葉綠體dna的snp標記鑒定大豆雄性不育細胞質方法
【專利摘要】發(fā)明提供了一種葉綠體DNA的SNP標記鑒定大豆雄性不育細胞質方法，該方法也可應用于區(qū)分大豆細胞質雄性不育系和含有正常細胞質的保持系。該方法包括如下步驟，提取大豆細胞質雄性不育系和其配套的保持系種子基因組DNA作為擴增模板，選用4對葉綠體DNA的SNPs標記，在4對SNPs的側翼序列分別設計1對引物進行PCR擴增。擴增的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶酶切，通過不育系和保持系酶切產(chǎn)物長度不同進行鑒定。上述方法可以快速、準確地鑒定大豆細胞質雄性不育細胞質和正常可育細胞質；也可用于檢測不育系（含有不育細胞質）繁殖過程中，混雜的保持系（含有可育細胞質），為保證大豆不育系種子生產(chǎn)過程中純度要求提供保障。
【專利說明】葉綠體DNA的SNP標記鑒定大豆雄性不育細胞質方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明提供了一種葉綠體DNA的SNP標記鑒定大豆雄性不育細胞質方法，用于鑒定大豆雄性不育細胞質和正?？捎毎|，也可應用于區(qū)分大豆細胞質雄性不育系制種過程中不育系(含有不育細胞質)里混入的父本保持系(含有可育細胞質)，屬于分子標記檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]大豆細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS) “三系”由不育系、保持系和恢復系組成，雄性不育細胞質的載體是不育系，而雄性可育細胞質的載體是保持系。吉林省農(nóng)業(yè)科學院首先育成了大豆CMS “三系”。CMS被廣泛應用于農(nóng)作物雜種優(yōu)勢利用，其最大的優(yōu)點是可以在制種時母本行獲得100%不育株，雄性不育系可以免除人工去雄，節(jié)約人力，降低種子成本，還可保證種子的純度。
[0003]盡管雜交大豆能大幅度提高產(chǎn)量，但是大豆雜交制種技術還沒有大范圍推廣，除種子的繁殖量受限外，還存在些其他問題。其中需要拓寬配套的不育和可育的種質資源，但是找到和不育細胞質配套的保持系可育細胞質需要較長時間。此外在大豆雜交種創(chuàng)制過程中，除以不育系作母本同恢復系為父本進行雜交可獲得雜交種外，制種還需要繁殖CMS “三系”。其中保持系和恢復系由于自身可育，種子可由自交繁殖獲得；而不育系自身不育，種子只能通過其作為母本與同型保持系父本雜交獲得，而不育系與同型保持系除育性外，其他農(nóng)藝性狀完全相同，在繁殖的過程中常常由于田間種植、收獲脫粒等環(huán)節(jié)造成不育系中混雜保持系，制種者利用不純的不育系種子與恢復系雜交生產(chǎn)雜交種時，必然導致混入的保持系給不育系授粉，使不育系上結出的種子仍然為不育系而非雜交種。這樣的種子在生產(chǎn)上種植,必將導致生產(chǎn)田中出現(xiàn)不育株而減產(chǎn)。
[0004]目前鑒定大豆雄性不育細胞質的分子標記方法是基于堿基缺失(indel)的PCR擴增片段大小差異區(qū)分大豆RN型細胞質不育系和保持系，而其擴增的片段在不育系中和保持系中的大小差異只有12bp，必須通過高濃度的3%瓊脂糖凝膠電泳進行區(qū)分，實際操作中可能不易分辨，而且單一的標記，可能會影響大豆雄性不育細胞質和正?？捎毎|的鑒定的準確性，繼而影響大豆CMS商業(yè)化育種工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種葉綠體DNA的SNP標記鑒定大豆雄性不育細胞質方法，利用葉綠體DNA的SNP標記來區(qū)別雄性不育細胞質和可育細胞質，更可以區(qū)分不育系(含有不育細胞質)和保持系(含有可育細胞質)，將為拓寬大豆CMS種質資源和應用于區(qū)分大豆細胞質雄性不育系制種過程中混入的父本保持系提供一種快速，準確和可靠的分子生物學實驗檢測技術和手段。
[0006]本發(fā)明提供的一種葉綠體DNA的SNP標記鑒定大豆雄性不育細胞質方法，解決方案如下:I)提取含有雄性不育細胞質的大豆不育系和其配套的含有可育細胞質的保持系種子基因組DNA，選用兩者間的4對葉綠體DNA的SNPs為標記，SNPs名稱代號分別為SNP1、SNP2、SNP3 和 SNP4。
[0007]其中SNPl對應的部分側翼序列為:
ACGGTAGTATTAGGAGCTAC [C/T]([不育細胞質 / 可育細胞質])TTAGCTATTGCTCAACAAGA ； 其中SNP2對應的部分側翼序列為:
AGATAGATATCTATAGTTAT [A/C]([不育細胞質 / 可育細胞質])AATTTTTGTTTGTTGTCCCC ； 其中SNP3對應的部分側翼序列為:
ACAATTAGATTAGACAATTA [T/G]([不育細胞質 / 可育細胞質])AAAAAAATATTGAGACAATT ； 其中SNP4對應的部分側翼序列為:
TAAATTTCTATATTAGAATT [C/A]([不育細胞質 / 可育細胞質])TATTTTTTTTAGAAAGCCTC。
[0008]在4對SNPs的側翼序列分別設計I對引物進行PCR擴增，引物序列如下:
其中SNPl對應的上游引物序列為:
5’ -TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’，
下游引物序列為 5’ -TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’ ；
其中SNP2對應的上游引物序列為:
5’ -TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’，
下游引物序列為 5’ -ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’ ；
其中SNP3對應的上游引物序列為:
5’ -AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’，
下游引物序列為 5’ -TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’ ；
其中SNP4對應的上游引物序列為:
5’ -GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’，
下游引物序列為 5’ - AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’。
[0009]2)擴增后的PCR產(chǎn)物在不育細胞質和可育細胞質中長度是一致的，利用限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，不育系和保持系通過獲得不同長度大小的條帶進行準確區(qū)分。4對葉綠體DNA的SNPs位點對應的PCR擴增的引物大小、相應的限制性內(nèi)切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述:
其中SNPl對應的PCR擴增的產(chǎn)物為463bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶極^70 /酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為463bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為255bp和208bp ；
其中SNP2對應的PCR擴增的產(chǎn)物為489bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為489bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為323bp和166bp ；
其中SNP3對應的PCR擴增的產(chǎn)物為490bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為490bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為288bp和192bp ；
其中SNP 4對應的PCR擴增的產(chǎn)物為399bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為399bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為247bp和152bp。
[0010]利用發(fā)明所述的方法也可應用于區(qū)分大豆細胞質雄性不育系制種過程中不育系混入的父本保持系。
[0011]本發(fā)明提供的葉綠體DNA分子標記鑒定大豆雄性不育細胞質和正常可育細胞質的方法包括以下步驟:
提取雄性不育細胞質的大豆不育系和其配套的保持系種子的基因組DNA作為擴增模板，選用兩者間的4對葉綠體DNA的SNPs標記，在跨4對SNPs的側翼序列分別設計I對引物進行PCR擴增。擴增的PCR產(chǎn)物因為長度相同，利用限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，不育系和保持系通過獲得不同長度大小的條帶進行準確區(qū)分。
[0012]大豆材料的DNA提取過程如下:利用CTAB法提取大豆基因組DNA，此DNA作為擴增模板。
[0013]PCR擴增反應:利用跨4對SNPs的側翼序列分別設計I對引物進行PCR擴增。
[0014]酶切過程:擴增的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶酶切，37°C孵育lh。
[0015]瓊脂糖凝膠電泳過程:酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，成像記錄，觀察細胞質不育材料(不育系)和細胞質可育材料(保持系)的酶切片段大小。
[0016]本發(fā)明與傳統(tǒng)的鑒定細胞質育性及區(qū)分不育系和保持系的方法具有以下優(yōu)點和效果:
由于細胞質雄性不育是通過細胞質遺傳的，而葉綠體DNA屬于細胞質遺傳，本發(fā)明中的葉綠體DNA的SNP標記穩(wěn)定，一個或者多個SNP可以分別或者同時使用，增加可靠性，含有SNP的PCR產(chǎn)物在酶切后產(chǎn)生的片段不育系中和保持系中的大小差異至少在152bp以上，通過低濃度1%的瓊脂糖電泳就可以明顯區(qū)分出來。
[0017]大豆種子隨時可以提取DNA進行檢測，避免了傳統(tǒng)方法需要進行田間種植在開花期再檢測花粉育性所浪費的時間。
[0018]檢測快速耗時少，從提取DNA到酶切電泳，I個工作日可以完成。
[0019]檢測準確，因為酶切條帶區(qū)分明顯，利用低濃度的瓊脂糖凝膠電泳即可在紫外燈或者藍光燈下觀察鑒別。
[0020]檢測所用的儀器和藥品為常規(guī)的分子生物學實驗室具備。
[0021]檢測過程沒有復雜的操作技術，普通的實驗室技術人員即可完成。
[0022]本發(fā)明的積極效果在于:
利用葉綠體DNA的SNP標記來區(qū)別雄性不育細胞質和可育細胞質,更可以區(qū)分不育系和保持系，將為拓寬大豆CMS種質資源和區(qū)分不育系中的保持系提供方便快捷的途徑。從不育系和保持系中發(fā)現(xiàn)存在的4對差異SNPs，在跨SNPs的區(qū)域側翼序列設計引物進行PCR擴增，擴增的產(chǎn)物片段大小通過限制性內(nèi)切酶酶切可以將不育系和保持系區(qū)分出來，條帶清晰，重復性好，可靠性強，這種應用基于SNPs和內(nèi)切酶結合的標記可以鑒定出育種過程中繁育不育系(含有不育細胞質)時的混雜的父本保持系(含有可育細胞質)，為種子生產(chǎn)過程中純度要求提供保障。
[0023]本發(fā)明中的葉綠體DNA的SNP標記穩(wěn)定，一個或者多個SNP可以分別或者同時使用，增加可靠性，含有SNP的PCR產(chǎn)物在酶切后產(chǎn)生的片段不育系中和保持系中的大小差異至少在152bp以上，通過低濃度1%的瓊脂糖電泳就可以明顯區(qū)分出來。【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為利用4對跨SNPs側翼序列的弓丨物進行PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；
圖2為利用限制性內(nèi)切酶酶切PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。
[0025]【具體實施方式】:
下面通過基于PCR結合限制性內(nèi)切酶酶切分析SNPs區(qū)域的分子生物學方法進行鑒定的實驗進一步舉例說明實施例1
選用的4對葉綠體DNA的SNPs標記，名稱代號分別為SNP1、SNP2、SNP3和SNP4。
[0026]其中SNPl對應的部分側翼序列為:
ACGGTAGTATTAGGAGCTAC [C/T]([不育細胞質 / 可育細胞質])TTAGCTATTGCTCAACAAGA ； 其中SNP2對應的部分側翼序列為:
AGATAGATATCTATAGTTAT [A/C]([不育細胞質 / 可育細胞質])AATTTTTGTTTGTTGTCCCC ； 其中SNP3對應的部分側翼序列為:
ACAATTAGATTAGACAATTA [T/G]([不育細胞質 / 可育細胞質])AAAAAAATATTGAGACAATT ； 其中SNP4對應的部分側翼序列為:
TAAATTTCTATATTAGAATT [C/A]([不育細胞質 / 可育細胞質])TATTTTTTTTAGAAAGCCTC。
[0027]鑒定材料為大豆細胞質的雄性不育系(含有雄性不育細胞質)和其配套的保持系(含有雄性可育細胞質)(吉林省農(nóng)業(yè)科學院大豆所提供并保存)，見表1。
[0028]表1:鑒定材料為RN型大豆雄性不育細胞質的大豆不育系和其配套的保持系材料
【權利要求】
1.一種葉綠體DNA的SNP標記鑒定大豆雄性不育細胞質的方法，包括以下步驟: 提取含有雄性不育細胞質的大豆不育系和含有可育細胞質的保持系種子基因組DNA作為PCR擴增模板；選用4對葉綠體DNA的SNPs標記，SNPs名稱代號分別為SNP1、SNP2、SNP3和SNP4 ;在4對SNPs的側翼序列分別設計I對引物進行PCR擴增，所述的引物如下:其中SNPl對應的上游引物序列為5’ -TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’， 下游引物序列為 5’ -TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’ ； 其中SNP2對應的上游引物序列為5’ -TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’， 下游引物序列為 5’ -ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’ ； 其中SNP3對應的上游引物序列為5’ -AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’， 下游引物序列為 5’ -TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’ ； 其中SNP4對應的上游引物序列為5’ -GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’， 下游引物序列為 5’ - AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’ ； 擴增后的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切片段長度鑒定是否為大豆雄性不育細胞質。
2.權利要求1所述的一種葉綠體DNA的SNPs標記鑒定大豆雄性細胞質的方法，其特征在于:4對葉綠體DNA的SNPs標記 對應的位點、對應的側翼序列的位置、PCR擴增的引物大小、相應的限制性內(nèi)切酶和酶切后的片段大小等如下所述: 其中SNPl對應的部分側翼序列為ACGGTAGTATTAGGAGCTAC[C/T]([不育細胞質可育細胞質])TTAGCTATTGCTCAACAAGA ;利用權利要求1所述引物進行PCR擴增的產(chǎn)物為463bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶極^70 /酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為463bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為255bp和208bp ； 其中SNP2對應的部分側翼序列為AGATAGATATCTATAGTTAT[A/C]([不育細胞質/可育細胞質])AATTTTTGTTTGTTGTCCCC ;利用權利要求1所述引物進行PCR擴增的產(chǎn)物為489bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為489bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為323bp和166bp ； 其中SNP3對應的部分側翼序列為ACAATTAGATTAGACAATTA[T/G]([不育細胞質/可育細胞質])AAAAAAATATTGAGACAATT ;利用權利要求1所述引物進行PCR擴增的產(chǎn)物為490bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為490bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為288bp和192bp ； 其中SNP4對應的部分側翼序列為TAAATTTCTATATTAGAATT[C/A]([不育細胞質/可育細胞質])TATTTTTTTTAGAAAGCCTC ;利用權利要求1所述引物進行的PCR擴增的產(chǎn)物為399bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/酶切，可育細胞質(保持系)的酶切片段長度為399bp，不育細胞質(不育系)的酶切片段為兩個，長度分別為247bp和152bp。
3.利用權利要求1所述的方法應用于區(qū)分大豆細胞質雄性不育系(含有不育細胞質)制種過程中不育系混入的父本保持系(含有可育細胞質)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004853SQ201410270938
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】林春晶, 張春寶, 董英山, 趙麗梅, 彭寶, 趙洪錕 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學院