本發(fā)明涉及植物栽培領域，特別是一種杈杷果的組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
：杈杷果的果實營養(yǎng)豐富，糖酸比高達39∶1，杈杷果可溶性糖、可溶性固形物及維生素c的含量與常見的栽培果樹相近，含糖量明顯高于刺梨、沙棘和獼猴桃，果實礦質原素含量極高，鈣、鐵、磷、氨基酸含量均高于其它果品，比蘋果高出24倍，鐵的含量比桃高出5倍，磷的含量已是報道過的所有果品之最，且味美爽口濃甜芳香。除食用價值外，杈杷果株形開張小巧，花開芳香，果形特異，果色紅艷嬌嫩透亮，晶瑩剔透，鮮紅如玉，具有很好的觀花、觀果、觀葉的盆栽觀賞價值。杈杷果在我國豫西秦嶺余脈海拔1000米左右有零星少量分布，根系發(fā)達強健，四季均可移栽，成活率達100％，具有頑強的生命力及再生能力，且可長途運輸和郵寄苗木。但是近十余年由于大量濫采濫挖，杈杷果野生資源幾近枯竭，因此推動杈杷果的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展急需快速進行種苗的繁殖培育及資源圃的建立。杈杷果的傳統(tǒng)繁殖采用分枝或用枝條扦插，但這對于短時間、大規(guī)?？焖俜庇捐斯燥@不足。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種杈杷果的組織培養(yǎng)方法，可大規(guī)模培育杈杷果植株幼苗。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案如下：一種杈杷果的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)選取長勢良好果實粗大的植株，截取8～15mm的帶芽莖段或長出不超過7日的嫩葉，用自來水清洗后放入70～75％的乙醇溶液中浸泡20～30s，取出用無菌水清洗3～5次，使用無菌紗布擦干水分后，切成0.4～0.8cm2的小塊，得到外植體；2)配置營養(yǎng)液，放入三角燒瓶中，將步驟1)得到的外植體放入營養(yǎng)液，將三角燒瓶置于往復式搖床上進行培養(yǎng)，將搖床速度設置為60～90r/min，每隔2～3d更換一次營養(yǎng)液，直至長出新芽；3)將步驟2)中長出新芽的外植體放入繼代培養(yǎng)基中，在18～24℃溫度范圍內(nèi)進行變溫培養(yǎng)，每日進行1～2h的二氧化碳施肥，并每日進行12h的光照，光照強度為800-1400lx，每隔3～4d更換一次繼代培養(yǎng)基；4)將步驟3)中長出細根的外植體挑選出來，放入生根培養(yǎng)基中，每日更換生根培養(yǎng)基，并進行6～7h的光照，光照強度為3000～4000lx，培養(yǎng)溫度為20～22℃，直至根系長到3～5cm，得到幼苗；5)將步驟4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚內(nèi)溫度為25～28℃，光照為日光，栽培介質由細砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。優(yōu)選地，步驟1)-4)均在無菌環(huán)境下進行。優(yōu)選地，步驟2)中所述的營養(yǎng)液由以下成分組成：6-芐氨基嘌呤0.6-0.8mg/l、6-糖基氨基嘌呤0.6-0.8mg/l、iaa0.5-1mg、2，4二氯苯氧乙酸0.5-1mg/l、抗壞血酸0.08-0.1g/l、活性炭0.1-0.5g/l、大蒜汁15-25g/l，營養(yǎng)液主要含有細胞分裂素和生長素，另外添加的抗壞血酸和大蒜汁起到殺菌以及補充蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質等營養(yǎng)元素，添加活性炭預防外植體褐變。優(yōu)選地，步驟3)中所述的繼代培養(yǎng)基由以下成分組成：瓊脂10-12g/l、聚乙烯醇0.1-0.15g/l、脫落酸0.1-0.15mg/l、甘蔗汁8-12g/l、2，4二氯苯氧乙酸2-2.2mg/l、6-芐氨基嘌呤0.4-0.6mg/l，以大量生長素和少量細胞分裂素為主，添加甘蔗汁提供能量源，添加脫落酸預防外植體玻璃化。優(yōu)選地，步驟4)中所述的生根培養(yǎng)基由以下成分組成：iaa2-2.2mg/l、kt1.8-2mg/l、碳酸鈣1.5-3g/l、硫酸鎂0.2-0.3g/l、酵母粉0.4-0.6g/l、瓊脂12-15g/l、牛肉膏0.3-0.4g/l，去除細胞分裂素，優(yōu)化生長素的配比，添加牛肉膏等營養(yǎng)成分，誘導生根。優(yōu)選地，步驟5)中所述的栽培介質在使用前需經(jīng)過1.5-2h高溫烘烤。本發(fā)明的有益效果：利用植物細胞的全能性，挑選強壯的植株作為外植體，可以大量培育具有優(yōu)良基因的杈杷果幼苗，第一階段初代培養(yǎng)使用營養(yǎng)液誘導外植體分裂，在營養(yǎng)液中加入抗壞血酸和大蒜汁起到殺菌以及補充蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質等營養(yǎng)元素的作用；第二階段繼代培養(yǎng)，每日進行二氧化碳施肥，即在培養(yǎng)環(huán)境中充入二氧化碳氣體，并控制光照強度與光照時間，加速杈杷果外植體的生長；第三階段以大量生長素和少量細胞分裂素為主，使用甘蔗汁提供能量源，生根效果顯著；控制各個培養(yǎng)階段的溫度、光照、營養(yǎng)素等條件，短時間內(nèi)可培育出大量的杈杷果植株。具體實施方式下面結合以下具體實施方式對本發(fā)明做進一步的詳細描述。實施例1一種杈杷果的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)選取長勢良好果實粗大的植株，截取10mm的帶芽莖段，用自來水清洗后放入70％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用無菌水清洗3次，使用無菌紗布擦干水分后，切成0.5cm2的小塊，得到外植體；2)配置營養(yǎng)液，營養(yǎng)液中溶質為6-芐氨基嘌呤1.5mg/l、2，4二氯苯氧乙酸1mg/l，溶劑為100ml無菌水，放入三角燒瓶中，將步驟1)得到的外植體放入營養(yǎng)液，將三角燒瓶置于往復式搖床上進行培養(yǎng)，將搖床速度設置為80r/min，每隔2d更換一次營養(yǎng)液，直至長出新芽；3)將步驟2)中長出新芽的外植體放入繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基成分為：瓊脂10g/l、聚乙烯醇0.1g/、葡萄糖5g/l、2，4二氯苯氧乙酸2mg/l、6-芐氨基嘌呤0.4mg/l。在18～24℃溫度范圍內(nèi)進行變溫培養(yǎng)，每日進行1.5h的二氧化碳施肥，并每日進行12h的光照，光照強度為1000lx，每隔3d更換一次繼代培養(yǎng)基；4)將步驟3)中長出細根的外植體挑選出來，放入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為wpm培養(yǎng)基，每日更換生根培養(yǎng)基，并進行6h的光照，光照強度為3000lx，培養(yǎng)溫度為22℃，直至根系長到3～5cm，得到幼苗；5)將步驟4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚內(nèi)溫度為26℃，光照為日光，栽培介質由細砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。步驟1)-步驟4)均在無菌環(huán)境下進行。實施例2一種杈杷果的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)選取長勢良好果實粗大的植株，截取10mm的帶芽莖段，用自來水清洗后放入70％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用無菌水清洗3次，使用無菌紗布擦干水分后，切成0.5cm2的小塊，得到外植體；2)配置營養(yǎng)液，在100ml無菌水中加入6-芐氨基嘌呤1.5mg/l、2，4二氯苯氧乙酸1mg/l、活性炭0.2g/l，放入三角燒瓶中，將步驟1)得到的外植體放入營養(yǎng)液，將三角燒瓶置于往復式搖床上進行培養(yǎng)，將搖床速度設置為80r/min，每隔2d更換一次營養(yǎng)液，直至長出新芽；3)將步驟2)中長出新芽的外植體放入繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基為wpm培養(yǎng)基+naa0.1mg/l，在18～24℃溫度范圍內(nèi)進行變溫培養(yǎng)，每日進行1.5h的二氧化碳施肥，并每日進行12h的光照，光照強度為1000lx，每隔3d更換一次繼代培養(yǎng)基；4)將步驟3)中長出細根的外植體挑選出來，放入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基成分為：iaa2mg/l、kt1.8mg/l、碳酸鈣2g/l、硫酸鎂0.2g/l、瓊脂12-15g/l，每日更換生根培養(yǎng)基，并進行6h的光照，光照強度為3000lx，培養(yǎng)溫度為22℃，直至根系長到3～5cm，得到幼苗；5)將步驟4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚內(nèi)溫度為26℃，光照為日光，栽培介質由細砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。步驟1)-步驟4)均在無菌環(huán)境下進行。實施例3一種杈杷果的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)選取長勢良好果實粗大的植株，截取10mm的帶芽莖段，用自來水清洗后放入70％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用無菌水清洗3次，使用無菌紗布擦干水分后，切成0.5cm2的小塊，得到外植體；2)配置營養(yǎng)液，營養(yǎng)液由以下成分組成：6-芐氨基嘌呤0.6mg/l、6-糖基氨基嘌呤0.6mg/l、iaa0.5mg、2，4二氯苯氧乙酸0.5mg/l、抗壞血酸0.08g/l、活性炭0.1g/l、大蒜汁15g/l，放入三角燒瓶中，將步驟1)得到的外植體放入營養(yǎng)液，將三角燒瓶置于往復式搖床上進行培養(yǎng)，將搖床速度設置為80r/min，每隔2d更換一次營養(yǎng)液，直至長出新芽；3)將步驟2)中長出新芽的外植體放入繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基由以下成分組成：瓊脂10g/l、聚乙烯醇0.1g/l、脫落酸0.1mg/l、甘蔗汁8g/l、2，4二氯苯氧乙酸2mg/l、6-芐氨基嘌呤0.4mg/l，在18～24℃溫度范圍內(nèi)進行變溫培養(yǎng)，每日進行1.5h的二氧化碳施肥，并每日進行12h的光照，光照強度為1000lx，每隔3d更換一次繼代培養(yǎng)基；4)將步驟3)中長出細根的外植體挑選出來，放入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基的成分為：iaa2.1mg/l、kt1.8mg/l、碳酸鈣1.8g/l、硫酸鎂0.25g/l、酵母粉0.5g/l、瓊脂13g/l、牛肉膏0.35g/l，每日更換生根培養(yǎng)基，并進行6h的光照，光照強度為3000lx，培養(yǎng)溫度為22℃，直至根系長到3～5cm，得到幼苗；5)將步驟4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚內(nèi)溫度為25～28℃，光照為日光，栽培介質由細砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。步驟1)-4)均在無菌環(huán)境下進行。表1實施例1～3各個階段情況對比實施例長出新芽耗時/h生根用時/h成苗率/％實施例1283693.81實施例2273094.14實施例3222899.47采用本發(fā)明的組織培養(yǎng)方法得到的杈杷果幼苗存活率均較高，以實施例3為最優(yōu)選實施方案。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不是對本發(fā)明專利范圍的限制，凡屬于本發(fā)明思路下的技術方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12