本發(fā)明屬于十字花科蔬菜育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法。

技術(shù)背景

大白菜是我國種植面積最大的蔬菜之一，也是北方冬儲數(shù)量最大的蔬菜之一，在均衡市場供應(yīng)、穩(wěn)定蔬菜價(jià)格等方面具有舉足輕重的作用。大白菜還具有品質(zhì)肉嫩、清淡可口、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛。

隨著人民生活水平的日益提高，消費(fèi)者的需求不斷變化，人們希望在每個季節(jié)都能吃到新鮮可口、營養(yǎng)豐富、花色品種多樣的“國菜”大白菜。新品種選育應(yīng)與市場緊密結(jié)合，培育小型白菜、娃娃菜、快菜和彩色大白菜等多種類型，以及耐抽薹、耐熱反季節(jié)栽培的春、夏大白菜補(bǔ)淡品種，以滿足大白菜的周年供應(yīng)及多樣化需求。因此，反季節(jié)、早熟大白菜種質(zhì)的挖掘、改良、創(chuàng)新和快速鑒定，是目前迫切需要解決的問題之一。

大白菜具有非常明顯的雜種優(yōu)勢，雜種一代的生產(chǎn)主要利用自交不親和系和雄性不育系兩條途徑。國內(nèi)60年代末開始研究利用自交不親和性生產(chǎn)f1雜種并應(yīng)用于生產(chǎn)，但是由于自交不親和系的繁殖主要依靠人工蕾期授粉，多代自交易出現(xiàn)生活力衰退、親本種子成本高，制種技術(shù)難度大及雜交種難以達(dá)到100％等缺陷，而利用雄性不育系生產(chǎn)一代雜種則可以解決上述問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法。該方法得到的大白菜材料品種早熟、耐熱、綜合抗病能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣，為配制早熟耐熱抗病大白菜新品種奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的

一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，包括以下步驟：

(1)采用游離小孢子培養(yǎng)方法得到早熟自交親和系回交父本；

(2)以甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育材料oguracms為回交母本，以步驟(1)得到的大白菜早熟自交親和系回交父本為父本，通過種間雜交獲得轉(zhuǎn)育一代種子f1；

(3)在田間播種步驟(2)得到的一代種子f1，選擇田間表現(xiàn)性狀與步驟(2)所述的回交父本一致的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(4)采用步驟(3)選擇的回交母本與步驟(2)所述的回交父本通過回交得到轉(zhuǎn)育二代種子tymsbc1；

(5)在田間播種步驟(4)所得到的轉(zhuǎn)育二代種子tymsbc1，選擇田間表現(xiàn)性狀與步驟(2)所述的回交父本一致的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(6)采用步驟(5)選擇的回交母本與步驟(2)所述的回交父本通過回交得到轉(zhuǎn)育三代種子tymsbc2；

(7)重復(fù)上述步驟，經(jīng)過7代回交轉(zhuǎn)育得到大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tymsbc7。

(8)對步驟(7)得到的大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料進(jìn)行田間性狀鑒定；

所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，步驟(1)所述的早熟自交親和系回交父本包括y231-330、y66-9、zy15、y177-28和y152-3。

所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，步驟(1)所述的游離小孢子培養(yǎng)方法包括以下步驟：

a.從供體植株主花序或頂部分枝花序上取2.0～4.0mm長的花蕾，在顯微鏡下鏡檢小孢子以確定其發(fā)育時(shí)期；

b.經(jīng)過步驟a確定之后，選取小孢子處于單核中期至雙核初期的花蕾(花蕾的長度為2.0～3.0mm)，然后用體積濃度為75％的酒精浸泡30s、用質(zhì)量濃度為0.1％的hgcl2消毒5min，再用無菌水沖洗3～5次；

c.將步驟b處理之后的花蕾置于10ml試管中，并加入keller-13沖洗液3～5ml，用玻璃棒擠破花蕾散出小孢子，將得到的小孢子懸浮液用400濾網(wǎng)過濾、收集濾液；

d.將步驟c收集的濾液在600r/min的轉(zhuǎn)速下離心3min，沉降小孢子、棄去上清液；然后再加入keller-13沖洗液，重新懸浮小孢子，離心，沉降，棄去上清液，重復(fù)離心三次，棄去上清液、得到沉降小孢子；

e.在步驟d離心之后，最終得到的沉降小孢子中加入nln-10～13培養(yǎng)液得到小孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整小孢子濃度為1×105個/ml；將得到的小板子懸浮液分裝至60×15mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中2ml，用parafilm膜封口；

f.將步驟e封裝好的小孢子放入33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)入25℃下黑暗培養(yǎng)；培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)小孢子胚數(shù)目，分化培養(yǎng)基，形成小植株，田間授粉采種保存。

所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜材料的選育方法，步驟b所述的選取小孢子處于單核中期至雙核初期的花蕾長度為2.0～3.0mm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下積極有益效果

(1)以甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育材料oguracms為母本，同時(shí)與y231-330、y66-9、zy15、y177-28、y152-3等多份自交系進(jìn)行雜交、回交，田間鑒定，花期通過肉眼觀察花開植株，開花正常，雄蕊癟，無花粉，不育性穩(wěn)定，不育株率和不育度均達(dá)到100％；

(2)tyms231-330為母本，y18-58為父本進(jìn)行雜交，田間制種tyms231-330與y18-58比例為4：2，花期結(jié)束，拔除父本，生產(chǎn)出的雜交一代種子，純度為100％，因此能在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用；

(3)本發(fā)明育成甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育系的方法簡單、周期短、效率高，不育性穩(wěn)定，不育株率和不育度達(dá)到100％，可為大白菜或小白菜雄性不育育種提供鑒定；

(4)本發(fā)明的大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tyms231-330的花朵與保持系相比，花瓣小，花藥干癟、纖瘦、退化成短絲狀，無花粉，雄蕊和花藥長度明顯變短，在顯微鏡下觀察，找不到花粉。子房外觀與保持系基本相同，結(jié)構(gòu)、功能正常，蜜腺數(shù)量與保持系相同，發(fā)育正常，芳香，能吸引蜜蜂等昆蟲正常傳粉。tyms231-330綜合園藝性狀與保持系相同。早熟、耐熱、抗性強(qiáng)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖；

圖2為大白菜不育型種質(zhì)材料tyms231-330的dna電泳條帶圖；

圖3為大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tyms231-330和回交父本材料y231-330的田間種植性狀對比圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，但是并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法之一，包括以下步驟：

(1)采用游離小孢子培養(yǎng)方法得到早熟自交親和系回交父本y231-330(基因型aa)(已在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子資源中期庫保存，保藏號：s01a0057)；

(2)以甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育材料oguracms(其基因型為aacc)為母本，以步驟(1)得到的大白菜早熟自交親和系回交父本y231-330為父本，通過種間雜交獲得轉(zhuǎn)育一代種子f1(基因型aac)；

(3)在田間播種步驟(2)得到的一代種子f1，選擇田間表現(xiàn)性狀與步驟(2)所述的回交父本一致(即后代全部不育)的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(4)采用步驟(3)選擇的回交母本與回交父本y231-330通過回交得到轉(zhuǎn)育二代種子tyms231-330bc1；

(5)在田間播種轉(zhuǎn)育二代種子tyms231-330bc1，選擇田間表現(xiàn)性狀與回交父本y231-330一致的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(6)采用步驟(5)選擇的回交母本與回交父本y231-330通過回交得到轉(zhuǎn)育三代種子tyms231-330bc2；

(7)重復(fù)上述步驟，經(jīng)過7代回交轉(zhuǎn)育得到大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tyms231-330。

其中，所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，步驟(1)所述的游離小孢子培養(yǎng)方法包括以下步驟：

a.從供體植株主花序或頂部分枝花序上取2.0～4.0mm長的花蕾，在顯微鏡下鏡檢小孢子以確定其發(fā)育時(shí)期；

b.經(jīng)過步驟a確定之后，選取小孢子處于單核中期至雙核初期的花蕾(花蕾的長度為2.0～3.0mm)，然后用體積濃度為75％的酒精浸泡30s、用質(zhì)量濃度為0.1％的hgcl2消毒5min，再用無菌水沖洗3～5次；

c.將步驟b處理之后的花蕾置于10ml試管中，并加入keller-13沖洗液3～5ml，用玻璃棒擠破花蕾散出小孢子，將得到的小孢子懸浮液用400濾網(wǎng)過濾、收集濾液；

d.將步驟c收集的濾液在600r/min的轉(zhuǎn)速下離心3min，沉降小孢子、棄去上清液；然后再加入keller-13沖洗液，重新懸浮小孢子，離心，沉降，棄去上清液，重復(fù)離心三次，棄去上清液、得到沉降小孢子；

e.在步驟d離心之后，最終得到的沉降小孢子中加入nln-10～13培養(yǎng)液得到小孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整小孢子濃度為1×105個/ml；將得到的小板子懸浮液分裝至60×15mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中2ml，用parafilm膜封口；

f.將步驟e封裝好的小孢子放入33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)入25℃下黑暗培養(yǎng)；培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)小孢子胚數(shù)目，分化培養(yǎng)基，形成小植株，田間授粉采種保存。

實(shí)施例2

一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法之二，包括以下步驟：

(1)采用游離小孢子培養(yǎng)方法得到早熟自交親和系回交父本y66-9(已在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子資源中期庫保存，保藏號s01a0061)(其基因型aa)；

(2)以甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育材料oguracms(其基因型aacc)為母本，以步驟(1)得到的大白菜早熟自交親和系回交父本y66-9為父本，通過種間雜交獲得轉(zhuǎn)育一代種子f1(基因型aa)；

(3)在田間播種步驟(2)得到的一代種子f1，選擇田間表現(xiàn)性狀與回交父本y66-9一致(后代全部不育)的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(4)采用步驟(3)選擇的回交母本與回交父本y66-9通過回交得到轉(zhuǎn)育二代種子tyms66-9bc1；

(5)在田間播種轉(zhuǎn)育二代種子tyms66-9bc1，選擇田間表現(xiàn)性狀與回交父本y66-9一致的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(6)采用步驟(5)選擇的回交母本與回交父本y66-9通過回交得到轉(zhuǎn)育三代種子tyms66-9bc2；

(7)重復(fù)上述步驟，經(jīng)過7代回交轉(zhuǎn)育得到大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tyms66-9。

其中，所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，步驟(1)所述的游離小孢子培養(yǎng)方法包括以下步驟：

a.從供體植株主花序或頂部分枝花序上取2.0～4.0mm長的花蕾，在顯微鏡下鏡檢小孢子以確定其發(fā)育時(shí)期；

b.經(jīng)過步驟a確定之后，選取小孢子處于單核中期至雙核初期的花蕾(花蕾的長度為2.0～3.0mm)，然后用體積濃度為75％的酒精浸泡30s、用質(zhì)量濃度為0.1％的hgcl2消毒5min，再用無菌水沖洗3～5次；

c.將步驟b處理之后的花蕾置于10ml試管中，并加入keller-13沖洗液3～5ml，用玻璃棒擠破花蕾散出小孢子，將得到的小孢子懸浮液用400濾網(wǎng)過濾、收集濾液；

d.將步驟c收集的濾液在600r/min的轉(zhuǎn)速下離心3min，沉降小孢子、棄去上清液；然后再加入keller-13沖洗液，重新懸浮小孢子，離心，沉降，棄去上清液，重復(fù)離心三次，棄去上清液、得到沉降小孢子；

e.在步驟d離心之后，最終得到的沉降小孢子中加入nln-10～13培養(yǎng)液得到小孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整小孢子濃度為1×105個/ml；將得到的小板子懸浮液分裝至60×15mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中2ml，用parafilm膜封口；

f.將步驟e封裝好的小孢子放入33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)入25℃下黑暗培養(yǎng)；培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)小孢子胚數(shù)目，分化培養(yǎng)基，形成小植株，田間授粉采種保存。

實(shí)施例3

一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，包括以下步驟：

(1)采用游離小孢子培養(yǎng)方法得到早熟自交親和系回交父本zy15(已在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子資源中期庫保存，保藏號s01a0060)(基因型aa)；

(2)以甘藍(lán)型油菜胞質(zhì)雄性不育材料oguracms(基因型aacc)為母本，以步驟(1)得到的大白菜早熟自交親和系回交父本zy15為父本，通過種間雜交獲得轉(zhuǎn)育一代種子f1(基因型aa)；

(3)在田間播種步驟(2)得到的一代種子f1，選擇田間表現(xiàn)性狀與回交父本zy15一致的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(4)采用步驟(3)選擇的回交母本與回交父本zy15通過回交得到轉(zhuǎn)育二代種子tymszy15bc1；

(5)在田間播種轉(zhuǎn)育二代種子tymszy15bc1，選擇田間表現(xiàn)性狀與回交父本zy15一致的優(yōu)良不育單株作為下一輪的回交母本；

(6)采用步驟(5)選擇的回交母本與回交父本zy15通過回交得到轉(zhuǎn)育三代種子tymszy15bc2；

(7)重復(fù)上述步驟，經(jīng)過7代回交轉(zhuǎn)育得到大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tymszy15。

其中，所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法，步驟(1)所述的游離小孢子培養(yǎng)方法包括以下步驟：

a.從供體植株主花序或頂部分枝花序上取2.0～4.0mm長的花蕾，在顯微鏡下鏡檢小孢子以確定其發(fā)育時(shí)期；

b.經(jīng)過步驟a確定之后，選取小孢子處于單核中期至雙核初期的花蕾(花蕾的長度為2.0～3.0mm)，然后用體積濃度為75％的酒精浸泡30s、用質(zhì)量濃度為0.1％的hgcl2消毒5min，再用無菌水沖洗3～5次；

c.將步驟b處理之后的花蕾置于10ml試管中，并加入keller-13沖洗液3～5ml，用玻璃棒擠破花蕾散出小孢子，將得到的小孢子懸浮液用400濾網(wǎng)過濾、收集濾液；

d.將步驟c收集的濾液在600r/min的轉(zhuǎn)速下離心3min，沉降小孢子、棄去上清液；然后再加入keller-13沖洗液，重新懸浮小孢子，離心，沉降，棄去上清液，重復(fù)離心三次，棄去上清液、得到沉降小孢子；

e.在步驟d離心之后，最終得到的沉降小孢子中加入nln-10～13培養(yǎng)液得到小孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整小孢子濃度為1×105個/ml；將得到的小板子懸浮液分裝至60×15mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中2ml，用parafilm膜封口；

f.將步驟e封裝好的小孢子放入33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)入25℃下黑暗培養(yǎng)；培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)小孢子胚數(shù)目，分化培養(yǎng)基，形成小植株，田間授粉采種保存。

實(shí)施例4

對實(shí)施例1所得到的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種子tyms231-330進(jìn)行鑒定，包括以下步驟：

(1)根據(jù)oguracms的特異基因orfl38的全長序列設(shè)計(jì)引物序列，所述的引物序列如下：

正向引物：gtcgttatcgacctcgcaac

反向引物：caattgggttcacaaagcat；

(2)采用常用的ctab法提取tyms231-330種子中的dna以及父本材料y231-330種子中的dna，以及并以步驟(1)所述的引物對為引物分別對tyms231-330種子中的dna以及父本材料y231-330種子中的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增步驟如下：

pcr反應(yīng)體系共20μl，其成分及比例如下：10×taqbuffer(mg²⁺plus)2μl；dntpmix(10mmeach)0.4μl；taqdnapolymerase(5u/μl)0.1μl；ddh2o13.9μl；正反向引物共0.8μl；模板dna2μl，加雙蒸餾水補(bǔ)足；

pcr反應(yīng)程序共分為7步，第1步：94℃預(yù)變性5min；第2步：94℃變性50s；第3步：55℃退火50s；第4步：72℃延伸50s；第5步：從第2步重復(fù)35個循環(huán)；第6步：72℃延伸5min；第7步：12℃低溫保存。擴(kuò)增結(jié)果圖如圖1所示。

由圖1可以看出，在550bp附近能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出單一條帶，而在父本材料y231-330中未擴(kuò)增出條帶。即tyms為oguracms不育性穩(wěn)定，不育度為100％，不受環(huán)境條件的影響，易于找到保持系、找不到恢復(fù)系。

同理，采用該方法對實(shí)施例2、實(shí)施例3得到的細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料tyms66-9、tymszy15進(jìn)行鑒定，其不育度均為100％，且不受環(huán)境條件影響，易于找到保持系、找不到恢復(fù)系。

應(yīng)用實(shí)施例5

該實(shí)施例為所得到tyms231-330種子(已在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子資源中期庫保存，保藏號為s01a0058)的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)以本發(fā)明得到的tyms231-330為母本、y18-58(已在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子資源中期庫保存，保藏號為s01a0059)為父本進(jìn)行雜交，田間制種tyms231-330與y18-58比例為4:2(即田間種植4行tyms231-330、2行y18-58，按照該比例進(jìn)行種植)；

(2)花期結(jié)束后，拔除父本，生產(chǎn)的雜交一代種子的純度為100％。

應(yīng)用實(shí)施例6

將實(shí)施例1經(jīng)過7代回交轉(zhuǎn)育得到大白菜胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)材料tyms231-330和回交父本材料y231-330于秋季同時(shí)播種于田間，從苗期到結(jié)球期進(jìn)行田間對比，如圖3所示，tyms231-330與y231-330表現(xiàn)一致，生長勢中等，外葉深綠色，無茸毛,葉球矮樁疊抱，卵圓形，單球質(zhì)量0.6kg，抗熱性強(qiáng)。

sequencelisting

<110>河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所

<120>一種細(xì)胞質(zhì)雄性不育早熟大白菜種質(zhì)材料的選育方法

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<223>反向引物

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