本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

由植物病原真菌葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea引起的葡萄灰霉病是全世界葡萄生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害之一，可導(dǎo)致成熟期果實(shí)腐爛或裂果，完全喪失商品價值，嚴(yán)重發(fā)生時可造成高達(dá)50％左右的產(chǎn)量損失，對葡萄產(chǎn)業(yè)影響極大。隨著設(shè)施栽培葡萄的興起，大棚內(nèi)溫、濕度小氣候環(huán)境十分有利于葡萄灰霉病菌的侵染與為害。葡萄炭疽病(Grape bitter rot，又名葡萄晚腐病)是我國乃至全世界葡萄生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的真菌病害之一，其病原為炭疽菌屬(Colletotrichum spp.)真菌，其中，C.gloeosporioides是引起葡萄炭疽病的主要類群，其主要危害葡萄果實(shí)，一般情況下可造成產(chǎn)量損10％～15％，如遇潮濕、多雨年份易造成大流行，病穗率達(dá)50％～70％。隨著設(shè)施葡萄栽培的興起，大棚內(nèi)溫濕度小氣候環(huán)境十分有利于灰霉病菌和炭疽病菌的侵染與危害，這兩種病害逐漸發(fā)展為設(shè)施葡萄生產(chǎn)的主要病害。B.cinerea是一種強(qiáng)腐生性致病菌，寄主范圍廣，不同寄主植物間的B.cinerea可相互侵染致病，在作物種質(zhì)資源中尚未發(fā)現(xiàn)完全抗病的材料，也很難培育出抗病品種。因此目前對灰霉病仍以化學(xué)防治為主，輔以生物防治和生態(tài)防治。常用殺菌劑包括苯并咪唑類、二甲酰亞胺類及甲氧基丙烯酸酯類等，但由于B.cinerea群體結(jié)構(gòu)多樣，繁殖速度快，菌株變異速率快且突變菌系田間適應(yīng)性強(qiáng)等原因，病原菌對上述殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，某些地區(qū)農(nóng)藥防效明顯下降，增加了灰霉病防治的難度。葡萄炭疽病的防治以化學(xué)防治為主，常用農(nóng)藥有苯并咪唑類和相關(guān)衍生物、脫甲基抑制劑(DMIs)、二甲酞亞胺類、氨基甲酸酯類等，但由于C.gloeosporioides群體結(jié)構(gòu)遺傳多樣，以及單一作用位點(diǎn)化學(xué)農(nóng)藥長期使用產(chǎn)生的快速變異菌株且突變菌系田間適應(yīng)性強(qiáng)，使這兩種病原菌對這些藥劑都產(chǎn)生了不同程度的抗性，有的地區(qū)農(nóng)藥防效明顯下降，給葡萄灰霉病和炭疽病防治帶來了很大的困難。同時，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用也帶來了農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題，采用低毒、低殘留，不污染環(huán)境的拮抗微生物防治植物病害成為近年的研究熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)多種真菌、細(xì)菌或其它微生物對灰霉菌和炭疽菌具有寄生或拮抗作用，而且已經(jīng)有商品制劑應(yīng)用于生產(chǎn)，但是至今仍存在一些亟待解決的問題。首先，目前開發(fā)的生防資源易受外界條件的影響，不容易在植物體內(nèi)定殖，防治效果不穩(wěn)定。其次，生防菌發(fā)酵液不易儲存和運(yùn)輸，在使用過程中，制發(fā)酵液繁瑣，不易操縱，且單一使用效果并不理想，見效期長，不利于進(jìn)一步推廣應(yīng)用。目前研究表明，化學(xué)農(nóng)藥往往作用位點(diǎn)單一，有害生物抗藥性風(fēng)險極高，并造成大量環(huán)境污染以及人畜中毒現(xiàn)象，違背了“綠色植?！钡囊?。因此，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，并不利于有害生物的防控及生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌是一種能在植物組織中定殖與運(yùn)轉(zhuǎn)，對植物無害甚至有益的微生物，由于它在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，且能產(chǎn)生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質(zhì)，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。造成近幾年，內(nèi)生菌因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)成為生物防治的研究熱點(diǎn)，為生物防治的應(yīng)用開辟了新的天地。

綜上所述，目前開發(fā)的生防資源易受外界條件的影響，不容易在植物體內(nèi)定殖，防治效果不穩(wěn)定；生防菌發(fā)酵液不易儲存和運(yùn)輸，在使用過程中，制發(fā)酵液繁瑣，不易操縱，且單一使用效果并不理想，見效期長，不利于進(jìn)一步推廣應(yīng)用；化學(xué)農(nóng)藥往往作用位點(diǎn)單一，有害生物抗藥性風(fēng)險極高，并造成大量環(huán)境污染以及人畜中毒現(xiàn)象。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑及其制備方法，旨在解決目前開發(fā)的生防資源易受外界條件的影響，不容易在植物體內(nèi)定殖，防治效果不穩(wěn)定；生防菌發(fā)酵液不易儲存和運(yùn)輸，在使用過程中，制發(fā)酵液繁瑣，不易操縱，且單一使用效果并不理想，見效期長，不利于進(jìn)一步推廣應(yīng)用；化學(xué)農(nóng)藥往往作用位點(diǎn)單一，有害生物抗藥性風(fēng)險極高，并造成大量環(huán)境污染以及人畜中毒現(xiàn)象的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑，所述枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑由枯草芽孢桿菌EDR4和化學(xué)農(nóng)藥A組成。

進(jìn)一步，所述枯草芽孢桿菌EDR4，CGMCC No.2133。

進(jìn)一步，所述枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑為液體懸浮狀。

進(jìn)一步，所述枯草芽孢桿菌EDR4的活菌數(shù)量為1.593×10³CFU/mL。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑的制備方法，所述枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑的制備方法包括以下步驟：

步驟一，將-80℃下保存的枯草芽孢桿菌EDR4菌株在LB固體培養(yǎng)基上活化，挑取枯草芽孢桿菌EDR4單菌落，接種于100mL的LB培養(yǎng)液，于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)18h～24h；

步驟二，然后按照1％的種子液接種到100mL的LB培養(yǎng)液中，于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)48h；將得到的發(fā)酵液12000rpm離心5min，收集枯草芽孢桿菌EDR4菌體；

步驟三，用無菌水懸浮，配制終濃度為1×10⁸CFU/mL的菌懸液，與1化學(xué)農(nóng)藥A混合后獲得到微生物復(fù)配制劑。

進(jìn)一步，所述LB培養(yǎng)液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl和1000mL蒸餾水組成，其pH值為7.2。

進(jìn)一步，所述化學(xué)農(nóng)藥A為水分散粒劑。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑制備的防治葡萄灰霉病制劑。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑制備的防治炭疽病制劑。

本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑及其制備方法，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4和化學(xué)農(nóng)藥A為活性成份的微生物復(fù)配制劑制備簡單，操作方便，易于儲藏和運(yùn)輸，對農(nóng)作物無藥害，并能保持一定的活菌量，顯著抑制病菌菌絲的生長。因此，利用本發(fā)明所制備的微生物復(fù)配制劑能夠應(yīng)用在防治葡萄灰霉病和炭疽病中。所述復(fù)配制劑對葡萄灰霉農(nóng)菌和葡萄炭疽病菌抑菌效果優(yōu)異，防病效果良好且穩(wěn)定；農(nóng)藥使用成本降低，易于制備。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑的制備方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的活性成分EDR4菌株對四種化學(xué)農(nóng)藥的耐受性示意圖；(A藥濃度為1000mg/L,B藥濃度為100mg/L,C藥濃度為500mg/L,D藥濃度為1000mg/L)。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的制備的微生物復(fù)配制劑對葡萄灰霉病菌生長的抑制作用示意圖；(A為農(nóng)藥A處理，B為微生物復(fù)配制劑AEDR4處理,C為EDR4處理，D為CK)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的制備的微生物復(fù)配制劑對葡萄炭疽病菌生長的抑制作用示意圖；(A為農(nóng)藥A處理，B為微生物復(fù)配制劑AEDR4處理,C為EDR4處理，D為CK；下同)。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的制備的微生物復(fù)配制劑處理后葡萄灰霉病和葡萄炭疽病病情指數(shù)示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4和化學(xué)農(nóng)藥A組成。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4，16S rRNA基因編號(GenBank)為GU258545.1?；瘜W(xué)農(nóng)藥A為水分散粒劑。

所述枯草芽孢桿菌EDR4，保藏編號CGMCC No.2133，于2007年8月16日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心收到，并登記入冊，由2007年8月16日起保存三十年；保藏中心于2007年8月16日監(jiān)測，結(jié)果是存活；建議的分類命名：芽孢桿菌Bacillus sp.請求保藏人：康振生，西北農(nóng)林科技大學(xué)；地址：陜西省楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)生物技術(shù)中心。

本發(fā)明枯草芽孢桿菌分離自我國陜西省田間自然生長的小麥根部，經(jīng)菌落和形態(tài)的顯微觀察、染色反應(yīng)、常規(guī)生理生化特性實(shí)驗(yàn)以及16s rDNA序列分析，該菌株鑒定為芽孢桿菌的一個新菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4。

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保存方法為：在含25％甘油的NBY培養(yǎng)基(蛋白胨5g，牛肉粉3g，酵母粉3g，蒸餾水1000mL)–80℃保存。

本發(fā)明所制備的微生物復(fù)配制劑中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4和化學(xué)農(nóng)藥A，其中，EDR4菌株保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；化學(xué)農(nóng)藥A生產(chǎn)商為瑞士先正達(dá)農(nóng)化公司。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的枯草芽孢桿菌和化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配制劑的制備方法包括以下步驟：

S101：將-80℃下保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌株在LB固體培養(yǎng)基上活化，挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4單菌落，接種于100mL的LB培養(yǎng)液(250mL三角瓶)，于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)18～24h；

S102：然后按照1％的種子液接種到100mL的LB培養(yǎng)液中，于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)48h。將得到的發(fā)酵液12000rpm離心5min，收集枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌體；

S103：用無菌水懸浮，配制終濃度為1×10⁸CFU/mL的菌懸液，與化學(xué)農(nóng)藥A混合后獲得到微生物復(fù)配制劑。

LB培養(yǎng)液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸餾水組成，其pH值為7.2。

所述的化學(xué)農(nóng)藥A機(jī)型為水分散粒劑。配制時，直接稱重加入。

所述本發(fā)明的微生物復(fù)配制劑制劑為液體懸浮狀，無分層等現(xiàn)象，其中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4的活菌數(shù)量為1.593×10³CFU/mL。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4的發(fā)酵培養(yǎng)

將-80℃下保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4在LB固體培養(yǎng)基上活化，挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4單菌落，接種于100mL的LB培養(yǎng)液(250mL三角瓶)，28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)18～24h，然后按照1％的種子液接種到100mL的LB培養(yǎng)液中，于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)48h，得到菌體的發(fā)酵產(chǎn)物一。其中，LB培養(yǎng)液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸餾水組成，pH值為7.2。

實(shí)施例2

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4對四種化學(xué)農(nóng)藥耐受性測定的方法

實(shí)施例1中的兩種發(fā)酵液12000rpm離心5min，收集枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌體,用無菌水懸浮，配制終濃度為1×10⁸CFU/mL的菌懸液，稀釋后涂布于含有化學(xué)農(nóng)藥A、B、C、D(濃度為1000mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L)的LB平板上，測定其對化學(xué)農(nóng)藥A、B、C、D的耐受性。

如圖2所示，結(jié)果表明草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌株在化學(xué)農(nóng)藥A平板上正常生長。EDR4菌體濃度為5.42×10¹CFU/mL時，化學(xué)農(nóng)藥B、C和D完全抑制其生長，而化學(xué)農(nóng)藥A抑制作用最小。同時，EDR4菌體在化學(xué)農(nóng)藥A(1000mg/L)平板上穩(wěn)定生長，且活性穩(wěn)定。

實(shí)施例3

以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4和化學(xué)農(nóng)藥A為活性成分的微生物復(fù)配制劑的制備方法

向?qū)嵤├?中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌懸液中加入等量化學(xué)農(nóng)藥A(體積,mL/質(zhì)量，g)，然后渦旋混勻，制劑無結(jié)塊分層。于室溫條件下密封保存。

下面結(jié)合試驗(yàn)對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的描述。

試驗(yàn)例1

微生物復(fù)配制劑對葡萄灰霉菌抑菌活性檢測試驗(yàn)

取微生物復(fù)配制劑1mL，加入100mL PDA中，采用菌絲生長速率法檢測兩種微生物復(fù)配制劑對葡萄灰霉菌菌絲生長的影響。待PDA培養(yǎng)基溫度低于40℃時加入微生物復(fù)配制劑倒板，于PDA平板中央放置培養(yǎng)3d的葡萄灰霉病菌。以在PDA培養(yǎng)基中加入等量化學(xué)農(nóng)藥A和實(shí)施例2中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌懸液為另外處理，以滴加清水的處理作為對照，每個處理設(shè)置三次重復(fù)。于25℃恒溫培養(yǎng)5d后，觀察菌絲的生長情況，測量菌落直徑。

如圖3所示，通過生長速率測定發(fā)現(xiàn)，將微生物復(fù)配制劑稀釋100倍后，仍可以顯著抑制葡萄灰霉菌的生長，處理后菌落直徑均小于10mm。

試驗(yàn)例2

微生物復(fù)配制劑對葡萄炭疽菌抑菌活性檢測試驗(yàn)

取微生物復(fù)配制劑1mL，加入100mL PDA中，采用菌絲生長速率法檢測兩種微生物復(fù)配制劑對葡萄炭疽菌菌絲生長的影響。待PDA培養(yǎng)基溫度低于40℃時加入微生物復(fù)配制劑倒板，于PDA平板中央放置培養(yǎng)3d的葡萄炭疽病菌。以在PDA培養(yǎng)基中加入等量化學(xué)農(nóng)藥A和實(shí)施例2中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4菌懸液為另外處理，以滴加清水的處理作為對照，每個處理設(shè)置三次重復(fù)。于25℃恒溫培養(yǎng)5d后，觀察菌絲的生長情況，測量菌落直徑。

如圖4所示，通過生長速率測定發(fā)現(xiàn)，將微生物復(fù)配制劑稀釋100倍后，仍可以顯著抑制葡萄炭疽病的生長，處理后菌落直徑均小于10mm。

試驗(yàn)例3

以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)EDR4和化學(xué)農(nóng)藥A為活性成分的微生物復(fù)配制劑對葡萄灰霉病和炭疽病的室內(nèi)防效

選取大小、成熟度一致的新鮮紅提，進(jìn)行以下處理：每處理5個果粒，設(shè)3個重復(fù)。先將葡萄在藥劑液(100倍稀釋)中充分浸潤10min后晾干表面水分，刺傷(D＝4mm的圓形傷口)并接種灰霉病菌(炭疽病菌)菌餅(D＝5mm)，LB液體培養(yǎng)基作對照，在27℃保溫、保濕7d后觀察病斑大小，并按下列葡萄灰霉病分級標(biāo)準(zhǔn)記錄計算病情指數(shù)和相對防效。

0級全果無病

1級果粒腐爛面積1/4以下；

2級果粒腐爛面積1/4～1/2；

3級果粒腐爛面積1/2～3/4；

4級果粒腐爛面積3/4以上。

病情指數(shù)＝∑(各級病果數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查果粒數(shù)×4)×100；相對防效(％)＝(對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

通過EDR4微生物復(fù)配制劑100倍稀釋液的處理葡萄灰霉菌和葡萄炭疽菌對葡萄果實(shí)的侵染和菌絲的擴(kuò)展受到顯著地抑制作用；如圖5所示，EDR4微生物復(fù)配制劑100倍稀釋液處理后葡萄灰霉病和葡萄炭疽病病情指數(shù)分別為27.75和15.83，防效分別為65.63％和69.84％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。