本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，具體涉及枯草芽孢桿菌HMB19198在防治黃瓜白粉病上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：黃瓜白粉病，俗稱(chēng)“白毛病”，是由單絲殼白粉菌(Sphaerothecafuliginea)引起的真菌性病害，該病原菌主要侵染黃瓜葉片，其次侵染葉柄和莖，嚴(yán)重影響黃瓜葉片的光合作用，造成減產(chǎn)并影響黃瓜品質(zhì)。該病從幼苗期到成株期均可發(fā)病，具有流行性強(qiáng)、發(fā)病率高、潛育期短和再侵染頻繁等特點(diǎn)。因白粉病導(dǎo)致的黃瓜產(chǎn)量損失一般年份在10％左右，而流行年份高達(dá)30％左右。對(duì)黃瓜白粉病的防治方法主要有：(1)培育抗病品種：培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但是由于抗白粉病的資源較少，加之病原菌生理小種的不斷進(jìn)化，培育抗性品種相對(duì)比較困難。(2)農(nóng)業(yè)措施防治：如減少種植密度、注意通風(fēng)透光、避免過(guò)度施氮肥等，這種方法防治效果十分有限。(3)化學(xué)防治：是目前防治黃瓜白粉病的主要方法，主要通過(guò)噴施托布津、粉銹寧、瑞毒銅、多菌靈、氟硅唑、仙生或世高等化學(xué)殺菌劑來(lái)防治黃瓜白粉病。然而，長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，病原菌容易產(chǎn)生抗藥性，致使防治效果降低；同時(shí)容易造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染、引起新病害或次生病害大發(fā)生。(4)生物防治：生物防治具有專(zhuān)化性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)人畜無(wú)毒、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因而日益受到人們的青睞。已知有多種微生物如地衣芽孢桿菌(CN102399712A)、枯草芽孢桿菌(CN1934241A、CN104403970A、CN1911043A)、哈茨木霉菌(CN102388922A、CN101575574A)、綠色木霉(CN101724572A)、木霉菌(CN1911043A)和淡紫灰鏈霉菌(CN101481669A)等對(duì)黃瓜白粉病具有很好的防治效果，但是由于生物的多樣性，針對(duì)不同的病原菌，不同的微生物對(duì)其抗性不同，以及由于共同進(jìn)化特性，病原菌不斷產(chǎn)生新的生理小種，因此，應(yīng)不斷選擇新的微生物應(yīng)對(duì)黃瓜白粉病的生理小種的變化?？莶菅挎邨U菌菌株HMB19198主要應(yīng)用于黃瓜霜霉病(CN102586142A)和人參立枯病(CN105746579A)的防治。經(jīng)檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌HMB19198用于防治黃瓜白粉病的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供枯草芽孢桿菌菌株HMB19198在防治黃瓜白粉病上的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有枯草芽孢桿菌菌株HMB19198的微生物菌劑在防治黃瓜白粉病上的應(yīng)用。本發(fā)明第三目的在于提供利用上述微生物菌劑防治黃瓜白粉病的方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株HMB19198在防治黃瓜白粉病上的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株HMB19198于2011年12月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCCNo.5613。本發(fā)明還提供了含有枯草芽孢桿菌HMB19198的微生物菌劑在防治黃瓜白粉病上的應(yīng)用。所述的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌HMB19198菌體。所述的微生物菌劑為可以為液體制劑。所述的微生物菌劑的液體制劑，按照如下方法制備：(1)菌種活化：將低溫保存的HMB19198菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上，在30～32℃培養(yǎng)16～24小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液制備：用無(wú)菌的接種環(huán)刮取一接種環(huán)步驟(1)活化的菌株并接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中，在28～34℃、搖床轉(zhuǎn)速為170～210rpm條件下培養(yǎng)20～24小時(shí)，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比為0.5～3.0％的比例將步驟(2)的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基(pH值為5.8-6.2)中，在溫度為28～34℃、搖床轉(zhuǎn)速為170～210rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)36～54h，得發(fā)酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基的組成成分及其重量百分比為：蔗糖2.0～3.0％，豆餅粉1.6～2.4％，NaCl0.1～0.2％，CaCO30.1～0.3％，KH2PO40.01～0.03％和MgSO4·7H2O0.01～0.03％，其余為水；(4)檢測(cè)發(fā)酵液中菌體和芽孢數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的90％時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB19198菌株的液體制劑。上述液體制劑，其步驟(2)或(3)中所述的溫度優(yōu)選為30～32℃；所述的搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為210rpm；所述的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48h。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。所述的蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、CaCO3、KH2PO4和MgSO4·7H2O混合，再加水，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其枯草芽孢桿菌HMB19198的活菌數(shù)大于1.0×109cfu/mL。利用上述微生物菌劑防治黃瓜白粉病的方法，包括用水將上述微生物菌劑的液體制劑稀釋至活菌體數(shù)為107cfu/mL，在黃瓜白粉病發(fā)病前在黃瓜葉面進(jìn)行噴霧即可。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)本發(fā)明為防治黃瓜白粉病提供了一個(gè)高效的微生物，開(kāi)辟了一個(gè)有效防治途徑；(2)本發(fā)明枯草芽孢桿菌HMB19198對(duì)黃瓜白粉病的藥效高，平均防效在90.0％以上；(3)利用本發(fā)明方法防治黃瓜白粉病專(zhuān)化性強(qiáng)，且不易產(chǎn)生抗藥性，持久性強(qiáng)；(4)本發(fā)明方法中的微生物菌劑對(duì)人、畜安全，沒(méi)有環(huán)境污染；(5)本發(fā)明使用的微生物菌劑制備方法簡(jiǎn)單、使用方法簡(jiǎn)單、成本低，易于推廣應(yīng)用。具體實(shí)施方式下面以具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所涉及的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基等均按照常規(guī)方法制備。實(shí)施例1HMB19198微生物菌劑的制備按照如下步驟進(jìn)行：(1)菌種活化：將保存于-80℃的枯草芽孢桿菌(Baci11ussubtilis)菌株HMB19198(保藏編號(hào)為CGMCCNo.5613)在LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上在32℃下培養(yǎng)20小時(shí)，得活化的菌株；(2)種子液的制備：在250mL三角瓶中裝入LB液體培養(yǎng)基100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環(huán)步驟(1)中活化好的菌株，在30℃、搖床轉(zhuǎn)速190rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24h小時(shí)，得種子液；(3)蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備：按照重量百分比將蔗糖3.0％，豆餅粉2％，NaCl0.1％，CaCO30.3％，KH2PO40.02％和MgSO4·7H2O0.03％加入水中，攪拌混合均勻，即得蔗糖豆餅培養(yǎng)基；分裝于三角瓶中，每瓶裝200mL；在121℃對(duì)蔗糖豆餅培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌30分鐘，再降溫到30℃?zhèn)溆茫?4)發(fā)酵培養(yǎng)：向步驟(3)所得每瓶蔗糖豆餅培養(yǎng)基200mL中接種步驟(2)所得種子液2mL；在30℃、搖床轉(zhuǎn)速190rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36h，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中的芽孢和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽孢率(芽孢率(％)＝成熟芽孢數(shù)/(成熟芽孢數(shù)+菌體數(shù))×100)；芽孢率達(dá)到90％時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)約48h，得枯草芽孢桿菌HMB19198的液體制劑。實(shí)施例2HMB19198微生物菌劑對(duì)黃瓜白粉病防治效果對(duì)比試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料：(1)、黃瓜品種：津優(yōu)1號(hào)。(2)、黃瓜白粉病病原菌分生孢子懸浮液：初始菌株來(lái)自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，接種用黃瓜白粉病病原菌分生孢子懸浮液由初始菌株在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁得來(lái)。(二)試驗(yàn)處理：(1)、實(shí)施例1制備的HMB19198液體制劑的100倍水稀釋液；(2)、空白對(duì)照：清水。(三)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。在直徑6cm的營(yíng)養(yǎng)缽中培育津優(yōu)1號(hào)黃瓜苗，育苗基質(zhì)為蛭石，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽播種兩粒種子，出苗后留取一棵壯苗。待黃瓜苗子葉完全展平后開(kāi)展試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，處理1為在黃瓜子葉上噴施實(shí)施例1制備的HMB19198液體制劑的100倍水稀釋液，處理2為空白對(duì)照，噴施等量清水。每個(gè)處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)20株黃瓜苗。在25℃下保濕24h，然后噴霧接種黃瓜白粉病病原菌分生孢子懸浮液(1×105個(gè)/mL)，于25℃恒溫培養(yǎng)(光照14小時(shí)，黑暗10小時(shí))。待空白對(duì)照子葉充分發(fā)病后,調(diào)查黃瓜子葉白粉病病情并計(jì)算病情指數(shù)和防效。調(diào)查方法、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計(jì)算方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一)殺菌劑防治黃瓜白粉病(GB/T17980.30-2000)。結(jié)果(見(jiàn)表1)經(jīng)HMB19198液體制劑處理的病情指數(shù)為0.46，顯著低于空白對(duì)照的病情指數(shù)(31.83)，HMB19198液體制劑對(duì)黃瓜白粉病的防效達(dá)98.56％。上述結(jié)果說(shuō)明枯草芽孢桿菌菌株HMB19198及其HMB19198液體制劑對(duì)黃瓜白粉病具有突出的防治效果。表1HMB19198微生物菌劑對(duì)黃瓜白粉病防治效果對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果處理病情指數(shù)防效(％)HMB19198液體制劑0.46b98.56空白對(duì)照31.83a/實(shí)施例3HMB19198微生物菌劑防治黃瓜白粉病效果對(duì)比試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料：(1)、黃瓜品種：津優(yōu)1號(hào)。(2)、黃瓜白粉病病原菌分生孢子懸浮液，初始菌株來(lái)自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，接種用黃瓜白粉病病原菌分生孢子懸浮液由初始菌株在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁得來(lái)。(二)試驗(yàn)處理：(1)、實(shí)施例1制備的HMB19198液體制劑的100倍水稀釋液；(2)、空白對(duì)照：清水。(三)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。在直徑6cm的營(yíng)養(yǎng)缽中培育津優(yōu)1號(hào)黃瓜苗，育苗基質(zhì)為蛭石，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽播種兩粒種子，出苗后留取一棵壯苗。待黃瓜苗生長(zhǎng)出兩片真葉時(shí)移栽到直徑15cm的塑料花盆中(花盆中裝填蛭石與田園土按照1:1比例配成的基質(zhì))，在25℃恒溫培養(yǎng)(光照14小時(shí)，黑暗10小時(shí))。將黃瓜苗用竹竿支撐固定，待長(zhǎng)出5-7片真葉后開(kāi)展試驗(yàn)。處理1噴施實(shí)施例1制備的HMB19198液體制劑的100倍水稀釋液；處理2為空白對(duì)照，噴施等量清水。每個(gè)處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)5盆黃瓜苗。在25℃條件下保濕24h。24h后噴霧接種黃瓜白粉病病原菌分生孢子懸浮液(1×105個(gè)/mL)，繼續(xù)于25℃恒溫培養(yǎng)(光照14小時(shí)，黑暗10小時(shí))。待空白對(duì)照真葉充分發(fā)病后,調(diào)查黃瓜真葉白粉病病情并計(jì)算病情指數(shù)和防效。調(diào)查方法、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計(jì)算方法參照GB/T17980.30-2000。結(jié)果(見(jiàn)表2)HMB19198液體制劑處理的黃瓜葉片沒(méi)有發(fā)病，其病情指數(shù)為0.00，顯著低于空白對(duì)照的病情指數(shù)(87.05)，HMB19198液體制劑對(duì)黃瓜葉片上的黃瓜白粉病的防治效果達(dá)100％。上述結(jié)果說(shuō)明枯草芽孢桿菌菌株HMB19198及其HMB19198液體制劑對(duì)黃瓜白粉病具有突出的防治效果。表2HMB19198微生物菌劑防治黃瓜白粉病效果對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果處理病情指數(shù)防效(％)HMB19198液體制劑0.00b100.00空白對(duì)照87.05a/實(shí)施例4HMB19198微生物菌劑對(duì)黃瓜白粉病防治效果對(duì)比試驗(yàn)(一)試驗(yàn)材料：黃瓜品種津優(yōu)1號(hào)。(二)試驗(yàn)處理：(1)實(shí)施例1制備的HMB19198液體制劑100倍水稀釋液。(2)10％苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)。(3)空白對(duì)照：清水。(三)試驗(yàn)方法：本試驗(yàn)于2015年春季在河北省保定市徐水縣遂城鎮(zhèn)城北莊村楊寶山黃瓜大棚內(nèi)開(kāi)展。翻地、施肥、播種、澆水同當(dāng)?shù)剞r(nóng)事操作。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，處理1為微生物菌劑，噴施實(shí)施例1制備的HMB19198液體制劑100倍水稀釋液；處理2為化學(xué)藥劑，噴施10％苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)800倍水稀釋液；處理3為空白對(duì)照，噴施等量清水。每個(gè)處理重復(fù)4次。每個(gè)重復(fù)3行，每行約25棵黃瓜苗。在黃瓜白粉病發(fā)病之前開(kāi)始試驗(yàn)，間隔7-10天處理一次，直到空白對(duì)照充分發(fā)病，調(diào)查黃瓜白粉病病情并計(jì)算病情指數(shù)和防效。調(diào)查方法、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計(jì)算方法參照GB/T17980.30-2000。結(jié)果(見(jiàn)表3)HMB19198液體制劑處理的病情指數(shù)為4.53，顯著低于空白對(duì)照病情指數(shù)(76.25)和化學(xué)藥劑的病情指數(shù)(8.36)，對(duì)黃瓜白粉病防效為94.06％，優(yōu)于化學(xué)藥劑對(duì)照的防效(89.04％)。上述結(jié)果說(shuō)明枯草芽孢桿菌HMB19198及其微生物菌劑對(duì)黃瓜白粉病具有突出的防治效果。表3HMB19198液體制劑對(duì)黃瓜白粉病防效對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果處理病情指數(shù)防效(％)HMB19198液體制劑4.53c94.06化學(xué)藥劑8.36b89.04空白對(duì)照76.25a/當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3