本發(fā)明屬于穩(wěn)定同位素分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測植物樣品的前處理方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在梨的矮化密植栽培中，梨的矮化砧及砧穗組合(砧木與品種組合)的綜合栽培性狀是一項重要的研究內(nèi)容，其中，水分利用率和生物節(jié)水性又是一項重要的生理指標。目前在梨的栽培生理研究中，使用最為廣泛的是采用便攜式光合系統(tǒng)進行瞬時水分利用率測定，但是其測定結(jié)果不能反映梨的生長周期中長期水分利用率(WUE)的整體情況，而且篩選周期較長，結(jié)果的準確性也不夠好，對于梨屬矮化砧的篩選和鑒定影響較大。
由于梨屬砧木之間的碳穩(wěn)定同位素代謝存在著差異，尤其梨屬矮化砧木和喬化砧木之間差異較大，因此碳穩(wěn)定同位素法檢測梨屬砧木的水分利用率和生物節(jié)水性逐漸被廣泛使用。
目前在碳穩(wěn)定同位素對植物長期水分利用率的檢測中，植物樣品的前處理多沿用聚乙二醇溶液脅迫處理方法。但聚乙二醇溶液脅迫處理更適用于植物苗期和短期的脅迫處理，不適用于長時間的水分脅迫處理，尤其是不利于多年生梨樹的長期水分利用率檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供的一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，解決了現(xiàn)有植物樣品前處理方法中，聚乙二醇溶液脅迫處理不適合多年生植物的長時間水分脅迫處理的問題。
本發(fā)明的目的是提供一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，包括以下步驟：
步驟1，分別將珍珠巖和石英砂晾曬、自然風(fēng)干，然后將珍珠巖和石英砂按1:1-9的體積比例混合，得到珍珠巖-石英砂混合物，然后置于容器中，加入營養(yǎng)液浸泡12-24h，然后瀝掉多余水分，得到珍珠巖-石英砂基質(zhì)；
步驟2，根據(jù)待檢測植物苗木的大小，選擇栽培容器，將珍珠巖-石英砂基質(zhì)裝入容器內(nèi)，并將待檢測植物苗木栽植于栽培容器內(nèi)；
步驟3，常規(guī)栽培管理緩苗培養(yǎng)；
步驟4，進行水分脅迫培養(yǎng)，包括：測定珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量；向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量的30-100％；常規(guī)栽培管理，直至得到生長期的植物；
步驟5，取生長期植物的健康完整葉片，洗凈，除去表面多余水分，然后于105℃殺青15分鐘，之后于65℃恒溫烘干至恒重，得到烘干的葉片；
步驟6，取烘干的葉片研磨成細粉，過100目篩，得到用于碳穩(wěn)定同位素檢測的樣品；
其中，所述營養(yǎng)液按以下濃度的組分配制而成：0.6-0.65g/L的KNO3、0.9-0.95g/L的Ca(NO3)2、0.20-0.25g/L的NH4H2PO4、0.10-0.15g/L的MgSO4、3.6-3.8mg/L的KCl、0.6-0.62mg/L的H3BO3、0.29-0.31mg/L的MnSO4、0.31-0.33mg/L的ZnSO4、0.11-0.13mg/L的CuSO4、0.079-0.081mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.6-18.8mg/L的Fe-EDTA，溶劑為水。
優(yōu)選的，步驟1中，珍珠巖和石英砂的體積比例為1:2。
優(yōu)選的，步驟1中，營養(yǎng)液浸泡的時間為12h。
優(yōu)選的，步驟4中，向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量的40-50％。
優(yōu)選的，步驟4中，向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量的70-80％。
優(yōu)選的，所述營養(yǎng)液按以下濃度的組分配制而成：0.6g/L的KNO3、0.9g/L的Ca(NO3)2、0.23g/L的NH4H2PO4、0.12g/L的MgSO4、3.7mg/L的KCl、0.6mg/L的H3BO3、0.3mg/L的MnSO4、0.32mg/L的ZnSO4、0.13mg/L的CuSO4、0.08mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.8mg/L的Fe-EDTA，溶劑為水。
本發(fā)明還提供了一種上述用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，在梨屬砧木的水分利用率研究中的樣品預(yù)處理的應(yīng)用。
優(yōu)選的，上述應(yīng)用中，所述栽培容器采用圓柱狀的塑料盆，且該塑料盆的高30cm，外直徑為27cm，內(nèi)直徑為23cm。
優(yōu)選的，上述應(yīng)用中，步驟4中取生長期梨屬砧木的枝條頂端向下第7-10個葉片。
本發(fā)明提供的一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，將營養(yǎng)液水培和盆栽控水脅迫處理有機的結(jié)合在一起，應(yīng)用于碳穩(wěn)定同位素的檢測，與營養(yǎng)土盆栽控水方法相比，試驗的均一性更好，試驗中的影響因子較為單一，試驗干擾因素容易排除，可控性更好，能夠達到更為理想的控水效果，檢測數(shù)據(jù)和結(jié)果更為準確可靠?？梢詼蚀_而較快的得到多年生梨屬矮化砧和砧穗組合整個生長季或某生長階段的長期水分利用率數(shù)據(jù)和結(jié)果，用于梨屬矮化砧和砧穗組合的長期水分利用率和綜合栽培性狀的篩選鑒定，提高試驗研究的效率。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。
本發(fā)明一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，包括以下步驟：
步驟1，分別將珍珠巖和石英砂晾曬、自然風(fēng)干，然后將珍珠巖和石英砂按1:1-9的體積比例混合，得到珍珠巖-石英砂混合物，然后置于容器中，加入營養(yǎng)液浸泡12-24h，然后瀝掉多余水分，得到珍珠巖-石英砂基質(zhì)；
其中，所述營養(yǎng)液按以下濃度的組分配制而成：0.6-0.65g/L的KNO3、0.9-0.95g/L的Ca(NO3)2、0.20-0.25g/L的NH4H2PO4、0.10-0.15g/L的MgSO4、3.6-3.8mg/L的KCl、0.6-0.62mg/L的H3BO3、0.29-0.31mg/L的MnSO4、0.31-0.33mg/L的ZnSO4、0.11-0.13mg/L的CuSO4、0.079-0.081mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.6-18.8mg/L的Fe-EDTA，溶劑為水。
步驟2，根據(jù)待檢測植物苗木的大小，選擇栽培容器，將珍珠巖-石英砂基質(zhì)裝入容器內(nèi)，并將待檢測植物苗木栽植于栽培容器內(nèi)；
步驟3，常規(guī)栽培管理緩苗培養(yǎng)；
需要說明的是，該緩苗培養(yǎng)之后，可以根據(jù)具體試驗要求確定開始進行下一步試驗操作。
步驟4，進行水分脅迫培養(yǎng)，包括：測定珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量；向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液(維持珍珠巖-石英砂基質(zhì)含水量的時候，水分-營養(yǎng)液可交替補充)，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量的30-100％；常規(guī)栽培管理，直至得到生長期的植物。
需要說明的而是，分別將珍珠巖和石英砂晾曬、自然風(fēng)干后的含水量可忽略不計；珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量是用水將珍珠巖-石英砂混合物浸泡，使其充分吸水飽和，然后瀝掉多余的水分，得到水分飽和混合物，測定水分飽和混合物的質(zhì)量(W1)，同時測定珍珠巖-石英砂混合物浸水前的質(zhì)量(W2)，根據(jù)公式(W1-W2)/W2計算得到該珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量。
需要說明的是，所述生長期的植物是本領(lǐng)域人員常規(guī)認知的植物葉片數(shù)量充足、達到試驗要求，長勢基本一致的植物。
步驟5，取生長期植物的健康完整葉片，洗凈，除去表面多余水分，然后于105℃殺青15分鐘，之后于65℃恒溫烘干至恒重，得到烘干的葉片。
需要說明的是，應(yīng)當所取的生長期植物的健康完整葉片樣品，置于1-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
需要說明的是，將除去表面多余水分后的葉片置于電熱恒溫干燥箱中105℃殺青15分鐘，之后于65℃恒溫烘干至恒重。
步驟6，取烘干的葉片研磨成細粉，過100目篩，得到用于碳穩(wěn)定同位素檢測的樣品。
下面以梨屬砧木為例，說明本發(fā)明樣品前處理的方法。
實施例1
一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，具體包括以下步驟：
步驟1，分別將珍珠巖和石英砂晾曬、自然風(fēng)干，然后將珍珠巖和石英砂按1:2的體積比例混合，得到珍珠巖-石英砂混合物，然后置于容器中，加入營養(yǎng)液浸泡12h，然后瀝掉多余水分，得到珍珠巖-石英砂基質(zhì)。
其中，所述營養(yǎng)液中含有以下組分：0.6g/L的KNO3、0.9g/L的Ca(NO3)2、0.23g/L的NH4H2PO4、0.12g/L的MgSO4、3.7mg/L的KCl、0.6mg/L的H3BO3、0.3mg/L的MnSO4、0.32mg/L的ZnSO4、0.13mg/L的CuSO4、0.08mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.8mg/L的Fe-EDTA，溶劑為水。
步驟2，根據(jù)待檢測植物苗木的大小，選擇栽培容器，將珍珠巖-石英砂基質(zhì)裝入容器內(nèi)，并將待檢測植物苗木栽植于栽培容器內(nèi)。
步驟3，常規(guī)栽培管理緩苗培養(yǎng)7天。
步驟4，進行水分脅迫培養(yǎng)，包括：測定珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量，向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量70-80％，常規(guī)栽培管理90天，直至得到生長期的植物。
步驟5，取生長期植物的健康完整葉片，洗凈，用干凈紗布吸凈葉片表面多余水分，然后于105℃殺青15分鐘，之后于65℃恒溫烘干至恒重，得到烘干的葉片。
步驟6，取烘干的葉片研磨成細粉，過100目篩，得到用于碳穩(wěn)定同位素檢測的樣品。
實施例2
一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，具體包括以下步驟：
步驟1，分別將珍珠巖和石英砂晾曬、自然風(fēng)干，然后將珍珠巖和石英砂按1:9的體積比例混合，得到珍珠巖-石英砂混合物，然后置于容器中，加入營養(yǎng)液浸泡24h，然后瀝掉多余水分，得到珍珠巖-石英砂基質(zhì)。
其中，所述營養(yǎng)液中含有以下組分：0.65g/L的KNO3、0.95g/L的Ca(NO3)2、0.20g/L的NH4H2PO4、0.10g/L的MgSO4、3.6mg/L的KCl、0.62mg/L的H3BO3、0.29mg/L的MnSO4、0.31mg/L的ZnSO4、0.11mg/L的CuSO4、0.079mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.6mg/L的Fe-EDTA，溶劑為水。
步驟2，根據(jù)待檢測植物苗木的大小，選擇栽培容器，將珍珠巖-石英砂基質(zhì)裝入容器內(nèi)，并將待檢測植物苗木栽植于栽培容器內(nèi)。
步驟3，常規(guī)栽培管理緩苗培養(yǎng)10天。
步驟4，進行水分脅迫培養(yǎng)，包括：測定珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量，向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量70-80％，常規(guī)栽培管理80天，直至得到生長期的植物。
步驟5，取生長期植物的健康完整葉片，洗凈，用干凈紗布吸凈葉片表面多余水分，然后于105℃殺青15分鐘，之后于65℃恒溫烘干至恒重，得到烘干的葉片。
步驟6，取烘干的葉片研磨成細粉，過100目篩，得到用于碳穩(wěn)定同位素檢測的樣品。
實施例3
一種用于碳穩(wěn)定同位素檢測的植物樣品的前處理方法，具體包括以下步驟：
步驟1，分別將珍珠巖和石英砂晾曬、自然風(fēng)干，然后將珍珠巖和石英砂按1:1的體積比例混合，得到珍珠巖-石英砂混合物，然后置于容器中，加入營養(yǎng)液浸泡18h，然后瀝干，得到珍珠巖-石英砂基質(zhì)。
其中，所述營養(yǎng)液中含有以下組分：0.63g/L的KNO3、0.93g/L的Ca(NO3)2、0.25g/L的NH4H2PO4、0.15g/L的MgSO4、3.8mg/L的KCl、0.6mg/L的H3BO3、0.29mg/L的MnSO4、0.33mg/L的ZnSO4、0.11mg/L的CuSO4、0.08mg/L的(NH4)6Mo7O24、18.7mg/L的Fe-EDTA，溶劑為水。
步驟2，根據(jù)待檢測植物苗木的大小，選擇栽培容器，將珍珠巖-石英砂基質(zhì)裝入容器內(nèi)，并將待檢測植物苗木栽植于栽培容器內(nèi)。
步驟3，常規(guī)栽培管理緩苗培養(yǎng)14天。
步驟4，進行水分脅迫培養(yǎng)，包括：測定珍珠巖-石英砂混合物的最大持水量，向栽培容器內(nèi)交替補充水分和營養(yǎng)液，使栽培容器內(nèi)珍珠巖-石英砂基質(zhì)的含水量為最大持水量40-50％，常規(guī)栽培管理60天，直至得到生長期的植物。
步驟5，取生長期植物的健康完整葉片，洗凈，用干凈紗布吸凈葉片表面多余水分，然后于105℃殺青15分鐘，之后于65℃恒溫烘干至恒重，得到烘干的葉片。
步驟6，取烘干的葉片研磨成細粉，過100目篩，得到用于碳穩(wěn)定同位素檢測的樣品。
取10個不同的梨屬砧木樣品，試材編號依次為1-10，重復(fù)3次，分別利用實施例1-3的方法進行前處理，以及利用傳統(tǒng)的聚乙二醇脅迫處理方法進行前處理，然后測定梨屬砧木的碳穩(wěn)定判斷值△13C(‰)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，實施例1、實施例2、實施例3中，各處理的梨屬砧木樣品長勢比較一致，水分處理間表現(xiàn)有差異，并且測得的碳穩(wěn)定判斷值△13C表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。
而利用傳統(tǒng)的聚乙二醇脅迫處理方法進行前處理后，植株栽培出現(xiàn)生長狀況不佳，因此無法準確的測量碳穩(wěn)定判斷值△13C(表1中并未給出相關(guān)數(shù)據(jù))，且植株栽培過程中，聚乙二醇的濃度難以控制到位。
需要說明的是，表1的數(shù)據(jù)僅是為了證明本發(fā)明前處理方法的可行性，所以實施例1-3采用的營養(yǎng)液配方等參數(shù)稍有不同。但是具體測定水分脅迫處理對植物△13C的影響時，應(yīng)當以水分作為單一變量，而保證不同樣品之間的營養(yǎng)液配方等其他參數(shù)一致。
表1碳穩(wěn)定判斷值△13C(‰)
此外，由于傳統(tǒng)的營養(yǎng)土盆栽控制水分的方法，與營養(yǎng)液相比，試驗影響因子較多，試驗的均一性較差，試驗中的差異因子不容易排除。
本發(fā)明的方法將營養(yǎng)液水培和盆栽控水脅迫處理有機的結(jié)合在一起，應(yīng)用于碳穩(wěn)定同位素的檢測，與營養(yǎng)土盆栽控水方法相比，試驗的均一性更好，試驗中的影響因子較為單一，試驗干擾因素容易排除，可控性更好，能夠達到更為理想的控水效果，檢測數(shù)據(jù)和結(jié)果更為準確可靠。
本發(fā)明的方法適用于植物生長30-90d的碳穩(wěn)定判斷值△13C，可以準確而較快的得到植物的長期水分利用率數(shù)據(jù)和結(jié)果，尤其是可以比較準確而較快的得到多年生梨屬矮化砧和砧穗組合整個生長季或某生長階段的長期水分利用率數(shù)據(jù)和結(jié)果，用于梨屬矮化砧和砧穗組合的長期水分利用率和綜合栽培性狀的篩選鑒定，提高試驗研究的效率。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。