本發(fā)明涉及蛹蟲草生產(chǎn)領(lǐng)域，具體的說是一種蛹蟲草生產(chǎn)注射接種過程的封閉連續(xù)定量注射接種方法。

背景技術(shù)：

蛹蟲草是1958年在吉林省首次被發(fā)現(xiàn)，通過鑒定，認(rèn)為它與冬蟲夏草是同一個屬，定名為蛹蟲草。1986年在我國被人工馴化培養(yǎng)成功。

蛹蟲草源自野生蟲草，卻在品質(zhì)上優(yōu)于野生冬蟲夏草。經(jīng)權(quán)威部門檢測分析表明：蛹蟲草（北冬蟲夏草）所含蟲草素（3’-脫氧腺苷）、蟲草酸、蟲草多糖、甘露醇、SOD（超氧化物歧化酶）及磷、鉀、鋅、硒等礦質(zhì)元素均達(dá)到或超過天然冬蟲夏草，其中主要功效成分--蟲草素含量是天然冬蟲夏草的30多倍，蟲草多糖含量是天然冬蟲夏草的1.5倍，SOD(超氧化物歧化酶)活性是天然冬蟲夏草的5.2倍，具有抗癌作用的硒含量是天然冬蟲夏草的12.8倍，鋅含量是天然冬蟲夏草的9倍。具有很高的藥用和食用保健價值。

蛹蟲草中含有豐富的生物活性物質(zhì)，經(jīng)藥理、藥化、“三致”(致畸、致癌、致突變)試驗(yàn)及臨床應(yīng)用顯示蛹蟲草（北冬蟲夏草）對人體有以下幾種功能。

（1）能平喘止咳，對肺氣腫、氣管炎有較好療效；

（2）具有補(bǔ)腎壯陽，治療慢性腎炎和腎功能衰竭；

（3）能明顯降低血糖、尿糖；對糖尿病患者有明顯療效；

（4）能降低血壓、調(diào)節(jié)血脂，治療腦血栓、冠心病、手足麻木等病癥；

（5）具有保肝護(hù)肝作用；

（6）具有抗菌、抗炎、抗癌、抑癌，明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)體力、提高大腦記憶力的功效；

（7）潤肌美容，尤其可快速消除“蝴蝶”斑。

蛹蟲草現(xiàn)已廣泛用于制藥、保健食品、飲料、制酒等多種行業(yè)，已成為替代天然冬蟲夏草的理想代用品?？砷L期食用，無毒副作用。

為了滿足市場的需求，現(xiàn)在通過對野生蛹蟲草菌種分離馴化培養(yǎng)，以柞蠶蛹為寄主，已經(jīng)能夠批量規(guī)模生產(chǎn)出人工栽培的蛹蟲草，但目前常采用的接種方法是自然感染法和微量注射器注射法。

自然感染法是先用大米等做成培養(yǎng)基，將液體蛹蟲草菌種接種于大米培養(yǎng)基上，待蛹蟲草菌生長發(fā)育到一定程度時，將蠶蛹投入，在合適的溫度濕度條件下菌絲可自然感染蛹體。這種方法的缺點(diǎn)是多了一個制作培養(yǎng)基環(huán)節(jié)，增加了培養(yǎng)時間，增加了勞動力成本，增加了原料成本。且感染成活率低，使得生產(chǎn)成本大大增加。

微量注射器注射法是采用化驗(yàn)用三角瓶制作液體蛹蟲草菌種，采用5ml微量注射器注射接種。此法的缺點(diǎn)一是費(fèi)工費(fèi)時，每次只能注射25個蛹，無法連續(xù)操作；二是注射劑量不均，每蛹注射劑量不易控制，多少不均，對僵化出草率有很大的負(fù)面影響；三是使用化驗(yàn)用三角瓶制菌生產(chǎn)成本高；四是非封閉定量接種，污染率高，出草率低，使得生產(chǎn)成本大大增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決上述技術(shù)問題，提供一種蛹蟲草生產(chǎn)過程中封閉連續(xù)定量接種方法，該方法不僅能夠提高生產(chǎn)效率，大大降低生產(chǎn)成本，而且還能夠提高僵化出草率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的蛹蟲草生產(chǎn)過程中的封閉連續(xù)定量注射接種方法包括以下步驟：

步驟（1）液體蛹蟲草菌種獲取：參照現(xiàn)有液體蛹蟲草菌種的制作方法在玻璃輸液瓶中進(jìn)行制作、培養(yǎng)；

步驟（2）蛹體封閉連續(xù)定量注射接種：在超凈工作臺下將步驟（1）中裝有液體蛹蟲草菌種的玻璃輸液瓶瓶口打開，用橡膠塞封口；然后將醫(yī)用一次性無菌輸液管一端插入橡膠塞上，另一端與獸醫(yī)用連續(xù)可調(diào)注射器密閉連接，使玻璃輸液瓶內(nèi)的液體蛹蟲草菌種通過無菌輸液管流到獸醫(yī)用連續(xù)可調(diào)注射器內(nèi)，最后通過調(diào)整注射器并將針頭扎進(jìn)蛹體內(nèi)來實(shí)現(xiàn)定量注射接種。

其中，所述的液體蛹蟲草菌種獲取在實(shí)際過程中可以采用以下步驟：

（a）蛹蟲草斜面培養(yǎng)基制作：取去皮馬鈴薯200g，切成2cm×2cm×2cm方塊，加清水1000ml煮至熟而不爛程度，過濾，取上清液用之，加入葡萄糖20g、瓊脂18g，攪拌溶解后，加清水定容至1000ml,pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，分裝于Φ15×150試管中，每只試管分裝培養(yǎng)基15ml，擺成斜面待用；

（b）野生蛹蟲草菌種分離培養(yǎng)：野生蛹蟲草在長白山余脈采集所得；將野生蛹蟲草用75%酒精消毒處理，切成0.5cm×0.5cm小塊，接種到步驟（a）蛹蟲草斜面培養(yǎng)基試管中，在23℃條件下培養(yǎng)10天，得固體菌種，保存?zhèn)溆茫?/p>

（c）蛹蟲草液體培養(yǎng)基制作：取去皮馬鈴薯200g，切成2cm×2cm×2cm方塊，加清水1000ml煮至熟而不爛程度，過濾，取上清液用之，加入葡萄糖20g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀0.5g，攪拌溶解后，加清水定容至1000ml,pH自然，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，每瓶分裝300ml，瓶口用脫脂棉塞上，用牛皮紙封口，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，晾至30℃以下進(jìn)行接種；

（d）液體蛹蟲草菌種制作：在步驟（c）裝有液體培養(yǎng)基的玻璃輸液瓶中接入步驟（b）培養(yǎng)的固體菌種，每瓶接入5mm×5mm菌塊4塊，在23℃條件下旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)5-7天,待菌絲充滿液體培養(yǎng)基后即可使用；所述的振蕩培養(yǎng)參數(shù)為80-120r/min。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1、本發(fā)明采用500ml玻璃輸液瓶替代化驗(yàn)用三角瓶制作液體蛹蟲草菌種，可節(jié)省成本7倍多，而且使用玻璃輸液瓶方便后續(xù)對蛹體進(jìn)行連續(xù)注射接種。

2、本發(fā)明采用獸醫(yī)用連續(xù)可調(diào)注射器替代普通微量注射器，同時采用醫(yī)用一次性無菌輸液管將獸醫(yī)用連續(xù)可調(diào)注射器和500ml玻璃輸液瓶連接，實(shí)現(xiàn)封閉連續(xù)定量注射接種，該方法可提高工作效率2倍以上，提高僵化出草率20個百分點(diǎn)以上，即可節(jié)約勞動力成本50%，節(jié)約原材料成本25%以上。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明封閉連續(xù)定量注射時輸液瓶與注射器連接示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一、液體蛹蟲草菌種獲取

（1）蛹蟲草斜面培養(yǎng)基制作：取去皮馬鈴薯200g，切成2cm×2cm×2cm方塊，加清水1000ml煮至熟而不爛程度，過濾，取上清液用之，加入葡萄糖20g、瓊脂18g，攪拌溶解后，加清水定容至1000ml,pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，分裝于Φ15×150試管中，每只試管分裝培養(yǎng)基15ml，擺成斜面待用。

（2）野生蛹蟲草菌種分離培養(yǎng)：野生蛹蟲草在長白山余脈采集所得；將野生蛹蟲草用75%酒精消毒處理，切成0.5cm×0.5cm小塊，接種到蛹蟲草斜面培養(yǎng)基試管中，在23℃條件下培養(yǎng)10天，得固體菌種，保存?zhèn)溆茫恍泵嬖嚬芄腆w菌種保存時可采用定期移植法保藏，即將生長發(fā)育成熟的斜面試管固體菌種放在4℃條件下保藏，每隔3個月移植轉(zhuǎn)管一次。

（3）蛹蟲草液體培養(yǎng)基制作：取去皮馬鈴薯200g，切成2cm×2cm×2cm方塊，加清水1000ml煮至熟而不爛程度，過濾，取上清液用之，加入葡萄糖20g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀0.5g，攪拌溶解后，加清水定容至1000ml,pH自然，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，每瓶分裝300ml，瓶口用脫脂棉塞上，用牛皮紙封口，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，晾至30℃以下進(jìn)行接種。

（4）液體蛹蟲草菌種制作：在步驟（3）裝有液體培養(yǎng)基的玻璃輸液瓶中接入步驟（2）培養(yǎng)的固體菌種，每瓶接入5mm×5mm菌塊4塊，在23℃條件下旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)5-7天,菌絲充滿液體培養(yǎng)基后備用；所述的振蕩培養(yǎng)參數(shù)為80-120r/min。

二、蛹體封閉連續(xù)定量注射接種：

在超凈（無菌）工作臺下將裝有液體蛹蟲草菌種的玻璃輸液瓶瓶口打開，用橡膠塞封口；然后將醫(yī)用一次性無菌輸液管一端插入橡膠塞上，另一端與獸醫(yī)用連續(xù)可調(diào)注射器密閉連接（連接方式如圖1所示），使玻璃輸液瓶內(nèi)的液體蛹蟲草菌種通過無菌輸液管流到獸醫(yī)用連續(xù)可調(diào)注射器內(nèi)，最后通過調(diào)整注射器并將針頭扎進(jìn)蛹體內(nèi)來實(shí)現(xiàn)定量注射接種，每個蠶蛹注射0.2ml液體菌種，注射接種4人為一組，平均每人每8小時可注射接種蠶蛹65kg，實(shí)驗(yàn)組4人8小時合計(jì)可接種蠶蛹260kg，且最后僵化出草率95%以上。

對比例1

一、液體蛹蟲草菌種獲取

（1）蛹蟲草斜面培養(yǎng)基制作：同實(shí)施例1。

（2）野生蛹蟲草菌種分離培養(yǎng)：同實(shí)施例1。

（3）蛹蟲草液體培養(yǎng)基制作：取去皮馬鈴薯200g，切成2cm×2cm×2cm方塊，加清水1000ml煮至熟而不爛程度，過濾，取上清液用之，加入葡萄糖20g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀0.5g，攪拌溶解后，加清水定容至1000ml,pH自然，分裝于約500ml化驗(yàn)用三角瓶中，每瓶分裝300ml，瓶口用脫脂棉塞上，用牛皮紙封口，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，晾至30℃以下進(jìn)行接種。

（4）蛹蟲草液體菌種制作：區(qū)別在于是在化驗(yàn)用三角瓶中接種培養(yǎng)，其余同實(shí)施例1。

二、蛹體定量注射接種：

區(qū)別在于直接使用普通微量注射器從三角瓶中取液體蛹蟲草菌種進(jìn)行注射接種，每個蠶蛹注射0.2ml液體菌種，注射接種4人為一組，平均每人每8小時可注射接種蠶蛹32kg，實(shí)驗(yàn)組4人8小時合計(jì)可接種蠶蛹128kg，僵化出草率75%。

結(jié)果：將實(shí)施例1與對比例1比較可知，采用本發(fā)明所述的方法能夠提高工作效率2倍以上；同時由于本發(fā)明在對蛹體進(jìn)行注射接種過程中采用封閉式接種，液體菌種在此過程中無污染，大大提高了僵化出草率，實(shí)施例1比對比例提高僵化出草率20個百分點(diǎn)以上。