本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種苦參堿和蠟蚧輪枝菌聯(lián)用的殺蟲藥。

背景技術(shù)：

煙粉虱（Bemisiatabaci (Gennadius)）是一種寄主范圍廣泛的世界性害蟲，除直接取食為害外，還分泌蜜露影響光合作用，污染作物品質(zhì)，同時(shí)傳播植物病毒，誘發(fā)植物病毒病，全球平均每年的經(jīng)濟(jì)損失超過3 億美元。煙粉虱在我國20 世紀(jì)40 年代就有記載，但一直因?yàn)楹Σ恢囟幢涣腥胫饕οx。近年來危害更大的B-生物型煙粉虱入侵我國，并迅速蔓延至20 多個(gè)省市，在許多地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，給蔬菜、花卉生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

當(dāng)前，煙粉虱的防控仍以化學(xué)藥劑為主，但其抗藥性發(fā)展迅速，已對常用的大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥以及昆蟲生長調(diào)節(jié)劑、吡蟲啉、噻蟲嗪等新型殺蟲劑都產(chǎn)生了高水平的抗性和交互抗性。因此，在傳統(tǒng)防治手段無法保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)免受害蟲危害的局面下，探索和研究煙粉虱新型可持續(xù)防控技術(shù)，一直是近年來國內(nèi)外煙粉虱防治的重要任務(wù)。此外，化學(xué)農(nóng)藥對煙粉虱的持續(xù)防治不但會導(dǎo)致環(huán)境污染，同時(shí)也會對人類、哺乳動物及其他非目標(biāo)生物產(chǎn)生的不利影響。這種農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致了天然生物控制系統(tǒng)的中斷，進(jìn)而導(dǎo)致煙粉虱的爆發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有的農(nóng)藥易產(chǎn)生抗性、藥效不明顯等問題，提供一種具有協(xié)同增效作用的苦參堿和蠟蚧輪枝菌的組合物，通過對苦參堿和蠟蚧輪枝菌復(fù)配效果及處理后乙酰膽堿酯酶（AchE）活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，所述組合物復(fù)配后能夠表現(xiàn)出出人意料的協(xié)同增效作用，提高防治效果，并可明顯減低化學(xué)農(nóng)藥單劑的使用劑量、減少環(huán)境污染。

本發(fā)明的目的是提供一種苦參堿和蠟蚧輪枝菌聯(lián)用的殺蟲藥。

本發(fā)明另一目的是提供所述苦參堿和蠟蚧輪枝菌聯(lián)用的殺蟲藥的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種苦參堿和蠟蚧輪枝菌聯(lián)用的殺蟲藥，其以苦參堿和蠟蚧輪枝菌為主要活性成分。

其中，所述蠟蚧輪枝菌是L.muscarium V20，保存在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部生物防治工程研究中心，最初由被侵染的粉虱屬蟲體上分離而來，為中國本土菌株，并非從國外引進(jìn)，能很好地適應(yīng)本地的自然環(huán)境。

其中優(yōu)選地，所述蠟蚧輪枝菌為蠟蚧輪枝菌孢子懸浮液。

優(yōu)選地，所述苦參堿和蠟蚧輪枝菌的用量比按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：蠟蚧輪枝菌的終濃度為0.2×10⁵～1×10⁸分生孢子/mL，苦參堿的終濃度為0.001～5mg/L；且蠟蚧輪枝菌和苦參堿的比例為0.2×10⁸～1×10¹¹分生孢子：0.001～5mg。

更優(yōu)選地，所述苦參堿和蠟蚧輪枝菌的用量比按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：蠟蚧輪枝菌的終濃度為0.2×10⁵～1×10⁸分生孢子/mL，苦參堿的終濃度為0.0025～5mg/L；且蠟蚧輪枝菌和苦參堿的比例為0.2×10⁸～1×10¹¹分生孢子：0.0025～5mg。

更優(yōu)選地，所述苦參堿和蠟蚧輪枝菌的用量比按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：蠟蚧輪枝菌的終濃度為0.5×10⁵～1×10⁸分生孢子/mL，苦參堿的終濃度為0.0025～5mg/L；且蠟蚧輪枝菌和苦參堿的比例為0.5×10⁸～1×10¹¹分生孢子：0.0025～5mg。

更優(yōu)選地，所述苦參堿和蠟蚧輪枝菌的用量比按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：蠟蚧輪枝菌的終濃度為1×10⁵～1×10⁸分生孢子/mL，苦參堿的終濃度為0.005～5mg/L；且蠟蚧輪枝菌和苦參堿的比例為1×10⁸～1×10¹¹分生孢子：0.005～5mg。

另外，優(yōu)選地，所述殺蟲藥是指防治粉虱類害蟲的農(nóng)藥。

即本發(fā)明提供了一種防治粉虱類害蟲的農(nóng)藥，其以苦參堿和蠟蚧輪枝菌為主要活性成分。

本發(fā)明經(jīng)過大量探究和探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦參堿和蠟蚧輪枝菌聯(lián)用能夠產(chǎn)生顯著的協(xié)同增效作用，對粉虱類害蟲具有顯著的防治效果。

因此，上述苦參堿和蠟蚧輪枝菌聯(lián)用的殺蟲藥在作為或制備防治粉虱類害蟲農(nóng)藥方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述粉虱類害蟲為煙粉虱或白粉虱。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種防治效果好、可減少化學(xué)農(nóng)藥使用量、減少環(huán)境污染的含苦參堿和蠟蚧輪枝菌的殺蟲組合物，適應(yīng)了有機(jī)食品生產(chǎn)的需求，對環(huán)境無污染、無殘留，有利于延緩害蟲抗蟲型產(chǎn)生。

本發(fā)明的組合物中的苦參堿和蠟蚧輪枝菌產(chǎn)生了顯著的協(xié)同增效作用，經(jīng)長期的侵染生物學(xué)研究和室內(nèi)生物測定，該蠟蚧輪枝菌與苦參堿的組合使用對煙粉虱和白粉虱等粉虱類類害蟲有很好的防治效果，在煙粉虱的生物防治中具有非常強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖 1為煙粉虱在不同時(shí)間間隔對不同處理的乙酰膽堿酯酶活性。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

本發(fā)明對多株目前已有的蠟蚧輪枝菌菌株株系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，均能與苦參堿組合配對對煙粉虱的生物防治起到協(xié)同增效的作用，以下以菌株蠟蚧輪枝菌L.muscarium V20為例給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例1 蠟蚧輪枝菌與苦參堿組合配對對煙粉虱的室內(nèi)毒力測定

1、實(shí)驗(yàn)材料

蠟蚧輪枝菌：是蠟蚧輪枝菌L.muscarium V20，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部生物防治工程研究中心，最初由被侵染的粉虱屬蟲體上分離而來。本發(fā)明使用的蠟蚧輪枝菌孢子懸浮液最初濃度為1×10⁸個(gè)/ml，經(jīng)逐步稀釋法稀釋到較低濃度用于實(shí)驗(yàn)。

苦參堿粉末（95%）：由廣東陽江新城生物工程提供。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）藥劑分組：苦參堿，蠟蚧輪枝菌，苦參堿和蠟蚧輪枝菌組合。各組用于實(shí)驗(yàn)的蠟蚧輪枝菌、苦參堿及兩者不同濃度比組合如表1所示。

表1 用于實(shí)驗(yàn)的蠟蚧輪枝菌、苦參堿及兩者不同濃度比組合

注：Mt= Matrine，Lm=Lecanicillium muscarium；CT1（2:8）、CT2（5:5）和CT3（8:2）表示苦參堿與蠟蚧輪枝菌以不同比例組合對煙粉虱毒理測定。

（2）室內(nèi)毒力測定時(shí)，棉花作為供試植物，其盆栽苗育于養(yǎng)蟲籠中，將煙粉虱成蟲接入養(yǎng)蟲籠，待其產(chǎn)卵一天后將其全部趕出，籠內(nèi)保持26℃的溫度和14：10的光照，待棉花葉片上的煙粉虱發(fā)育至2齡若蟲時(shí)，采用浸漬法進(jìn)行毒力測驗(yàn)，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)包含4個(gè)葉片，每個(gè)葉片100頭粉虱若蟲，并設(shè)不含藥劑的處理作為空白對照。連續(xù)調(diào)查藥后8天內(nèi)的煙粉虱死亡率，計(jì)算校正死亡率，進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)，然后求出LC₅₀、計(jì)算混合劑的共毒系數(shù)(CTC)。

共毒系數(shù)=（混合制劑的實(shí)際毒性指數(shù)）/（混合制劑的理論毒性指數(shù)）×100

3、室內(nèi)獨(dú)立測定結(jié)果表明（如表2所示）：在施藥8天后，不同濃度的苦參堿間和蠟蚧輪枝菌間與對照組對煙粉虱的死亡率（%）顯著不同?？鄥A、蠟蚧輪枝菌的LC₅₀分別為0.83±0.09、0.11± 0.02mg/L（?5.5×10 5分生孢子/ ml）。

不同濃度苦參堿與不同濃度蠟蚧輪枝菌不同比例（CT1，CT2和CT3）組合對煙粉虱表現(xiàn)很高的死亡率，其中CT1，CT2和CT3的LC₅₀值分別為0.034、0.063和0.21mg/ml，共毒性系數(shù)分別為125.99、200和165.75，均大于120，因此，顯示苦參堿和蠟蚧輪枝菌配合使用具有顯著的協(xié)同增效作用。

表2 各單劑及其組合物對煙粉虱若蟲8d的毒理測定結(jié)果

注：CTC“共毒系數(shù)；相互作用的標(biāo)準(zhǔn)：（1）CTC≤80表現(xiàn)為拮抗作用，80<CTC<120表現(xiàn)為相加作用，CTC≥120表現(xiàn)為協(xié)同增效作用；（2）CTC<100表現(xiàn)為拮抗作用，CTC=100表現(xiàn)為相加作用，CTC>100表現(xiàn)為協(xié)同增效作用。

實(shí)施例2 蠟蚧輪枝菌處理煙粉虱24h后對苦參堿的敏感性測定

1、用如表3所示，用不同濃度蠟蚧輪枝菌處理新蛻皮的2齡煙粉虱若蟲。將葉上處理的若蟲置于干凈的玻璃培養(yǎng)皿（φ20cm）中。將一塊濾紙放在盤子的底部，用200μl水保持水分。24小時(shí)后，將具有被蠟蚧輪枝菌感染的粉虱若蟲的葉片浸在不同濃度的苦參堿（如表3所示）中30秒。每個(gè)處理組（每個(gè)劑量組合）和對照組用同批次的昆蟲和分生孢子懸浮液，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)包含4個(gè)葉片，每葉100頭煙粉虱若蟲。以24小時(shí)間為隔記錄8天的死亡率。

表3 用于實(shí)驗(yàn)的蠟蚧輪枝菌和苦參堿的不同濃度及比例

注：Mt= Matrine，Lm=Lecanicillium muscarium。

2、結(jié)果如表4所示

表4蠟蚧輪枝菌處理煙粉虱24h后對苦參堿的敏感性測定結(jié)果

注：CT4是苦參堿與蠟蚧輪枝菌以5：5比例（濃度比）混合處理，CTC代表共毒性系數(shù); 對于每種治療隨后不同字母提及的死亡率（%±S.E）顯著不同（Tukey檢驗(yàn)，P <0.01）。

結(jié)果如表4所示，在生物測定IV中，組合施用的LC₅₀值為0.02mg/L和共毒性系數(shù)為223，再次顯示苦參堿和蠟蚧輪枝菌之間的顯著協(xié)同增效作用。

實(shí)施例3 煙粉虱在不同時(shí)間間隔對不同處理的乙酰膽堿酯酶活性測定

1、用不同濃度的蠟蚧輪枝菌（1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸分生孢子/ml），苦參堿（5、0.5和0.05mg/L）和蠟蚧輪枝菌+苦參堿組合（5mg/L+1×10⁸分生孢子/ml，0.5mg /L + 1×10⁷分生孢子/ 0.05mg/L + 1×10⁶分生孢子/ml）接種的2齡煙粉虱若蟲（100頭）。收集的若蟲與冰冷的0.05M磷酸鈉緩沖液勻漿（pH7.0）。將勻漿的樣品在4℃下以12000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，并在4℃下以12000rpm離心15分鐘。最終的上清液用作酶制劑。

乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的測定：反應(yīng)混合物含有50μL樣品溶液，100μL 45μM 5-5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），100μL碘化乙酰硫膽堿和90μL磷酸鈉緩沖液。記錄405nm處吸光度的變化，持續(xù)40分鐘。酶活性計(jì)算為每mg蛋白質(zhì)的吸光度變化速率（mOD/min/mg）。

2、結(jié)果如圖1所示。

在用苦參堿處理后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，乙酰膽堿酯酶（AChE）活性在煙粉虱體中增加；當(dāng)用單獨(dú)用蠟蚧輪枝菌處理時(shí)，煙粉虱中的AChE活性在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間增加；用苦參堿和蠟蚧輪枝菌的混合物處理煙粉虱時(shí)，AChE活性在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間也增加。由此說明，這兩種試劑都通過昆蟲攻擊乙酰膽堿的生產(chǎn)，這使得它們的相互作用強(qiáng)烈的協(xié)同。苦參堿和蠟蚧輪枝菌可以靶向昆蟲乙酰膽堿（Ach）受體，進(jìn)而形成協(xié)同增效作用。因此，我們的研究結(jié)果揭示了苦參堿和L. muscarium對煙粉虱協(xié)同作用的復(fù)雜生物化學(xué)過程。