本發(fā)明屬于化學(xué)和微生物領(lǐng)域，具體涉及一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物。

背景技術(shù)：
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異噻唑啉酮類防霉防腐劑是20世紀(jì)60年代左右開發(fā)使用的一種新型殺菌劑，具有高效、低毒、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為新型環(huán)保型殺菌劑，市場(chǎng)占有率不斷提高，引起了生物、醫(yī)藥、化學(xué)界等專家的廣泛關(guān)注，并且此類殺菌劑已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于海洋防污、工業(yè)循環(huán)冷卻水處理、工業(yè)產(chǎn)品防腐、農(nóng)用殺菌和日常洗化用品等方面，而原國(guó)家經(jīng)貿(mào)委也早在2001年就將異噻唑啉酮?dú)⒕鷾缭鍎┝腥搿懂?dāng)前國(guó)家鼓勵(lì)發(fā)展的節(jié)水設(shè)備(產(chǎn)品)目錄(第一批)》(二00一年第5號(hào))中的水處理藥劑使用。1,2-苯并-異噻唑啉-3-酮(BIT)是異噻唑啉酮類防霉防腐劑的典型代表，該藥物在工業(yè)環(huán)境中得到了廣泛的應(yīng)用，但由于該藥物的長(zhǎng)期和不正當(dāng)使用，從而導(dǎo)致越來越多的微生物對(duì)其產(chǎn)生了抗性，由于抗性的產(chǎn)生從而導(dǎo)致洗發(fā)露、洗潔精和涂料等的腐敗變質(zhì)，給生產(chǎn)企業(yè)和使用者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到人類的健康。而從頭開發(fā)一種高效廣譜性的化學(xué)藥劑，則周期長(zhǎng)，成本高，難度大，因此，迫切需要對(duì)現(xiàn)有的殺菌劑進(jìn)行必要的復(fù)配或者添加藥效促進(jìn)成份等來提高殺菌劑的藥效，從而降低防霉防腐劑的實(shí)際使用劑量，減少環(huán)境污染和對(duì)人類健康的潛在負(fù)面影響。

細(xì)菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)是細(xì)菌的一種生存形式，有數(shù)據(jù)表明在自然界中高達(dá)95％的細(xì)菌都是以細(xì)菌生物膜的形式存在，它是一種附著于生物或非生物材料表面，被自身分泌的胞外大分子包裹并具有一定三維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的細(xì)菌群體，其結(jié)構(gòu)構(gòu)成主要包括：水、細(xì)菌、大分子聚合物(蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等)、吸附的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和細(xì)菌裂解產(chǎn)物等。由于生物膜的形成，從而導(dǎo)致細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生，有研究表明，細(xì)菌生物膜的抗藥性比其在浮游狀態(tài)高10-1000倍。細(xì)菌生物膜的形成還會(huì)導(dǎo)致很多的危害，如對(duì)附著的材料表面產(chǎn)生腐蝕作用、污染醫(yī)療器械和引發(fā)人類疾病等，因此，如何控制及清理細(xì)菌生物膜成為一個(gè)熱門的課題。目前，雖然開發(fā)出了許多新型的控制細(xì)菌生物膜形成和發(fā)展的方法以及藥劑，但是，利用化學(xué)殺菌劑來控制生物膜仍然是最有效的手段，并將長(zhǎng)期存在和使用，但與此同時(shí)，細(xì)菌生物膜對(duì)很多殺菌劑產(chǎn)生了抗性，從而使得普遍使用的殺菌劑及其施用濃度已經(jīng)不能控制生物膜的形成，迫切需要開發(fā)出高效的殺菌劑或者復(fù)配物來抑制和滅殺細(xì)菌生物膜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供能夠有效的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及其生物膜形成的效果的協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，該協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物能提高BIT藥物的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及其生物膜形成的效果，從而減少BIT的使用量和降低細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的機(jī)率。

本發(fā)明的協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，其特征在于，包括1,2-苯并異噻唑-3-酮(BIT)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)。

優(yōu)選，所述的1,2-苯并異噻唑-3-酮(BIT)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)是按物質(zhì)的量之比為1：20～80復(fù)配而成。

所述的協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物中的細(xì)菌是假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter spp.)或者葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)等的細(xì)菌。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的細(xì)菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、魏氏檸檬酸桿菌(Citrobacter werkmanii)或者金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。

本發(fā)明的協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物對(duì)細(xì)菌浮游菌的生長(zhǎng)及其生物膜的形成都有殺滅或者抑制作用，且這種殺滅或者抑制作用比單獨(dú)使用任何一種組分都具有更好的效果，因此可以提高BIT藥物的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及其生物膜形成的效果，從而減少BIT的使用量和降低細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的機(jī)率。

本發(fā)明配方簡(jiǎn)單，配制容易，效果顯著，應(yīng)用范圍和前景廣闊。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

測(cè)試方法范例

以下實(shí)施例中的測(cè)試菌株都是用該實(shí)施例中普通Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基(每升含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g)將測(cè)試菌株過夜培養(yǎng)，然后再用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)物稀釋到OD₆₀₀＝1.0配制成菌懸液母液，并按照10％的體積分?jǐn)?shù)接種量加入菌懸液母液，制成菌懸液工作液，同時(shí)按照梯度稀釋的方法在培養(yǎng)體系中加入一定濃度的BIT以及EDTA-2Na，將BIT和EDTA-2Na以及菌懸液工作液充分混合均勻后，吸取150μl上述混合液到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將培養(yǎng)板放入30℃或者37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時(shí)，最后將96孔板取出，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的在600nm處的吸光度值(OD₆₀₀)，以此評(píng)價(jià)BIT和EDTA-2Na對(duì)細(xì)菌浮游菌的抑制效果；然后，輕輕的吸棄浮游菌，清洗板孔3次，并在每個(gè)板孔內(nèi)加入200μl 1％(v/w)結(jié)晶紫染色液，靜置染色30分鐘，吸棄結(jié)晶紫染色液，再用無菌水洗板孔三次，室溫干燥30min后，用200μl 95％的乙醇脫色30min，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)其在595nm處的吸光度值(OD₅₉₅)，以此評(píng)價(jià)BIT和EDTA-2Na對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制效果。

同時(shí)，協(xié)同作用的評(píng)價(jià)方法是使用Kull F.C.等(Applied Microbiology，1961 9:538-541)所述的工業(yè)上認(rèn)同的經(jīng)典方法即協(xié)同指數(shù)來判斷殺菌劑的協(xié)同和拮抗作用。SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，其中QA為化合物A(第一組分)單獨(dú)使用時(shí)對(duì)菌株抑制的最小抑制濃度(MIC)，單位為mM；QB為化合物B(第二組分)單獨(dú)作用時(shí)對(duì)所測(cè)定菌株的最小抑制濃度(MIC)，單位為mM；Qa、Qb為混合物中化合物A、B的濃度，單位為mM。當(dāng)SI＞1時(shí)，表示拮抗作用；當(dāng)SI＝1時(shí)，表示相加性，而且SI＜1時(shí)表示協(xié)同作用，SI值愈低，該特定混合物顯示的協(xié)同作用愈大。

實(shí)施例1：

一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)作為測(cè)試菌株，按照上述測(cè)試方法范例中的方法進(jìn)行測(cè)試，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃靜置培養(yǎng)菌株24h，測(cè)定的BIT對(duì)S.aureus ATCC 6538的MIC為(即QA)：0.4mM；測(cè)定的EDTA-2Na對(duì)S.aureus ATCC 6538的MIC為(即QB)：64mM。在S.aureus ATCC 6538菌株培養(yǎng)液中加入BIT(Qa)，使其終濃度為0.1mM，以及EDTA-2Na(Qb)，使其終濃度為2mM，混合均勻(即96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的混合液中含有BIT 0.1mM和EDTA-2Na 2mM)，BIT(Qa)和EDTA-2Na(Qb)就可有效抑制S.aureus ATCC 6538的生長(zhǎng)，即未見明顯生長(zhǎng)，達(dá)到復(fù)配組合物對(duì)菌株生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)，利用上面提到的公式：SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，計(jì)算得到的SI＝0.281，即SI<1，說明BIT和EDTA-2Na具有協(xié)同抑細(xì)菌復(fù)配增效作用；同時(shí)，用結(jié)晶紫染色法和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株在0.1mM BIT和2mM EDTA-2Na復(fù)配組合物脅迫條件下的細(xì)菌生物膜形成能力，測(cè)得的OD₅₉₅均值為：0.132，與單獨(dú)使用0.1mM BIT或者2mM EDTA-2Na相比，菌株生物膜形成能力(OD₅₉₅-BIT＝0.602或OD₅₉₅-EDTA-2Na＝0.762)，分別下降了78.07％或82.67％，由此可見，使用本發(fā)明所提供一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)，除了可以有效抑制該菌浮游菌的生長(zhǎng)以外，也可以有效的抑制其細(xì)菌生物膜的形成。

實(shí)施例2：

一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)作為測(cè)試菌株，按照上述測(cè)試方法范例中的方法進(jìn)行測(cè)試，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃靜置培養(yǎng)菌株24h，測(cè)定的BIT對(duì)S.aureus ATCC 6538的MIC為(即QA)：0.4mM；測(cè)定的EDTA-2Na對(duì)S.aureus ATCC 6538的MIC為(即QB)：64mM。而在S.aureus ATCC 6538菌株培養(yǎng)液中加入BIT(Qa)，使其終濃度為0.1mM，以及EDTA-2Na(Qb)，使其終濃度為4mM，然后混合均勻(即96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的混合液中含有BIT 0.1mM和EDTA-2Na 4mM)，BIT(Qa)和EDTA-2Na(Qb)就可有效抑制S.aureus ATCC 6538的生長(zhǎng)，即未見明顯生長(zhǎng)，達(dá)到復(fù)配組合物對(duì)菌株生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)，利用上面提到的公式：SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，計(jì)算得到的SI＝0.313，即SI<1，說明BIT和EDTA-2Na具有協(xié)同抑細(xì)菌復(fù)配增效作用；同時(shí)，用結(jié)晶紫染色法和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株在0.1mM BIT和4mM EDTA-2Na復(fù)配組合物脅迫條件下的細(xì)菌生物膜形成能力，測(cè)得的OD₅₉₅均值為：0.118，與單獨(dú)使用0.1mM BIT或者4mM EDTA-2Na相比，菌株生物膜形成能力(OD₅₉₅-BIT＝0.602或OD₅₉₅-EDTA-2Na＝0.756)，分別下降了80.40％或84.39％，由此可見，使用本發(fā)明所提供一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)，除了可以有效抑制該菌浮游菌的生長(zhǎng)以外，也可以有效的抑制其細(xì)菌生物膜的形成。

實(shí)施例3：

一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)作為測(cè)試菌株，按照上述測(cè)試方法范例中的方法進(jìn)行測(cè)試，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃靜置培養(yǎng)菌株24h，測(cè)定的BIT對(duì)S.aureus ATCC 6538的MIC為(即QA)：0.4mM；測(cè)定的EDTA-2Na對(duì)S.aureus ATCC 6538的MIC為(即QB)：64mM。而在S.aureus ATCC 6538菌株培養(yǎng)液中加入BIT(Qa)，使其終濃度為0.1mM，以及EDTA-2Na(Qb)，使其終濃度為8mM，然后混合均勻(即96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的混合液中含有BIT 0.1mM和EDTA-2Na 8mM)，BIT(Qa)和EDTA-2Na(Qb)就可有效抑制S.aureus ATCC 6538的生長(zhǎng)，即未見明顯生長(zhǎng)，達(dá)到復(fù)配組合物對(duì)菌株生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)，利用上面提到的公式：SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，計(jì)算得到的SI＝0.375，即SI<1，說明BIT和EDTA-2Na具有協(xié)同抑細(xì)菌復(fù)配增效作用；同時(shí)，用結(jié)晶紫染色法和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株在0.1mM BIT和8mM EDTA-2Na復(fù)配組合物脅迫條件下的細(xì)菌生物膜形成能力，測(cè)得的OD₅₉₅均值為：0.116，與單獨(dú)使用0.1mM BIT或者8mM EDTA-2Na相比，菌株生物膜形成能力(OD₅₉₅-BIT＝0.602或OD₅₉₅-EDTA-2Na＝0.742)，分別下降了80.73％或84.37％，由此可見，使用本發(fā)明所提供一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)，除了可以有效抑制該菌浮游菌的生長(zhǎng)以外，也可以有效的抑制其細(xì)菌生物膜的形成。

實(shí)施例4：

一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)作為測(cè)試菌株，按照上述測(cè)試方法范例中的方法進(jìn)行測(cè)試，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在30℃靜置培養(yǎng)菌株24h，測(cè)定的BIT對(duì)P.aeruginosa ATCC 9027的MIC為(即QA)：0.56mM；測(cè)定的EDTA-2Na對(duì)P.aeruginosa ATCC 9027的MIC為(即QB)：64mM。而在Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027菌株培養(yǎng)液中加入BIT(Qa)，使其終濃度為0.1mM，以及EDTA-2Na(Qb)，使其終濃度為2mM，然后混合均勻(即96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的混合液中含有BIT 0.1mM和EDTA-2Na 2mM)，BIT(Qa)和EDTA-2Na(Qb)就可有效抑制P.aeruginosa ATCC 9027的生長(zhǎng)，即未見明顯生長(zhǎng)，達(dá)到復(fù)配組合物對(duì)菌株生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)，利用上面提到的公式：SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，計(jì)算得到的SI＝0.210，即SI<1，說明BIT和EDTA-2Na具有協(xié)同抑細(xì)菌復(fù)配增效作用；同時(shí)，用結(jié)晶紫染色法和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株在0.1mM BIT和2mM EDTA-2Na復(fù)配組合物脅迫條件下的細(xì)菌生物膜形成能力，測(cè)得的OD₅₉₅均值為：0.134，與單獨(dú)使用0.1mM BIT或者2mM EDTA-2Na相比，菌株生物膜形成能力(OD₅₉₅-BIT＝1.207或OD₅₉₅-EDTA-2Na＝0.832)，分別下降了88.90％或83.89％，由此可見，使用本發(fā)明所提供一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物培養(yǎng)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)，除了可以有效抑制該菌浮游菌的生長(zhǎng)以外，也可以有效的抑制其細(xì)菌生物膜的形成。

實(shí)施例5：

一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)作為測(cè)試菌株，按照上述測(cè)試方法范例中的方法進(jìn)行測(cè)試，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在30℃靜置培養(yǎng)菌株24h，測(cè)定的BIT對(duì)P.aeruginosa ATCC 9027的MIC為(即QA)：0.56mM；測(cè)定的EDTA-2Na對(duì)P.aeruginosa ATCC 9027的MIC為(即QB)：64mM。而在Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027菌株培養(yǎng)液中加入BIT(Qa)，使其終濃度為0.1mM，以及EDTA-2Na(Qb)，使其終濃度為4mM，然后混合均勻(即96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的混合液中含有BIT 0.1mM和EDTA-2Na 4mM)，BIT(Qa)和EDTA-2Na(Qb)就可有效抑制P.aeruginosa ATCC 9027的生長(zhǎng)，即未見明顯生長(zhǎng)，達(dá)到復(fù)配組合物對(duì)菌株生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)，利用上面提到的公式：SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，計(jì)算得到的SI＝0.241，即SI<1，說明BIT和EDTA-2Na具有協(xié)同抑細(xì)菌復(fù)配增效作用；同時(shí)，用結(jié)晶紫染色法和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株在0.1mM BIT和4mM EDTA-2Na復(fù)配組合物脅迫條件下的細(xì)菌生物膜形成能力，測(cè)得的OD₅₉₅均值為：0.121，與單獨(dú)使用0.1mM BIT或者4mM EDTA-2Na相比，菌株生物膜形成能力(OD₅₉₅-BIT＝1.207或OD₅₉₅-EDTA-2Na＝0.649)，分別下降了89.98％或81.36％，由此可見，使用本發(fā)明所提供一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物培養(yǎng)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)，除了可以有效抑制該菌浮游菌的生長(zhǎng)以外，也可以有效的抑制其細(xì)菌生物膜的形成。

實(shí)施例6：

一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物，用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)作為測(cè)試菌株，按照上述測(cè)試方法范例中的方法進(jìn)行測(cè)試，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在30℃靜置培養(yǎng)菌株24h，測(cè)定的BIT對(duì)P.aeruginosa ATCC 9027的MIC為(即QA)：0.56mM；測(cè)定的EDTA-2Na對(duì)P.aeruginosa ATCC 9027的MIC為(即QB)：64mM。而在Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027菌株培養(yǎng)液中加入BIT(Qa)，使其終濃度為0.1mM，以及EDTA-2Na(Qb)，使其終濃度為8mM，然后混合均勻(即96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的混合液中含有BIT 0.1mM和EDTA-2Na 8mM)，BIT(Qa)和EDTA-2Na(Qb)就可有效抑制P.aeruginosa ATCC 9027的生長(zhǎng)，即未見明顯生長(zhǎng)，達(dá)到復(fù)配組合物對(duì)菌株生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)，利用上面提到的公式：SI(協(xié)同指數(shù))＝Qa/QA+Qb/QB，計(jì)算得到的SI＝0.304，即SI<1，說明BIT和EDTA-2Na具有協(xié)同抑細(xì)菌復(fù)配增效作用；同時(shí)，用結(jié)晶紫染色法和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株在0.1mM BIT和8mM EDTA-2Na復(fù)配組合物脅迫條件下的細(xì)菌生物膜形成能力，測(cè)得的OD₅₉₅均值為：0.129，與單獨(dú)使用0.1mM BIT或者8mM EDTA-2Na相比，菌株生物膜形成能力(OD₅₉₅-BIT＝1.207或OD₅₉₅-EDTA-2Na＝0.801)，分別下降了89.31％或83.90％，由此可見，使用本發(fā)明所提供一種協(xié)同抑細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的組合物培養(yǎng)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)，除了可以有效抑制該菌浮游菌的生長(zhǎng)以外，也可以有效的抑制其細(xì)菌生物膜的形成。