本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物發(fā)酵稻草及其在黃瓜-草菇輪作栽培中的應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

設(shè)施農(nóng)業(yè)是綜合應(yīng)用工程裝備技術(shù)、生物技術(shù)和環(huán)境技術(shù)，創(chuàng)造動植物生長發(fā)育的適宜環(huán)境，實現(xiàn)動植物生產(chǎn)的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式。截至2010年底，我國設(shè)施蔬菜年種植面積約達(dá)466.7 萬hm²，分別占我國設(shè)施栽培的95 % 和世界設(shè)施園藝80 % 的面積，成為世界上設(shè)施面積最大的國家。其中黃瓜（Cucumis sativus L.）是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中主要栽培作物，其栽培面積約占設(shè)施栽培面積的60%。設(shè)施栽培中，蔬菜病蟲害的病原菌常潛伏于土壤中，如黃瓜、茄子的枯萎病，疫病等其病菌孢子常在土壤內(nèi)越冬，來年繼續(xù)為害。另外大棚內(nèi)溫度高濕度大，在這樣小氣候條件下，易于蔬菜病蟲害的發(fā)生和相互傳播，對蔬菜為害較大，容易形成惡性循環(huán)。隨著連作年限的增加，有害真菌的種類和數(shù)量增加，土壤中病原菌的拮抗菌減少，進(jìn)一步加重了土傳病害。

其中黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；停?i>Fusarium oxysporum. sp. cucumebrium Owen）所引起的重要黃瓜病害，常年發(fā)病率10-30%，重病年份可達(dá)80-90%。由于保護(hù)地的特殊環(huán)境條件和長期連作，土壤中的病原菌量積累越來越多，致使黃瓜枯萎病的發(fā)生逐年加重。目前主要采取嫁接、化學(xué)農(nóng)藥以及輪作的方式進(jìn)行防治，其中通過輪作來重塑植物根圍微生態(tài)從而保障植物健康已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

在環(huán)洪澤湖農(nóng)業(yè)種植區(qū)特別是淮陰地區(qū)普遍采用的是瓜菇輪作模式，該模式主要特點為一茬黃瓜二茬草菇的種植模式。9月底10月初育苗冬春黃瓜，嫁接；11月上旬種植黃瓜苗，經(jīng)過一個月的生長到12月中上旬采收；到了來年5月底種植第一茬草菇，時隔一個月采收第一茬草菇，同時播種第二茬草菇，到了8月上旬開始采收第二茬草菇并將菇渣做還田處理。在該栽培模式下，黃瓜枯萎病等土傳病害發(fā)病率明顯降低。

但是，在目前的輪作栽培方法中，水稻秸稈的處理方法為石灰水漚制。通過大量生石灰的使用來軟化并腐熟秸稈，同時達(dá)到消毒的目的。長期使用會造成栽培大棚土壤中生石灰大量殘留，土壤板結(jié)，一般輪作2-3年開始黃瓜產(chǎn)量下降，必須再通過水旱輪作或者大水淋洗的方式降低土壤中生石灰含量，緩解土壤板結(jié)程度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種微生物發(fā)酵稻草并將其應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中，該微生物發(fā)酵稻草降低當(dāng)前栽培方法中生石灰的使用，緩解由于生石灰殘留造成的土壤板結(jié)，從而能夠使輪作模式長期可持續(xù)發(fā)展。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：該微生物發(fā)酵稻草的制備方法是：將稻草逐層堆起，每堆一層噴菌液一次，并在稻草上均勻噴水；稻草全部堆完，用塑料膜將稻草堆覆蓋壓實，堆草時間為1個月；其中，草菇種植前1個月開始稻草發(fā)酵，每個小區(qū)稻草150kg，菌液使用量為10L，用水量為50L。

其中，用于稻草發(fā)酵的菌株是1JN2，為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO.9759。

其中，菌株1JN2用于制備菌液的方法是：將菌株1JN2在LB培養(yǎng)液28℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)12-16 h，再6000 rpm離心10 min，用滅菌水重懸浮并且稀釋成一定濃度的菌液，菌液成品中活菌總濃度為1×10⁹ -1×10¹⁰ CFU/mL。

其中，微生物發(fā)酵稻草在黃瓜-草菇輪作栽培中的應(yīng)用方法是：上茬黃瓜拉秧后進(jìn)行土壤翻耕，劃定好草菇種植小區(qū)，每個小區(qū)面積為6*2m²，各小區(qū)之間挖10cm深溝并蓄水處理；封閉大棚，持續(xù)悶棚1個月；悶棚結(jié)束后，將發(fā)酵完的稻草均勻鋪在各小區(qū)中，通過播撒菌種方式種植草菇，并在最上層覆土2cm。

本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在：針對當(dāng)前黃瓜-草菇輪作栽培中由于生石灰殘留造成的土壤板結(jié)現(xiàn)象而開發(fā)，通過菌株1JN2發(fā)酵腐熟稻草，同時結(jié)合種植大棚的悶棚處理消毒土壤，從而避免生石灰的使用；相比于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明能夠避免土壤板結(jié)，使黃瓜-草菇輪作模式能夠長期可續(xù)使用，提高種植戶的經(jīng)濟(jì)效益。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但不能理解為是對技術(shù)方案的限制，在此基礎(chǔ)上的適應(yīng)性改進(jìn)都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

菌株來源：所用菌株通過稀釋涂板法分離自山東省萊蕪市萊西鎮(zhèn)的生姜植株中，菌株編號為1JN2。

菌株的篩選依據(jù)：通過以下方法篩選菌株產(chǎn)纖維素酶活性：把準(zhǔn)備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板(蛋白胨 10 g，酵母粉 10 g，羧甲基纖維素鈉 10 g，氯化鈉 5 g，磷酸二氫鉀 1 g，瓊脂 18 g，定容至 1000 mL， pH=7.0)，30℃培養(yǎng) 48 h后，用 1 g/L的剛果紅染 1 h 后，倒掉染液，用1 M的 NaCl 浸泡 1 h；檢測透明圈的有無并且測量其內(nèi)徑和外徑。

表1，菌株篩選信息

注：表中數(shù)字為水解圈半徑，即菌落邊緣至水解圈邊緣數(shù)值，表中數(shù)值為三次重復(fù)實驗的平均值。

菌株鑒定：通過16S rDNA序列比對，菌株1JN2與枯草芽孢桿菌（Genebank登錄號AB383135.1）序列相似性99%；另外菌株1JN2革蘭氏染色反應(yīng)陽性，在LB培養(yǎng)基上形成1-3mm菌落，邊緣不整齊，污白色，表面粗糙不透明；與《常用細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》中枯草芽孢桿菌的特性一致，故鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

堆草處理及指標(biāo)檢測：堆草處理中設(shè)菌株處理組和清水對照處理組，每組3個重復(fù)小區(qū)；每個小區(qū)使用稻草150kg，將稻草逐層堆起，每堆一層噴菌液一次，并在稻草上均勻噴施水；稻草全部堆完，用塑料膜將稻草堆覆蓋壓實，堆草時間為1個月；菌液處理組中菌液使用量為10L，用水量為50L；對照組中不加菌液，用水量為60L； 堆草結(jié)束后，分別采集每個處理中稻草樣品，檢測其纖維素酶活性、木質(zhì)素酶活性和發(fā)芽指數(shù)（GI）。

表2 堆草處理相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果

注：纖維素酶活性采用蒽酮比色法，每g樣品每分鐘催化產(chǎn)生1μg葡萄糖定義為一個酶活力單位（U）；木質(zhì)素過氧化物酶測定原理為木質(zhì)素過氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛，在310nm 處有特征吸收峰，每克樣品每分鐘氧化1μmol 藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位（U）；GI計算方法為：處理組浸提液的種子發(fā)芽率×種子根長/蒸餾水的種子發(fā)芽率×種子根長×100。

實施例1：依以下步驟制備微生物發(fā)酵稻草并將其應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中

（1）菌株1JN2：用于稻草發(fā)酵的菌株是1JN2，為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO.9759；

（2）菌株1JN2用于制備菌液：將菌株1JN2在LB培養(yǎng)液28℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)12h，再6000 rpm離心10 min，用滅菌水重懸浮并且稀釋成一定濃度的菌液，菌液成品中活菌總濃度為1×10⁹ CFU/mL；

（3）微生物發(fā)酵稻草的制備：將稻草逐層堆起，每堆一層噴菌液一次，并在稻草上均勻噴水；稻草全部堆完，用塑料膜將稻草堆覆蓋壓實，堆草時間為1個月；其中，草菇種植前1個月開始稻草發(fā)酵，每個小區(qū)稻草150kg，菌液使用量為10L，用水量為50L；

（4）微生物發(fā)酵稻草應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中：9月底10月初育苗冬春黃瓜，嫁接；11月上旬種植黃瓜苗，經(jīng)過一個月的生長到12月中上旬采收；到了來年5月底種植第一茬草菇，時隔一個月采收第一茬草菇，同時播種第二茬草菇，到了8月上旬開始采收第二茬草菇并將菇渣做還田處理；上茬黃瓜拉秧后進(jìn)行土壤翻耕，劃定好草菇種植小區(qū)，每個小區(qū)面積為6*2m²，各小區(qū)之間挖10cm深溝并蓄水處理；封閉大棚，持續(xù)悶棚1個月；悶棚結(jié)束后，將發(fā)酵完的稻草均勻鋪在各小區(qū)中，通過播撒菌種方式種植草菇，并在最上層覆土2cm。

實施例2：依以下步驟制備微生物發(fā)酵稻草并將其應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中

（1）菌株1JN2：用于稻草發(fā)酵的菌株是1JN2，為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO.9759；

（2）菌株1JN2用于制備菌液：將菌株1JN2在LB培養(yǎng)液28℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)14 h，再6000 rpm離心10 min，用滅菌水重懸浮并且稀釋成一定濃度的菌液，菌液成品中活菌總濃度為1×10¹⁰ CFU/mL；

（3）微生物發(fā)酵稻草的制備：將稻草逐層堆起，每堆一層噴菌液一次，并在稻草上均勻噴水；稻草全部堆完，用塑料膜將稻草堆覆蓋壓實，堆草時間為1個月；其中，草菇種植前1個月開始稻草發(fā)酵，每個小區(qū)稻草150kg，菌液使用量為10L，用水量為50L；

（4）微生物發(fā)酵稻草應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中：9月底10月初育苗冬春黃瓜，嫁接；11月上旬種植黃瓜苗，經(jīng)過一個月的生長到12月中上旬采收；到了來年5月底種植第一茬草菇，時隔一個月采收第一茬草菇，同時播種第二茬草菇，到了8月上旬開始采收第二茬草菇并將菇渣做還田處理；上茬黃瓜拉秧后進(jìn)行土壤翻耕，劃定好草菇種植小區(qū)，每個小區(qū)面積為6*2m²，各小區(qū)之間挖10cm深溝并蓄水處理；封閉大棚，持續(xù)悶棚1個月；悶棚結(jié)束后，將發(fā)酵完的稻草均勻鋪在各小區(qū)中，通過播撒菌種方式種植草菇，并在最上層覆土2cm。

實施例3：依以下步驟制備微生物發(fā)酵稻草并將其應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中

（1）菌株1JN2：用于稻草發(fā)酵的菌株是1JN2，為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO.9759；

（2）菌株1JN2用于制備菌液：將菌株1JN2在LB培養(yǎng)液28℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)16 h，再6000 rpm離心10 min，用滅菌水重懸浮并且稀釋成一定濃度的菌液，菌液成品中活菌總濃度為1×10⁹ CFU/mL；

（3）微生物發(fā)酵稻草的制備：將稻草逐層堆起，每堆一層噴菌液一次，并在稻草上均勻噴施水；稻草全部堆完，用塑料膜將稻草堆覆蓋壓實，堆草時間為1個月；其中，草菇種植前1個月開始稻草發(fā)酵，每個小區(qū)稻草150kg，菌液使用量為10L，用水量為50L；

（4）微生物發(fā)酵稻草應(yīng)用在黃瓜-草菇輪作栽培中：9月底10月初育苗冬春黃瓜，嫁接；11月上旬種植黃瓜苗，經(jīng)過一個月的生長到12月中上旬采收；到了來年5月底種植第一茬草菇，時隔一個月采收第一茬草菇，同時播種第二茬草菇，到了8月上旬開始采收第二茬草菇并將菇渣做還田處理；上茬黃瓜拉秧后進(jìn)行土壤翻耕，劃定好草菇種植小區(qū)，每個小區(qū)面積為6*2m²，各小區(qū)之間挖10cm深溝并蓄水處理；封閉大棚，持續(xù)悶棚1個月；悶棚結(jié)束后，將發(fā)酵完的稻草均勻鋪在各小區(qū)中，通過播撒菌種方式種植草菇，并在最上層覆土2cm。

實施例1-3的黃瓜和草菇的畝產(chǎn)量統(tǒng)計如表3。

表3 黃瓜和草菇的畝產(chǎn)量（kg）

注：實例1、2、3實施地分別為淮安市淮陰區(qū)七一村、娘莊村和淮安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心園區(qū)，傳統(tǒng)方法中利用生石灰處理稻草。