組培苗葉片材料不足的缺陷。用于穩(wěn)定氮同位素測定所需的烘干葉片量僅為50μg氮，較少的取樣，不影響組培苗后續(xù)的培養(yǎng)，為組培苗的在線動態(tài)監(jiān)測提供了條件。植物在代謝硝酸鹽的過程中存在氮同位素的分餾現(xiàn)象。在高的硝酸鹽代謝情況下，穩(wěn)定氮同位素的分餾較小。這是因為細胞質(zhì)中的大部分氮源都被代謝，而僅有少量的氮源流回培養(yǎng)基質(zhì)中。因此，我們可通過植物葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值來判斷硝酸鹽的代謝能力。同位素分餾值(δ¹⁵n)是產(chǎn)物的穩(wěn)定氮同位素值與底物穩(wěn)定氮同位素值的差值，即δ¹⁵n＝δ¹⁵nsubstrate-δ¹⁵nproduct。但是，水培或大田種植條件下的植物，由于硝酸鹽的代謝發(fā)生在根部和葉片。因此葉片的穩(wěn)定氮同位素值是根部和葉片代謝硝酸鹽的結(jié)果，通過葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值將不能定量揭示硝酸鹽代謝能力的大小。然而，在組織培養(yǎng)的整個增殖階段，由于組培苗沒有根的生成，因此，硝酸鹽的代謝就僅發(fā)生在葉片。組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值就可判斷硝酸鹽的代謝能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供了一種定量和預(yù)測組培苗硝酸鹽代謝能力的方法，同時，以酶動力學(xué)的米氏方程為模型構(gòu)建組培苗穩(wěn)定氮同位素同化比與硝酸鹽供應(yīng)的關(guān)系，求解得到組培苗在對應(yīng)硝酸鹽濃度下的穩(wěn)定氮同位素同化比，通過穩(wěn)定氮同位素同化比計算出對應(yīng)硝酸鹽濃度下的葉片的穩(wěn)定氮同位素值，從而估算出對應(yīng)硝酸鹽濃度下組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值(δ¹⁵n)。通過估算出的同位素分餾值，即可考察不同硝酸鹽供應(yīng)下的硝酸鹽代謝能力，從而有效管理培養(yǎng)基硝酸鹽的供應(yīng)量。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

它包含以下步驟：

第一，通過組織培養(yǎng)獲得被考察植物的無性系組培苗；

第二，配置不同硝酸鹽濃度的培養(yǎng)基，測定用于配置上述培養(yǎng)基的硝酸鹽藥品的穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nsubstrate；

第三，分別將帶有1個單芽的無性系組培苗接種在上述不同硝酸鹽濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4周以上；

第四，分別取出100mg以上的上述經(jīng)過4周以上培養(yǎng)的無性系組培苗的葉片，測定組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nfoliar；

第五，根據(jù)測定的葉片穩(wěn)定同位素值δ¹⁵nfoliar，計算出各硝酸鹽濃度梯度下穩(wěn)定氮同位素分餾值δ¹⁵n，即δ¹⁵n＝δ¹⁵nsubstrate-δ¹⁵nfoliar；

第六，根據(jù)測定的葉片穩(wěn)定同位素值δ¹⁵nfoliar，計算出各硝酸濃度梯度下的組培苗同位素同化比ps和硝酸鹽代謝能力nsc，穩(wěn)定氮同位素同化比ps等于硝酸鹽代謝能力nsc，它們都是組培苗葉片穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nfoliar與硝酸鹽的穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nsubstrate的比值；

第七，以酶動力學(xué)的米氏方程建立穩(wěn)定氮同位素同化比與硝酸鹽濃度的關(guān)系模型；這里的米氏方程的表達式為：這里的ps為組培苗同位素同化比，c為培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度，psmax和km值為米氏方程的常數(shù)；

第八，依據(jù)上述模型的psmax和km值，并將被考察的培養(yǎng)基中的硝酸鹽濃度值作為c代入上述模型求出被考察的培養(yǎng)基中組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比；

第九，依據(jù)被考察的培養(yǎng)基中組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比ps，確定被考察的培養(yǎng)基中組培苗的硝酸鹽代謝能力nsc，也即nsc＝ps；

第十，根據(jù)被考察的培養(yǎng)基中組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比ps，估算出不同硝酸鹽濃度下的δ¹⁵n，公式為：δ¹⁵n＝δ¹⁵nsubstrate-ps×δ¹⁵nsubstrate。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1)通過穩(wěn)定氮同位素技術(shù)定量組培苗硝酸鹽代謝的能力，需要材料少，為組培苗在線監(jiān)測技術(shù)的實施提供保證。

2)可以進行不同硝酸鹽濃度下組培苗氮同位素分餾值的估算。

3)可以比較不同植物的硝酸鹽代謝能力。

4)本方法采用的步驟少，計算方法簡單。

發(fā)明原理：

植物的硝酸鹽代謝通常發(fā)生在根部和葉片。但是，由于組培苗在增殖階段獨特的生長狀態(tài)，即組培苗在整個增殖階段沒有根的生成。因此，組培苗硝酸鹽的代謝僅發(fā)生在葉片。而硝酸鹽的代謝過程中存在穩(wěn)定氮同位素的分餾。因此，就可通過葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值來確定組培苗的硝酸鹽代謝能力。硝酸鹽的代謝能力與組培苗的氮同位素分餾值成負相關(guān)關(guān)系。因此，硝酸鹽代謝能力越強，組培苗的葉片氮同位素分餾就越??；反之，同位素分餾就越大。

同位素分餾越小時，組培苗葉片的同位素同化比就越大。即葉片的穩(wěn)定氮同位素值就越接近硝酸鹽的穩(wěn)定氮同位素值。同位素分餾越大，組培苗葉片的同位素同化比就越小。而在組培苗葉片硝酸鹽代謝過程中起關(guān)鍵作用的硝酸還原酶是硝酸鹽誘導(dǎo)酶。因為葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值與葉片的硝酸鹽代謝成負相關(guān)。所以葉片的穩(wěn)定氮同位素同化比與硝酸鹽的代謝能力就呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此，通過米氏方程即可構(gòu)建組培苗穩(wěn)定同位數(shù)同化比與硝酸鹽濃度的關(guān)系。這里的米氏方程的表達式為：這里的ps為組培苗同位素同化比，c為培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度，psmax和km值為米氏方程的常數(shù)。

組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值雖然可以用來判斷硝酸鹽代謝能力的大小。但是，這需要測定對應(yīng)硝酸鹽濃度下的組培苗葉片穩(wěn)定氮同位素值，從而計算組培苗葉片氮同位素分餾值來判斷硝酸鹽的同化能力。每個對應(yīng)硝酸鹽濃度下穩(wěn)定氮同位素值的測定將導(dǎo)致經(jīng)濟成本的增加。通過測定不同硝酸鹽濃度下組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素值，計算得到各硝酸鹽濃度下的穩(wěn)定氮同位素同化比，將各硝酸鹽濃度下組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素同化比與對應(yīng)硝酸鹽濃度進行米氏方程曲線擬合，從而求解得到psmax和km。通過計算得到psmax和km值，即可計算在被考察的硝酸鹽濃度下的組培苗穩(wěn)定氮同位素同化比。從而估算出對應(yīng)硝酸鹽濃度下的葉片穩(wěn)定氮同位素值，進而估算在被考察的硝酸鹽濃度下的組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值。最終判斷在被考察的硝酸鹽濃度下的組培苗的硝酸鹽代謝能力。組培苗穩(wěn)定氮同位素分餾值的估算為管理培養(yǎng)基的硝酸鹽提供了技術(shù)支撐。

具體實施方式

本發(fā)明的實施例：

第一步驟，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲取被考察植物的無性系組培苗；通常一個生長良好的芽經(jīng)過4代左右的培養(yǎng)即可獲得大量優(yōu)質(zhì)的無性系組培苗；

第二步驟，配置不同硝酸鹽濃度的培養(yǎng)基，測定用于配置上述培養(yǎng)基的硝酸鹽藥品的穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nsubstrate；

第三步驟，分別將帶有1個單芽的無性系組培苗接種在上述不同硝酸鹽濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5周；

第四步驟，分別取出100mg以上的上述經(jīng)過5周培養(yǎng)的無性系組培苗的葉片，測定組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nfoliar；

第五步驟，根據(jù)測定的葉片穩(wěn)定同位素值δ¹⁵nfoliar，計算出各硝酸鹽濃度梯度下組培苗穩(wěn)定氮同位素分餾值δ¹⁵n，即δ¹⁵n＝δ¹⁵nsubstrate-δ¹⁵nfoliar；

第六步驟，根據(jù)測定的葉片穩(wěn)定同位素值δ¹⁵nfoliar，計算出各硝酸濃度梯度下的組培苗同位素同化比ps和硝酸鹽代謝能力nsc，穩(wěn)定氮同位素同化比ps等于硝酸鹽代謝能力nsc，它們都是組培苗葉片穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nfoliar與硝酸鹽的穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nsubstrate的比值；

第七步驟，以酶動力學(xué)的米氏方程建立穩(wěn)定氮同位素同化比與硝酸鹽濃度的關(guān)系模型；這里的米氏方程的表達式為：這里的ps為組培苗同位素同化比，c為培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度，psmax和km值為米氏方程的常數(shù)；

第八步驟，依據(jù)上述模型的psmax和km值，并將被考察的培養(yǎng)基中的硝酸鹽濃度值作為c代入上述模型求出被考察的培養(yǎng)基中組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比；

第九步驟，依據(jù)被考察的培養(yǎng)基中組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比ps，確定被考察的培養(yǎng)基中組培苗的硝酸鹽代謝能力nsc，也即nsc＝ps；

第十步驟，根據(jù)被考察的培養(yǎng)基中組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比ps，估算出不同硝酸鹽濃度下的δ¹⁵n，公式為：δ¹⁵n＝δ¹⁵nsubstrate-ps×δ¹⁵nsubstrate。

本發(fā)明的實施效果如下：

培養(yǎng)材料：無性系諸葛菜組培苗

培養(yǎng)基配方為：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l，30g/l蔗糖，瓊脂：7.5g/l，ph值：5.8，培養(yǎng)溫度：25±2℃。光周期：12h/d，光照強度：50μmolm^-2s^-1，硝酸鹽的穩(wěn)定氮同位素值為8.08‰，配置硝態(tài)氮的濃度為10mm，20mm，40mm，80mm和120mm,經(jīng)過5周的培養(yǎng)后，無性系諸葛菜組培苗在不同硝酸鹽濃度培養(yǎng)下的葉片氮同位素值δ¹⁵n如表1所示：

表1不同硝酸鹽濃度下諸葛菜葉片的穩(wěn)定氮同位素值

從表可知，隨著硝酸濃度的增加，諸葛菜組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素值逐漸增大。根據(jù)表1諸葛菜葉片穩(wěn)定氮同位素數(shù)據(jù)，分別計算出各硝酸鹽濃度梯度下諸葛菜組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值δ¹⁵n和穩(wěn)定氮同位素同化比ps。計算結(jié)果如表2所示：

表2不同硝酸鹽濃度下諸葛菜組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素分餾值、同化比及硝酸鹽代謝能力

從表2可知，隨著硝酸鹽濃度增加，諸葛菜組培苗穩(wěn)定氮同位素分餾值逐漸減小，穩(wěn)定氮同位素同化比逐漸增大。表2數(shù)據(jù)說明隨著硝酸鹽濃度的增加，諸葛菜組培苗的硝酸鹽代謝能力也逐漸增強。

以酶動力學(xué)的米氏方程建立穩(wěn)定氮同位素同化比與硝酸鹽濃度的關(guān)系模型，求解得到psmax＝0.8258，km＝2.8035(r＝0.9546，p＝0.0115)。因此，我們就可以計算諸葛菜組培苗在其它硝酸鹽濃度下的穩(wěn)定氮同位素同化比，例如5mm，15mm，30mm，60mm，和100mm濃度下的諸葛菜組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比。通過米氏方程計算被考察的不同硝酸鹽濃度下的諸葛菜組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比和硝酸鹽代謝能力如表3所示：

表3通過米氏方程計算得到的被考察的不同硝酸鹽濃度下諸葛菜組培苗的穩(wěn)定氮同位素同化比ps和硝酸鹽代謝能力nsc

因為穩(wěn)定氮同位素同化比是組培苗葉片穩(wěn)定氮同位素值與硝酸鹽穩(wěn)定氮同位素值的比值，因此，通過硝酸鹽的穩(wěn)定氮同位素值，即可估算出不同硝酸鹽濃度下組培苗葉片的穩(wěn)定氮同位素值，從而估算出不同硝酸鹽濃度下組培苗的穩(wěn)定氮同位素分餾值，被考察的不同硝酸鹽濃度下諸葛菜組培苗穩(wěn)定氮同位素分餾值δ¹⁵n和葉片穩(wěn)定氮同位素值δ¹⁵nfoliar如表4所示：

表4不同硝酸鹽濃度下通過計算得到的諸葛菜組培苗同位素分餾值及葉片穩(wěn)定氮同位素值

因此，通過計算得到的諸葛菜組培苗葉片穩(wěn)定氮同位素分餾值，即可根據(jù)實際情況合理選擇培養(yǎng)基硝酸鹽濃度。