本發(fā)明屬于海藻良種培育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種北方海區(qū)海帶品種提純的方法。

背景技術(shù)：

海帶是我國(guó)養(yǎng)殖量最大的海藻，其產(chǎn)業(yè)在漁業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要比例。從上個(gè)世紀(jì)60年代，我國(guó)就開(kāi)展了海帶品種培育工作，培育了一系列良種，為海帶產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了良好的基礎(chǔ)。但由于目前海帶保種還主要依靠海上選種、室內(nèi)混采孢子育苗和海上混雜養(yǎng)成的方法，同時(shí)由于連續(xù)自交及近交造成隱性基因的表達(dá)，海區(qū)環(huán)境的變化等原因，無(wú)法保證品種性狀的穩(wěn)定，導(dǎo)致新品種推廣生產(chǎn)后沒(méi)幾年就嚴(yán)重混雜，新品種不能持續(xù)發(fā)揮應(yīng)有的作用，使用壽命大大縮短。基于此問(wèn)題，本專(zhuān)利提供了一種方法解決這個(gè)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，而提供一種北方海區(qū)海帶品種提純的方法，目的在于解決北方海帶養(yǎng)殖區(qū)生產(chǎn)上海帶良種混雜、退化問(wèn)題，對(duì)海帶原良種提純選優(yōu)。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種北方海區(qū)海帶品種提純方法，包括以下步驟：

(1)海帶單株選擇：

在海帶收獲開(kāi)始期，根據(jù)海帶的原良種標(biāo)準(zhǔn)特征在海上選擇至少60株形態(tài)一致的優(yōu)良單株，然后將優(yōu)良單株的假根修剪掉，并取其梢部較嫩的部分做分子標(biāo)記分析，以室內(nèi)保存的海帶品種配子體的AFLP圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，選擇與配子體圖譜一致的海帶單株作為種菜；種菜夾于養(yǎng)殖苗繩上單獨(dú)放在固定海區(qū)暫養(yǎng)，1-2個(gè)月后，根據(jù)品種特征再篩選種菜，剔除形態(tài)特征不符合的種菜，保留15-20株將符合要求的種菜；將最終符合要求的種菜切掉梢部和邊緣的腐爛處、保留基部藻體1.5m；將基部藻體綁到苗繩上，掛到浮筏上放在海區(qū)培育；培育至基部藻體的傷口傷愈且其孢子囊成熟，該藻體為具備典型原良種特征的種海帶；

(2)海帶單株采苗：

將步驟(1)得到的種海帶運(yùn)至育苗場(chǎng)中，將育苗池分成多個(gè)獨(dú)立的小單元，每個(gè)單元稱為育苗單元；每個(gè)育苗單元中放置有提前處理過(guò)的育苗簾，種海帶置于育苗單元中、且在8-9℃的過(guò)濾海水中放散游孢子；撈出種海帶且用300目篩絹清除黏液等雜質(zhì)，用8-9℃過(guò)濾海水調(diào)節(jié)游孢子密度后，游孢子附著于育苗簾上進(jìn)行培育至幼苗出庫(kù)；

(3)海上分系養(yǎng)殖：

將步驟(2)獲得的出庫(kù)幼苗采用濕運(yùn)法運(yùn)至?xí)吼B(yǎng)海區(qū)，將幼苗夾于苗繩上，將苗繩掛在吊繩上后放于海區(qū)暫養(yǎng)；暫養(yǎng)至幼苗長(zhǎng)為20±3cm時(shí)開(kāi)始分苗，選取長(zhǎng)勢(shì)最好的海帶幼苗夾于苗繩上，每株種海帶培育的幼苗夾在一排筏架，加上標(biāo)記以區(qū)分，按照海帶養(yǎng)殖技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行養(yǎng)成，定期測(cè)量海帶的各種性狀特征；

(4)海帶擇優(yōu)選種：

在第二年對(duì)每排筏架養(yǎng)殖的海帶按照原良種標(biāo)準(zhǔn)特征再進(jìn)行嚴(yán)格篩選，如果性狀表現(xiàn)統(tǒng)一，符合原良種標(biāo)準(zhǔn)則可作為種菜采苗；如果性狀仍有分離，則選留性狀最統(tǒng)一，特征明顯的一排筏架的10-20棵海帶繼續(xù)進(jìn)行自交培育和養(yǎng)殖。

上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，所述的海帶的原良種標(biāo)準(zhǔn)特征指的是葉片完整、經(jīng)濟(jì)性狀突出、沒(méi)有孢子囊出現(xiàn)等特征；所述的品種特征指的是長(zhǎng)度、寬度、中帶部寬、色澤、孢子囊成熟度、根部形態(tài)和耐高溫等特性。

上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，所述的海區(qū)培育的條件為：基部藻體綁到苗繩上，掛到浮筏上水深1m以下放在海區(qū)培育，培育過(guò)程中經(jīng)常擺洗。

上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，所述的分子標(biāo)記分析的過(guò)程為：

①基因組DNA提取過(guò)程：

海帶配子體和孢子體的基因組DNA采用Tiangen植物基因組提取試劑盒提??；

②種質(zhì)鑒定過(guò)程：

A、限制性酶切及連接：在0.2ml離心管中加入：模板量250ng，2.5μl10×酶切緩沖液，2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoR Ⅰ，5U Mse Ⅰ，2U T4連接酶，50pmol Mse Ⅰ接頭，雙蒸水補(bǔ)至25μl；在PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)定37℃反應(yīng)過(guò)夜，然后在65℃20min滅酶活，放在-20℃保存；

B、預(yù)擴(kuò)增：取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl；PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；

C、選擇性PCR擴(kuò)增：取釋稀后的產(chǎn)物3μl，加入EcoR Ⅰ選擇性引物、Mse Ⅰ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13個(gè)循環(huán)；94℃30s，56℃1min，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃5min；

D、凝膠電泳與銀染：擴(kuò)增產(chǎn)物用6％變性聚丙烯酰胺膠和1×TBE電泳緩沖液電泳分離，然后加入銀染液顯色；

③數(shù)據(jù)分析：

用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)比較海帶配子體和篩選的種海帶AFLP圖譜，選擇與配子體圖譜一致的海帶單株。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的種海帶運(yùn)至育苗場(chǎng)，運(yùn)輸時(shí)間為日出前或者日落后，運(yùn)輸過(guò)程中保持濕潤(rùn)。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的提前處理過(guò)的育苗簾指的是：育苗簾洗涮干凈、抻直，放在低溫海水中浸泡預(yù)冷，單層平面式整齊的放于育苗單元中。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的的用過(guò)濾海水調(diào)節(jié)游孢子密度，100倍顯微鏡下每視野有15個(gè)-20個(gè)游動(dòng)活潑的游孢子即可。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述的游孢子附著于育苗簾上進(jìn)行培育至幼苗出庫(kù)，培育條件為：配子體階段水溫8-10℃、光照10-30μmolm^-2s^-1，每天更換總水體1/6；中間階段水溫6-8℃、光照30-80μmolm^-2s^-1，每天更換總水體的1/5-1/4；幼苗出庫(kù)前15天，水溫逐漸提高到8-12℃、光照100-120μmolm^-2s^-1，每天更換總水體的1/3。

上述技術(shù)方案中，步驟(4)中，所述的海帶的原良種標(biāo)準(zhǔn)特征指的是葉片完整、經(jīng)濟(jì)性狀突出、沒(méi)有孢子囊出現(xiàn)等特征。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比：解決了北方海帶養(yǎng)殖區(qū)生產(chǎn)上海帶良種混雜、退化問(wèn)題，對(duì)海帶原良種提純選優(yōu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行具體的描述：

實(shí)施例1：“榮?！焙Я挤N提純

“榮?！焙侵袊?guó)海洋大學(xué)培育的海帶良種，于2004年獲得國(guó)家良種認(rèn)證，其經(jīng)濟(jì)性狀穩(wěn)定、增產(chǎn)效果明顯、耐高溫性狀突出，適宜在全國(guó)各海帶栽培區(qū)推廣栽培，但經(jīng)過(guò)10余年的養(yǎng)殖，在榮成俚島發(fā)現(xiàn)其耐高溫性狀和經(jīng)濟(jì)性狀有所退化。利用本技術(shù)對(duì)榮成俚島養(yǎng)殖的“榮福”海帶提純。

一種海黍子高褐藻膠品系培育和養(yǎng)殖方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)海帶單株選擇：

2014年5月13日在海上進(jìn)行單株挑選，根據(jù)葉片完整、經(jīng)濟(jì)性狀突出、沒(méi)有孢子囊出現(xiàn)的原良種標(biāo)準(zhǔn)特征，嚴(yán)格選擇若干形態(tài)一致的優(yōu)良單株60株。將選擇的種菜單獨(dú)放在固定海區(qū)暫養(yǎng)，并取其梢部做AFLP分子標(biāo)記分析，經(jīng)過(guò)篩選剩余45株；二是在7月10日在種菜暫養(yǎng)區(qū)，根據(jù)耐高溫性狀再進(jìn)行一次種菜篩選，將挑選的種菜切掉梢部，保留基部藻體1.5m。處理好的15株種海帶綁到苗繩上，掛到浮筏上水深1m以下，經(jīng)常擺洗；

所述的分子標(biāo)記分析的過(guò)程為：

①基因組DNA提取過(guò)程：

海帶配子體和孢子體的基因組DNA采用Tiangen植物基因組提取試劑盒提??；

②種質(zhì)鑒定過(guò)程：

A、限制性酶切及連接：在0.2ml離心管中加入：模板量250ng，2.5μl10×酶切緩沖液，2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoR Ⅰ，5U Mse Ⅰ，2U T4連接酶，50pmol Mse Ⅰ接頭，雙蒸水補(bǔ)至25μl；在PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)定37℃反應(yīng)過(guò)夜，然后在65℃20min滅酶活，放在-20℃保存；

B、預(yù)擴(kuò)增：取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl；PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；

C、選擇性PCR擴(kuò)增：取釋稀后的產(chǎn)物3μl，加入EcoR Ⅰ選擇性引物、Mse Ⅰ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13個(gè)循環(huán)；94℃30s，56℃1min，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃5min；

D、凝膠電泳與銀染：擴(kuò)增產(chǎn)物用6％變性聚丙烯酰胺膠和1×TBE電泳緩沖液電泳分離，然后加入銀染液顯色；

③數(shù)據(jù)分析：

用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)比較榮福海帶配子體和篩選的種海帶AFLP圖譜，選擇與配子體圖譜一致的海帶單株。

(2)海帶單株采苗：

將具備典型原良種的15株種海帶在早晨6點(diǎn)運(yùn)輸至育苗場(chǎng)，分別置于育苗單元中；采苗時(shí)間為8月12日，將苗簾洗刷、抻直、低溫海水浸泡預(yù)冷，單層平面式整齊擺放于育苗單元中；在水溫8±1℃的過(guò)濾海水中放散游孢子，種海帶放散游孢子后，用篩絹清除黏液等雜質(zhì)，用過(guò)濾低溫海水調(diào)節(jié)游孢子密度，100倍顯微鏡下每視野有15個(gè)-20個(gè)游動(dòng)活潑的游孢子即可；配子體階段水溫8-10℃，光照10-25μmolm^-2s^-1，每天更換總水體的1/6；中間階段水溫7±1℃，光照46-80μmolm^-2s^-1；每天更換總水體的1/5-1/4；幼苗出庫(kù)前15天，水溫逐漸提高到10±1℃，光照100-120μmolm^-2s^-1，每天更換總水體的1/3。

(3)海上分系養(yǎng)殖：

在10月15日將每個(gè)苗簾的幼苗用濕運(yùn)法運(yùn)至?xí)吼B(yǎng)海區(qū)，將苗繩截成每段50cm的苗繩掛在吊繩上，下端系上墜石；幼苗長(zhǎng)到20±3cm時(shí)開(kāi)始分苗，選取長(zhǎng)勢(shì)最好的海帶幼苗夾于苗繩上，每株海帶培育的幼苗夾一排筏架，每排筏架有苗繩60繩，每繩夾苗30株，加上紅色標(biāo)簽區(qū)分，按照海帶養(yǎng)殖技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖條件，每?jī)蓚€(gè)月測(cè)量海帶的各種性狀特征。

(4)海帶擇優(yōu)選種：

在第二年對(duì)每排筏架養(yǎng)殖海帶按照原良種標(biāo)準(zhǔn)再進(jìn)行嚴(yán)格篩選，發(fā)現(xiàn)到5月底，90％的海帶經(jīng)濟(jì)性狀比養(yǎng)殖對(duì)比海帶突出，而且邊緣腐爛程度明顯偏低。符合“榮?！焙г挤N標(biāo)準(zhǔn)。

上述實(shí)例只是為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思以及技術(shù)特點(diǎn)，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。