本發(fā)明屬于作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的遺傳育種學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用長(zhǎng)雄野生稻(oryzalongistaminata)無(wú)性繁殖特性培育雜交稻多年生稻不育系的方法。

背景技術(shù)：

雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象普遍存在于整個(gè)生物界，而雜種優(yōu)勢(shì)也被廣泛利用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等方面，雜交稻的利用大大提高了我國(guó)水稻產(chǎn)量，被譽(yù)為是第二次綠色科技革命。生產(chǎn)實(shí)踐證明，在相同條件下，雜交水稻一般比普通良種增產(chǎn)20％左右。解決雜交水稻制種問(wèn)題的有效途徑首推利用雄性不孕性，雄性不孕性在遺傳上一般分核質(zhì)型和胞質(zhì)型兩類(lèi)，以后者在雜交優(yōu)勢(shì)育種中最有利用價(jià)值。1987年，袁隆平院士提出雜交水稻育種分三個(gè)發(fā)展階段的戰(zhàn)略:育種方法從三系法到兩系法再到一系法，朝著程序由繁到簡(jiǎn)而效率越來(lái)越高的方向發(fā)展；雜種優(yōu)勢(shì)水平從品種間到亞種間再到遠(yuǎn)緣雜種優(yōu)勢(shì)利用，朝著優(yōu)勢(shì)越來(lái)越強(qiáng)的方向發(fā)展。

雖然雜交稻技術(shù)對(duì)糧食安全具有顯著貢獻(xiàn)，但由于雜交稻種子只能利用一次，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高。如何利用長(zhǎng)雄野生稻以多年生性為主的無(wú)性繁殖特性培育多年生稻不育系，實(shí)現(xiàn)多年生稻不育系種植一次連續(xù)多季多年生長(zhǎng)，通過(guò)無(wú)性繁殖保存不育系種質(zhì)資源、可以進(jìn)行多次制種且配制的雜交稻種植一次收獲多年(多次)，達(dá)到降低稻作生產(chǎn)成本、提高稻作生產(chǎn)效益的目的，成為農(nóng)業(yè)科技人員亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了利用長(zhǎng)雄野生稻無(wú)性繁殖特性培育多年生稻不育系的方法，實(shí)現(xiàn)多年生稻不育系種植一次能夠連續(xù)生長(zhǎng)2年及以上，除了可以利用無(wú)性繁殖特性保存和繁殖不育系種外，還可有效提高雜交稻生產(chǎn)過(guò)程中的制種成本，提高稻作生產(chǎn)效益。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

利用長(zhǎng)雄野生稻無(wú)性繁殖特性培育多年生稻不育系的方法，其中所述多年生稻不育系是多年生稻三系不育系，所述方法包括如下步驟：

(1)以長(zhǎng)雄野生稻為父本，以栽培稻為母本進(jìn)行雜交獲得第一f1代；

(2)將所述第一f1代自交，得到第一f2代；

(3)篩選出攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一f2代，其中所述多年生性遺傳位點(diǎn)包括主效位點(diǎn)和微效位點(diǎn)；

(4)攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一f2代連續(xù)自交得到后代材料，從中選育出多年生稻品系，所述多年生稻品系攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)，即具有多年生性狀；

(5)利用步驟(4)選育出的具有多年生性狀的多年生稻品系做供體，以與雜交稻不育系對(duì)應(yīng)的保持系做母本，通過(guò)雜交將多年生性遺傳位點(diǎn)導(dǎo)入至保持系中，獲得第二f1代；

(6)所述第二f1代與所述雜交稻不育系對(duì)應(yīng)的保持系做父本進(jìn)行回交，再自交，篩選獲得攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻保持系；

(7)所述多年生稻保持系與其相應(yīng)的不育系雜交，培育得到攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻三系不育系。

本發(fā)明還提供了以下技術(shù)方案：

利用長(zhǎng)雄野生稻無(wú)性繁殖特性培育多年生稻不育系的方法，其中所述多年生稻不育系是多年生稻兩系不育系，所述方法包括如下步驟：

(1’)以長(zhǎng)雄野生稻為父本，以栽培稻為母本進(jìn)行雜交獲得第一f1代；

(2’)將所述第一f1代自交，得到第一f2代；

(3’)篩選出攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一f2代，其中所述多年生性遺傳位點(diǎn)包括主效位點(diǎn)和微效位點(diǎn)；

(4’)攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一f2代連續(xù)自交得到后代材料，從中選育出多年生稻品系，所述多年生稻品系攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)，即具有多年生性狀；

(5’)利用步驟(4’)選育出的具有多年生性狀的多年生稻品系做供體，以兩系雜交稻不育系做母本，通過(guò)雜交將多年生性遺傳位點(diǎn)導(dǎo)入至兩系雜交稻不育系中，獲得第三f1代；

(6’)所述第三f1代與所述兩系雜交稻不育系做父本在可育環(huán)境條件下進(jìn)行回交，再自交，篩選出攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生兩系雜交稻不育系，所述可育環(huán)境條件包括溫度和/或日照長(zhǎng)度條件。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述栽培稻是rd23。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述主效位點(diǎn)包括rhz2和rhz3，所述微效位點(diǎn)包括qrl1、qrbd2、qrn2、qrn3、qrn5、qrn6、qrl6、qrn7、qrl7和qrl10。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述具有多年生性狀的多年生稻品系攜帶選自rhz2、rhz3、qrl1、qrbd2、qrn2、qrn3、qrn5、qrn6、qrl6、qrn7、qrl7和qrl10的一個(gè)或多個(gè)多年生性遺傳位點(diǎn)。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述第一f2代連續(xù)自交得到的后代材料包括f3代、f4代、f5代、f6代、f7代、f8代、f9代、f10代、f11代和/或f12代中的一種或多種。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述第二f1代與三系雜交稻保持系父本進(jìn)行回交4次，然后連續(xù)自交4代。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述第三f1代與兩系雜交稻不育系父本進(jìn)行回交4次，然后連續(xù)自交4代。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說(shuō)明中，省略了對(duì)公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。

在本發(fā)明中，用作父本的是長(zhǎng)雄野生稻(oryzalongisatminata)，其為廣泛生長(zhǎng)在熱帶非洲的一個(gè)野生種，具有長(zhǎng)柱頭和花藥(oka，1967)、自交不親和(nayar，1968；chu，1969)、異花授粉(causse，1991)和地下莖(porteres，1949；bezancon，1977；ghesquiere，1985)特性。在長(zhǎng)雄野生稻中，由于地下莖特有的營(yíng)養(yǎng)繁殖作用，是發(fā)展多年生稻的理想性狀，本發(fā)明正是基于長(zhǎng)雄野生稻的該特性成功培育成多年生稻不育系。

在本發(fā)明中用作母本的栽培稻可以是包括秈稻和粳稻在內(nèi)的多數(shù)水稻品種，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述栽培稻是rd23，其為來(lái)自泰國(guó)的廣泛種植的秈稻品種。

在本文中，術(shù)語(yǔ)“多年生”，“多年生性”或相似術(shù)語(yǔ)是指通過(guò)長(zhǎng)雄野生稻與栽培稻雜交后代選育的具有種植一次可以生長(zhǎng)并收獲多年(2年及以上)的品系特性，從而具有良好的多年生能力。

采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，例如但不限于雜交，回交和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(mas)，以長(zhǎng)雄野生稻為父本，栽培稻為母本獲得第一f1代，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一f1代是f1(rd23/o.longistaminata)。

在本文中，術(shù)語(yǔ)“自交”是指來(lái)自同一個(gè)體的雌雄配子的結(jié)合或具有相同基因型個(gè)體間的交配或來(lái)自同一無(wú)性繁殖系的個(gè)體間的交配。

在本文中，術(shù)語(yǔ)“回交”指子一代與兩個(gè)親本中的任意一親本進(jìn)行雜交，這種方法叫做回交。在育種工作中，常利用回交的方法來(lái)加強(qiáng)雜種個(gè)體中某一親本的性狀表現(xiàn)。用回交方法所產(chǎn)生的后代稱(chēng)為回交后代。被用來(lái)回交的親本稱(chēng)為輪回親本，未被用來(lái)回交的親本稱(chēng)為非輪回親本。

在本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)第一f1代進(jìn)行自交，得到第一f2代。在本發(fā)明中，還可以包括通過(guò)對(duì)第一f1代進(jìn)行回交，得到bc1(輪回親本為母本栽培稻，在優(yōu)選的實(shí)施方式中優(yōu)選為母本栽培稻rd23)分離群體。

對(duì)第一f2代和/或bc1分離群體進(jìn)行遺傳分析，篩選出多年生性遺傳位點(diǎn)，對(duì)長(zhǎng)雄野生稻的多年生性遺傳位點(diǎn)的鑒定和分析可以參見(jiàn)胡鳳益所著“長(zhǎng)雄野生稻地下莖分子定位和遺傳研究”，西南農(nóng)業(yè)大學(xué)2002屆碩士論文。在本發(fā)明中全文引入該論文作為參考文獻(xiàn)。其中所述多年生性遺傳位點(diǎn)包括主效位點(diǎn)和微效位點(diǎn)，具體而言：在本發(fā)明中，所述主效位點(diǎn)包括rhz2和rhz3，所述rhz2和rhz3分別定位在第3染色體上的ssr分子標(biāo)記osr16和osr13之間，其距離分別是1.3cm和8.1cm，和第4染色體上的ssr分子標(biāo)記rm119和rm237之間，其距離分別是2.2cm和7.4cm，須說(shuō)明的是，osr16等標(biāo)記名稱(chēng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該都知曉的，屬于基于水稻基因組序列公開(kāi)發(fā)布的水稻ssr分子標(biāo)記術(shù)語(yǔ)。

如表1所示，在本發(fā)明中，所述微效位點(diǎn)包括qrl1、qrbd2、qrn2、qrn3、qrn5、qrn6、qrl6、qrn7、qrl7和qrl10。

在本發(fā)明中所使用的，rhz代表地下莖表達(dá)主效位點(diǎn)；q代表微效位點(diǎn)(qtl)；rn:單株地下莖多少；rbd：地下莖分枝程度；rbn：二次分枝程度；rl:地下莖平均長(zhǎng)度；ril:地下莖節(jié)間的平均長(zhǎng)度；rin：地下莖節(jié)間數(shù)；rdw：?jiǎn)沃甑叵虑o干重；tn：?jiǎn)沃攴痔Y數(shù)；數(shù)字代表該位點(diǎn)位于第幾號(hào)染色體。

表1地下莖相關(guān)基因/qtls及性狀

在本發(fā)明中，將攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一f2代自交獲得包括f3代、f4代、f5代、f6代、f7代、f8代、f9代、f10代、f11代和/或f12代中的一種或多種后代材料，基因組基本穩(wěn)定純合形成株系，從而可以用作攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻品系，其中所述多年生稻品系根據(jù)品系基因型(攜帶不同多年生遺傳位點(diǎn))和表現(xiàn)型的不同可以包括一種或多種品系，可以根據(jù)需要選擇任一種多年生稻品系進(jìn)行育種。在本發(fā)明中優(yōu)先使用的多年生稻品系是采用分子標(biāo)記輔助選擇培育的具有多年生性狀的稻作品系，如本發(fā)明中的pr23、pr24等稻作品系，即多年生稻23號(hào)，多年生稻24號(hào)，根據(jù)英文perennialrice23，perennialrice24命名，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，不同品系攜帶不同的多年生性遺傳位點(diǎn)獲得多年生稻，保證產(chǎn)量，例如pr24攜帶了多年生性遺傳位點(diǎn)rhz2(chr3)、rhz3(chr4)、qrn2(chr2)、qrbd2(chr2)、qrn7(chr7)、qrn10(chr10)，可以實(shí)現(xiàn)多年生性。

在本發(fā)明中，將上述具有不同多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻品系為供體，在優(yōu)選實(shí)施方式中以所述pr23和/或pr24多年生稻品系作為供體，以與三系雜交稻不育系對(duì)應(yīng)的三系雜交稻保持系做母本，通過(guò)雜交方法將多年生性遺傳位點(diǎn)導(dǎo)入至三系雜交稻保持系中，再轉(zhuǎn)至不育系中。

在本發(fā)明中，將上述具有不同多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻品系為供體，在優(yōu)選實(shí)施方式中以所述pr23和/或pr24多年生稻品系作為供體，以與兩系雜交稻不育系做母本，通過(guò)雜交方法將多年生性遺傳位點(diǎn)導(dǎo)入至兩系雜交稻不育系中。

目前本領(lǐng)域中研究及生產(chǎn)常用的不育系，例如野敗型雄性不育系、秈型雄性不育系培矮64s，包括三系配套、兩系配套中的不育系均可以用于本發(fā)明，保持系與不育系是對(duì)應(yīng)關(guān)系(三系配套)或兩系合一(光溫敏型不育系)(兩系配套)；恢復(fù)系是與不育系雜交，可以恢復(fù)不育系育性并且f1代植株具有顯著雜種優(yōu)勢(shì)的品系(種)。

在本發(fā)明中可以使用的三系雜交稻包括本領(lǐng)域中已知的三系水稻，例如不育系(如珍汕97a)、保持系(珍汕97b)、恢復(fù)系(蜀恢527)，本發(fā)明中優(yōu)選使用的是云南大學(xué)提供的三系水稻，即不育系芽1a、保持系芽1b。

在本發(fā)明中可以使用的兩系雜交稻包括本領(lǐng)域中已知的兩系水稻，例如光溫敏核不育系培矮64s、恢復(fù)系9311，本發(fā)明中優(yōu)選使用的是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的兩系水稻不育系，即光溫敏核不育系華1015s。

在本發(fā)明中采用mas技術(shù)，所述mas技術(shù)即分子標(biāo)記輔助選擇(molecularmarker-assistedselectionmas)是利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行間接選擇，是對(duì)目標(biāo)性狀在dna水平的選擇，不受環(huán)境影響，不受等位基因顯隱性關(guān)系干擾，選擇結(jié)果可靠，同時(shí)又可避免等位基因間顯隱性關(guān)系的干擾，從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良；分子標(biāo)記輔助選擇育種具有標(biāo)記基因型鑒定可以在低世代和植株生長(zhǎng)的任何階段進(jìn)行、共顯性的分子標(biāo)記允許在雜合體階段進(jìn)行鑒定隱性基因、對(duì)目的基因的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助選擇育種是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物改良的一種手段。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的。

mas根據(jù)分子標(biāo)記的不同，如常用的有ssr標(biāo)記、snp標(biāo)記、caps標(biāo)記等，但原理和步驟基本相同，雖然操作方式會(huì)有差異，在本領(lǐng)域中有大量的相關(guān)文章和書(shū)籍，在育種領(lǐng)域已經(jīng)成為很常用的技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。基本步驟包括dna提取、pcr標(biāo)記的擴(kuò)增、凝膠電泳、和/或結(jié)果(帶型)分析。

本發(fā)明參考temnykh等(2000年)的dna提取方法，對(duì)各株系的代表單株分別提取基因組dna。

對(duì)多年生性遺傳位點(diǎn)緊密連鎖多態(tài)的ssr標(biāo)記進(jìn)行各單株基因組dna為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。

pcr反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染后，參考雙親的擴(kuò)增條帶，對(duì)帶型進(jìn)行判別記錄，篩選目的基因型單株。

在本發(fā)明中，用多年生稻品系做供體，在優(yōu)選實(shí)施方式中以所述pr23和/或pr24多年生稻品系作為供體，三系雜交稻保持系做受體獲得的第二f1代，在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述第二f1代是f1(三系雜交稻保持系/pr24)。所述第二f1代與所述三系雜交稻保持系母本進(jìn)行回交和/或自交，每代都通過(guò)相應(yīng)遺傳位點(diǎn)緊密連鎖分子標(biāo)記(ssr標(biāo)記，表1)進(jìn)行遺傳位點(diǎn)的追蹤與鑒定，篩選獲得攜帶長(zhǎng)雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)的三系雜交稻多年生稻保持系。此處，回交目的是遺傳背景的清除，利用mas留下需要的性狀，其它則和輪回親本一致。因此，在本發(fā)明中所述第二f1代與所述三系雜交稻保持系母本進(jìn)行回交，再自交的先后順序以及重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限制，只要最終能篩選出獲得攜帶長(zhǎng)雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)的三系雜交稻多年生稻保持系。其中，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行回交1次，或者連續(xù)回交2次、3次、4次或更多次；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行自交1次，或者連續(xù)自交2次、3次、4次或更多次。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，單次或連續(xù)的回交和單次或連續(xù)的自交可以交替進(jìn)行。

在本發(fā)明中，所述遺傳位點(diǎn)的追蹤與鑒定是mas過(guò)程，從而獲得帶有長(zhǎng)雄野生稻多年生性(無(wú)性繁殖特性)遺傳位點(diǎn)的單株。

將所述三系雜交稻多年生稻保持系與其相應(yīng)的三系雜交稻不育系雜交，培育得到攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的三系多年生稻不育系。

在本發(fā)明中，用多年生稻品系做供體，在優(yōu)先實(shí)施方式中以所述pr23和/或pr24多年生稻品系作為供體，兩系雜交稻不育系做受體獲得的第三f1代，在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述第三f1代是f1(兩系雜交稻不育系/pr24)。所述第三f1代與所述兩系雜交稻不育系父本在可育環(huán)境條件下進(jìn)行回交，再自交，每代都通過(guò)相應(yīng)遺傳位點(diǎn)緊密連鎖分子標(biāo)記(ssr標(biāo)記進(jìn)行回交和/或自交，每代都通過(guò)相應(yīng)遺傳位點(diǎn)緊密連鎖分子標(biāo)記(ssr標(biāo)記，表1)進(jìn)行遺傳位點(diǎn)的追蹤與鑒定，篩選獲得攜帶長(zhǎng)雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)的兩系雜交稻多年生稻不育系，所述可育環(huán)境條件包括溫度、日照長(zhǎng)度等條件。此處，回交目的是遺傳背景的清除，利用mas留下需要的性狀，其它則和輪回親本一致。因此，在本發(fā)明中所述第三f1代與所述兩系雜交稻不育系父本進(jìn)行回交，再自交的先后順序以及重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限制，只要最終能篩選出獲得攜帶長(zhǎng)雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻不育系。其中，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行回交1次，或者連續(xù)回交2次、3次、4次或更多次；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行自交1次，或者連續(xù)自交2次、3次、4次或更多次。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，單次或連續(xù)的回交和單次或連續(xù)的自交可以交替進(jìn)行。

本發(fā)明通過(guò)在本領(lǐng)域的一年生稻不育系中引入長(zhǎng)雄野生稻中控制無(wú)性繁殖特性(多年生性)的遺傳位點(diǎn)，培育多年生稻不育系，實(shí)現(xiàn)了利用長(zhǎng)雄野生稻無(wú)性繁殖特性來(lái)保存和繁殖不育系，同時(shí)可以利用其多年生性進(jìn)行連續(xù)多年配制雜交種，從第二季開(kāi)始省去了重新播種、育秧、插秧等環(huán)節(jié)，降低了稻作生產(chǎn)成本，提高了稻作生產(chǎn)效益。

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料包括以下

長(zhǎng)雄野生稻：從尼日爾收集，由日本物理與化學(xué)研究所的hiroshihyakutake博士友好提供；

栽培稻rd23：來(lái)自泰國(guó)廣泛種植的秈稻品種；

三系雜交稻不育系芽1a：由云南大學(xué)提供；

三系雜交稻保持系芽1b：由云南大學(xué)提供；

兩系雜交稻不育系1015s:由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

雜交方法在本領(lǐng)域中廣泛已知，完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，具體可以參考作物育種學(xué)-中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社。

mas及多年生性遺傳位點(diǎn)的分子標(biāo)記檢測(cè)參考temnykh等(2000年)的dna提取方法，對(duì)各株系的代表單株分別提取基因組dna。對(duì)多年生性遺傳位點(diǎn)緊密連鎖多態(tài)的ssr標(biāo)記進(jìn)行各單株基因組dna為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。pcr反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染后，參考雙親的擴(kuò)增條帶，對(duì)帶型進(jìn)行判別記錄，篩選目的基因型單株。

本案例所涉及材料與方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)材料與方法。

實(shí)施例1f1(rd23/o.longistaminata)代的培育

以rd23為母本去雄后，長(zhǎng)雄野生稻為父本直接授粉后通過(guò)幼胚挽救得到f1(rd23/o.longistaminata)植株，其開(kāi)花時(shí)期表現(xiàn)出花藥不開(kāi)裂，具有約30％左右的花粉育性、地下莖表現(xiàn)介于父本和母本之間。

實(shí)施例2多年生稻品系pr24的培育

種植實(shí)施例1中所獲得的f1(rd23/o.longistaminata)代，通過(guò)對(duì)f1植株進(jìn)行強(qiáng)制自交授粉獲得了f2種子,這些種子用1/4ms培養(yǎng)基(3％蔗糖+0.7％瓊脂，ph值5.8)進(jìn)行胚培養(yǎng)獲得株苗，通過(guò)練苗后移栽種植，最終獲得分離的f2單株進(jìn)行篩選。

利用選自rhz2和rhz3中的一個(gè)或多個(gè)主效位點(diǎn)，選自qrl1、qrbd2、qrn2、qrn3、qrn5、qrn6、qrl6、qrn7、qrl7和qrl10中的一個(gè)或多個(gè)微效位點(diǎn)對(duì)分離的f2單株進(jìn)行篩選，選育出多年生稻品系pr24(perennialrice24，pr24)，經(jīng)分子檢測(cè)，該品系攜帶了來(lái)自長(zhǎng)雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)rhz2(chr3)、rhz3(chr4)、qrn2(chr2)、qrbd2(chr2)、qrn7(chr7)、qrn10(chr10)(表2),經(jīng)過(guò)水稻生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，其產(chǎn)量表現(xiàn)穩(wěn)定，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有很好的多年生性。

表2列出了在實(shí)施例中所使用的品系的基因型。

表2所用品系基因型列表

注：a為母本帶型，b為父本帶型，h為雜合帶型,rhz代表地下莖表達(dá)主效位點(diǎn)；q代表微效位點(diǎn)(qtl)；rn代表單株地下莖個(gè)數(shù)多少；rbd：地下莖分枝程度；rl:地下莖平均長(zhǎng)度；數(shù)字代表該位點(diǎn)位于第幾號(hào)染色體。

實(shí)施例3多年生稻不育系(三系)的培育

以三系雜交稻保持系芽1b為母本進(jìn)行人工去雄，以多年生稻pr24為父本進(jìn)行雜交獲得f1(三系雜交稻保持系(芽1b)/pr24)代種子。

用f1(三系雜交稻保持系(芽1b)/pr24)代種子和三系雜交稻保持系1b進(jìn)行回交4次，然后連續(xù)自交4次。在回交和自交過(guò)程中利用基于ssr的分子標(biāo)記輔助選擇(molecularmarker-assistedselection，mas)育種技術(shù)，對(duì)多年生性位點(diǎn)rhz2(chr3)、rhz3(chr4)、qrn2(chr2)、qrbd2(chr2)、qrn7(chr7)、qrn10(chr10)進(jìn)行檢測(cè)，選擇攜帶這些位點(diǎn)的植株進(jìn)行進(jìn)一步的回交、自交，直至純合穩(wěn)定，獲得多年生稻保持系，命名為perennialrice芽1b，即pr芽1b(表2)。

用三系雜交稻多年生稻保持系pr芽1b與相應(yīng)的三系雜交稻不育系芽1a進(jìn)行雜交，對(duì)產(chǎn)生的f1植株進(jìn)行花粉育性鑒定及自交結(jié)實(shí)率考查，以檢測(cè)其對(duì)不育性的保持能力，標(biāo)準(zhǔn)為花粉育性與三系雜交稻不育系芽1a一致，而自交結(jié)實(shí)率為零。

在上述檢測(cè)過(guò)程中，利用mas篩選連續(xù)多代選擇攜帶來(lái)自長(zhǎng)雄野生稻的多年生性遺傳位點(diǎn)和花粉完全敗育的單株，最終獲得具有多年生稻不育系，命名為pr芽1a(表2)。

實(shí)施例4多年生稻不育系(三系)田間評(píng)價(jià)

將三系雜交稻多年生稻不育系pr芽1a、三系雜交稻多年生稻保持系pr芽1b在景洪試驗(yàn)田進(jìn)行多年生性、育性評(píng)價(jià)，供體多年生稻pr24和受體三系雜交稻不育系芽1a、三系雜交稻保持系芽1b作為對(duì)照在景洪試驗(yàn)田進(jìn)行同田種植，經(jīng)過(guò)2年4季的田間試驗(yàn)，結(jié)果如下表所示(表3)：

表3多年生稻不育系(三系)田間評(píng)價(jià)結(jié)果

注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻。

由上表可知：多年生稻不育系可以實(shí)現(xiàn)多年生性，實(shí)現(xiàn)通過(guò)無(wú)性繁殖方式保存保存和繁殖多年生稻不育系。

實(shí)施例5多年生稻不育系(兩系)的培育

以水稻光溫敏核不育系-華1015s為母本進(jìn)行人工去雄，以多年生稻pr24為父本進(jìn)行雜交獲得f1(華1015s/pr24)代種子。

用f1(華1015s/pr24)代種子和華1015s進(jìn)行回交4次，然后連續(xù)自交4次。在回交和自交過(guò)程中利用基于ssr的分子標(biāo)記輔助選擇(molecularmarker-assistedselection，mas)育種技術(shù)，對(duì)多年生性位點(diǎn)rhz2(chr3)、rhz3(chr4)、qrn2(chr2)、qrbd2(chr2)、qrn7(chr7)、qrn10(chr10)進(jìn)行檢測(cè)，選擇攜帶這些位點(diǎn)的植株進(jìn)行進(jìn)一步的回交、自交，直至純合穩(wěn)定，獲得多年生稻不育系，命名為perennialrice華1015s，即pr華1015s(表2)。

注：以上試驗(yàn)在保山市施甸縣試驗(yàn)田進(jìn)行(華1015s在保山市低溫環(huán)境下可育，在景洪表現(xiàn)不育特性)；光溫敏核不育系如華1015s是秈型光溫敏核不育系，育性主要受溫度影響，即具有在低溫(<23℃)可育，在高溫條件下不育特性，因此，低溫下其正常可育自交結(jié)實(shí)，可以進(jìn)行種質(zhì)材料繁種和保存，達(dá)到了不育系和保持系兩系合一的目的，加上恢復(fù)系即組成了兩系雜交稻。

實(shí)施例6多年生稻不育系(兩系)田間評(píng)價(jià)

將兩系雜交稻多年生稻不育系pr華1015s在景洪和保山市施甸縣試驗(yàn)田進(jìn)行多年生性、育性評(píng)價(jià)，供體多年生稻pr24和受體華1015s作為對(duì)照進(jìn)行同田種植，經(jīng)過(guò)2年4季的田間試驗(yàn)，結(jié)果如下表(表4)所示：表4多年生稻不育系(兩系)田間評(píng)價(jià)結(jié)果

注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻。

由上表可知：多年生稻不育系可以實(shí)現(xiàn)多年生，實(shí)現(xiàn)通過(guò)無(wú)性繁殖方式保存保存和繁殖多年生稻不育系。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的上述具體實(shí)施方式僅僅用于示例性說(shuō)明或解釋本發(fā)明的原理，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。因此，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入所附權(quán)利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內(nèi)的全部變化和修改例。