本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛-苔蘚共伴生培養(yǎng)系統(tǒng)，屬于園藝林業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，主要分布在安徽、浙江、福建等地。具有益胃生津、滋陰清熱等獨(dú)特的功效。早在秦漢時(shí)期，《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載鐵皮石斛“味甘，平。主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞、贏弱，強(qiáng)陰。久服，厚腸胃、輕身、延年”。1000 多年前的《道藏》將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首；李時(shí)珍在《本草綱目》中評(píng)價(jià)鐵皮石斛“強(qiáng)陰益精，厚腸胃，補(bǔ)內(nèi)絕不足，平胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年”。民間稱其為救命仙草，國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”。現(xiàn)代藥理研究證明，鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫力、消除腫瘤、抑制癌癥等作用，對(duì)咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病、腫瘤均具有顯著療效。為此，2010年版《中國藥典》將其單獨(dú)收載。20世紀(jì) 90年代以前，鐵皮石斛主要依靠野生資源。由于毀滅性采挖、生存環(huán)境的破壞以及自身繁殖能力低下，野生資源基本枯竭，1987年國務(wù)院將其列為國家二級(jí)保護(hù)植物。2011年，全國人工種植面積突破10000多畝，以鐵皮石斛為原料的藥品與保健品30多個(gè)，形成了從鐵皮石斛種植、加工、銷售完整的產(chǎn)業(yè)鏈，鐵皮石斛產(chǎn)值超過30億元，成為國內(nèi)產(chǎn)銷量最大的保健產(chǎn)品之一。

目前，鐵皮石斛的栽培和規(guī)模種植主要分為設(shè)施仿生栽培模式和林內(nèi)生態(tài)種植模式兩大類，兩種種植方式各存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)。設(shè)施仿生栽培模式，即利用玻璃溫室或塑料薄膜大棚等設(shè)施，以樹皮等為栽培基質(zhì)，配備遮陽網(wǎng)、噴霧和灌溉等設(shè)施，模仿野生環(huán)境培育鐵皮石斛的一種栽培方法，其優(yōu)點(diǎn)是溫度、濕度、肥力等條件控制精準(zhǔn)，鐵皮石斛生長速度較快，但由于沒有自然環(huán)境因子的作用，次生物質(zhì)的積累不夠；林內(nèi)生態(tài)種植模式，主要有林下栽培和活樹附生原生態(tài)栽培模式兩種，主要是充分利用林內(nèi)的自然環(huán)境條件作用，達(dá)到原生態(tài)栽培的目的，其優(yōu)點(diǎn)是生長環(huán)境人工干預(yù)較少，屬于完全的自然環(huán)境下生長，采后的鐵皮石斛的品質(zhì)高，次生物質(zhì)積累量多。但生長較慢，且對(duì)條件適合的林地利用率低，產(chǎn)量稀少，同時(shí)，由于林地樹木生長不規(guī)則，山林斜坡等地形，也會(huì)導(dǎo)致生長環(huán)境不穩(wěn)定、水流對(duì)林地種植沖刷侵襲，影響種植成活率和生長穩(wěn)定性。

基于此，做出本申請(qǐng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有鐵皮石斛種植過程中所存在的上述缺陷，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N可實(shí)現(xiàn)立體種植、提高林區(qū)利用面積、減少生長環(huán)境影響的鐵皮石斛立體種植方法。

鐵皮石斛-苔蘚共伴生培養(yǎng)系統(tǒng)，在耐腐木基上包被伴生苔蘚或伴生苔蘚與樹皮的組合，耐腐木基、伴生苔蘚/伴生苔蘚和樹皮兩者形成支撐物，將鐵皮石斛組培苗固定在支撐物上，將其固定在樹蔭遮蔽林地（指沿豎直方向，樹枝下方的范圍均為樹蔭遮蔽區(qū)域）上，即可。

進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：

所述的耐腐木基上固定有培養(yǎng)基，苔蘚附著在該培養(yǎng)基上分芽繁殖，并包被在耐腐木基上。更優(yōu)選的，所述的苔蘚需進(jìn)行消毒再進(jìn)行附著；所述的培養(yǎng)基為Knop液體培養(yǎng)基、Benecke液體培養(yǎng)基、淀粉、葡萄糖、淘米水、洗菜水或河水，上述培養(yǎng)基浸泡木板，取苔蘚，加入液氮，將其磨成粉末，均勻的涂布在木板上，25℃，弱光，噴霧保濕培養(yǎng)，即可使苔蘚附著在培養(yǎng)基上；所述的苔蘚以噴霧保濕方式進(jìn)行養(yǎng)護(hù)。

所述的鐵皮石斛組培苗固定前，支撐物上噴灑有共生菌液。

所述的伴生苔蘚以單層或多層方式包被在耐腐木基上。

所述的鐵皮石斛組培苗以單層或多層方式固定在支撐物上，當(dāng)設(shè)置為多層時(shí)，鐵皮石斛可在單層伴生苔蘚上分多層設(shè)置，也可在每層伴生苔蘚上各設(shè)置一層。

所述的支撐物相鄰之間的間距為支撐物高度的0.8-1.5倍。

本申請(qǐng)的工作原理和有益效果如下：

（1）提高了林區(qū)利用率，降低了林區(qū)地勢影響。本申請(qǐng)以耐腐木基作為立體培養(yǎng)的支撐物，將鐵皮石斛組培苗按需求單層或多層固定在該支撐物上，將其按序固定在樹蔭遮蔽的林地上，使鐵皮石斛的培養(yǎng)由單層鋪展向豎直空間上延伸，不僅提高了林區(qū)利用率和相同面積上的種植率，還將鐵皮石斛的生長環(huán)境由地面移動(dòng)至地表上空，在最大程度的滿足原生態(tài)培養(yǎng)的同時(shí)，也從根本上避免了地勢對(duì)培養(yǎng)過程造成的影響，有效的解決了環(huán)境適宜林地樹木生長不規(guī)則、山林斜坡水流對(duì)林地種植沖刷侵襲帶來的危害，并能有效減少山地土壤中可能存在的重金屬等有害物質(zhì)的污染風(fēng)險(xiǎn)，為鐵皮石斛的種植提供了穩(wěn)定的附生環(huán)境，從而拓寬了鐵皮石斛種植的可選區(qū)域，是能有效提高適宜林地利用率的培植體系。

（2）以苔蘚植物作為共生體系，將組培技術(shù)與菌根技術(shù)相結(jié)合，可加速鐵皮石斛的有機(jī)生長。共生植物，特別是苔蘚植物作為野生植物栽培中重要的輔助微環(huán)境構(gòu)建者，對(duì)耐腐木基表面進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理，使之能固定內(nèi)層苔蘚培植基質(zhì)，通過分芽繁殖方式，使苔蘚包被在耐腐木基外，當(dāng)苔蘚生長時(shí)，其會(huì)自發(fā)的對(duì)水分進(jìn)行吸收，從而為支撐物上附生的鐵皮石斛提供了水分，是石斛栽培中最重要的保水性伴生植物，避免了干燥、缺水、施水不勻?qū)﹁F皮石斛生長造成的影響，并在生長過程中為鐵皮石斛提供了次生物質(zhì)，從而有效加速了鐵皮石斛的有機(jī)生長。

（3）共生菌確保了整個(gè)支撐物為鐵皮石斛建立其適宜其生長的微環(huán)境，有助于鐵皮石斛的有效附生。在鐵皮石斛固定在支撐物上前，先在耐腐木基上噴灑共生菌液，并形成共生菌層，當(dāng)鐵皮石斛固定在該支撐物上時(shí)，其初始環(huán)境非常有利于鐵皮石斛的生長，其與苔蘚生長中產(chǎn)生的內(nèi)生菌相互配合，促進(jìn)內(nèi)生菌和苔蘚生長的同時(shí)，也有利于鐵皮石斛在支撐物上的有機(jī)生長。

本申請(qǐng)以苔蘚植物作為伴生體系，以耐腐木基作為附生支撐物，結(jié)合共生菌，構(gòu)建耐腐性木材包被含有鐵皮石斛共生菌和伴生苔蘚植物的立體的擬生態(tài)種植共伴生體系，最大限度的利用適合鐵皮石斛生長的有限的林業(yè)資源，并利用有益共生真菌和伴生苔蘚植物與鐵皮石斛形成的微生態(tài)環(huán)境，抑制其他有害菌的生長，并提供生長所需的水分養(yǎng)分，實(shí)現(xiàn)兼顧高品質(zhì)-高產(chǎn)量，并減少病害的綠色立體擬生態(tài)栽培模式。同時(shí)有效的保護(hù)這一國家二級(jí)保護(hù)植物，有利于野生種群的恢復(fù)，為保護(hù)物種多樣性，也為中醫(yī)藥自然資源的可持續(xù)利用提供途徑。

附圖說明

圖1為本申請(qǐng)的側(cè)視圖；

圖2為本申請(qǐng)的俯視圖；

圖3為本申請(qǐng)中支撐物的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4-1為Benecke培養(yǎng)基對(duì)苔蘚組織培養(yǎng)的影響；

圖4-2為Knop培養(yǎng)基對(duì)苔蘚組織培養(yǎng)的影響；

圖4-3為在Knop培養(yǎng)基上對(duì)苔蘚組織培養(yǎng)長出的新芽；

圖5-1為內(nèi)生菌的長出；

圖5-2為苔蘚內(nèi)生菌的分離；

圖6-1為苔蘚內(nèi)生菌的PCR鑒定；

圖6-2為苔蘚內(nèi)生菌的DNA提??；

圖7-1為苔蘚的不同培養(yǎng)基質(zhì)；

圖7-2為無基質(zhì)狀態(tài)下苔蘚的附生狀況；

圖7-3為覆蓋狀態(tài)下苔蘚的附生狀況；

圖7-4為河水為基質(zhì)狀態(tài)下苔蘚的附生狀況；

圖7-5為河水基質(zhì)20天時(shí)苔蘚的附生狀況；

圖7-6為河水基質(zhì)30天時(shí)苔蘚的附生狀況；

圖 8-1為朽木+苔蘚作為固定培養(yǎng)時(shí)鐵皮石斛組培苗的生長狀況；

圖8-2為朽木+苔蘚+松樹皮作為固定培養(yǎng)時(shí)鐵皮石斛組培苗的生長狀況；

圖8-3為松樹皮+朽木作為固定培養(yǎng)時(shí)鐵皮石斛組培苗的生長狀況；

圖8-4為朽木作為固定培養(yǎng)時(shí)鐵皮石斛組培苗的生長狀況；

圖9-1為不同培養(yǎng)條件下的鐵皮石斛的根系發(fā)育外觀圖；

圖9-2為不同培養(yǎng)條件下的鐵皮石斛的干濕重柱狀圖；

圖10為本申請(qǐng)中支撐物的另一結(jié)構(gòu)示意圖。

其中標(biāo)號(hào)：1. 樹蔭遮蔽林地；2. 支撐物；3. 耐腐木基；4. 共生菌層；5. 伴生苔蘚層。

具體實(shí)施方式

材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

苔蘚：附近公園樹上，墻上陰涼處的苔蘚多種。

鐵皮石斛：浙江省某大型鐵皮石斛種植基地的組培苗。

主要儀器：熒光顯微鏡（Nikon）、PCR（Bio-rad）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad）、核酸蛋白質(zhì)分析儀（Bio-rad）。

實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苔蘚的消毒

選取新鮮苔蘚，用0.1%次氯酸鈉浸泡30min，并在搖床上搖4小時(shí)，蒸餾水浸泡洗凈，用無菌濾紙吸干水分。

苔蘚培養(yǎng)基的配置

苔蘚組織培養(yǎng)培養(yǎng)基選用Knop培養(yǎng)基和Benecke培養(yǎng)基兩種。

苔蘚DNA提取及鑒定

取新鮮苔蘚，加入液氮研磨，加入CTAB（含0.1％的巰基乙醇），65℃保溫90Min，氯仿或氯仿：異戊醇，混勻，分成后離心10000g 10min。將水相轉(zhuǎn)移至新管中，加入2倍體積的冰乙醇，用含RNA酶的TE溶解。

苔蘚內(nèi)生菌的分離及培養(yǎng)

采回的苔蘚用自來水洗凈，并用無菌紙吸干水分，并用無菌紙吸干水分,切取細(xì)微小塊，用75%酒精浸泡5m in、7m in、10m in，分別用0.1%升汞溶液處理 4 min、6 min、8 min，進(jìn)行表面滅菌，此試驗(yàn)分別重復(fù) 3次，最后用無菌水沖洗4次。將組織塊在研缽中充分研磨成勻漿，最后一次沖洗液涂 3種不同培養(yǎng)基平板（PDA、馬丁氏、benecke培養(yǎng)基），26~ 28℃下培養(yǎng)2~ 3d，篩選出最佳消毒時(shí)間和培養(yǎng)基，將表面消毒徹底棉花根部切塊放入滅菌研缽中用無菌水沖洗 4次，取上清液涂抹于培養(yǎng)基上，以無菌水沖洗為對(duì)照試驗(yàn)。取上清勻漿涂抹于 3種不同培養(yǎng)基上，取勻漿涂布于不同培養(yǎng)基平板，每濃度重復(fù) 3次，然后將培養(yǎng)皿置于26~ 28℃恒溫箱中培養(yǎng)2~ 3d，觀察培養(yǎng)出的菌落形。

苔蘚內(nèi)生菌DNA提取及鑒定

選擇純化的菌株，在28℃下?lián)u菌48h；取1ml離心后，用液氮碾磨破壁，利用CTAB法提取DNA，瓊脂糖電泳檢測DNA提取含量。

利用核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，火溫度55℃；利用瓊脂糖電泳初步判斷產(chǎn)物大小。

苔蘚附著

分別用Knop液體培養(yǎng)基、Benecke液體培養(yǎng)基、淀粉、葡萄糖、淘米水、洗菜水、河水等作為培養(yǎng)基浸泡木板。取苔蘚，加入液氮，將其磨成粉末，均勻的涂布在木板上，25℃，弱光，噴霧保濕培養(yǎng)。

苔蘚的養(yǎng)護(hù)

每天4次噴霧，保持濕潤，25℃，弱光。

鐵皮石斛的固定及養(yǎng)護(hù)

將鐵皮石斛用稻草固定在朽木、經(jīng)滅菌的松樹皮的朽木、已滅菌的朽木上、未滅菌的松樹皮的朽木上，作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。其中，結(jié)合圖3，支撐物2的主要組成部分為耐腐木基3，即實(shí)施例中選用的朽木，也可選用帶樹皮的朽木；支撐層上設(shè)置有由共生菌液形成共生菌層4，該共生菌層4可位于伴生苔蘚層5與耐腐木基3之間，也可設(shè)置在伴生苔蘚層5表面；而苔蘚在耐腐木基3上則形成伴生苔蘚層5；結(jié)合圖1和圖2，固定有鐵皮石斛組培苗的支撐物2上按序固定在樹蔭遮蔽林地1上，相鄰支撐物2之間的間距分別為支撐物2高度的0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍。在支撐物2上可如圖3所示設(shè)置一組共生菌層4+伴生苔蘚層5，也可如圖10所示設(shè)置多組共生菌層4+伴生苔蘚層5。

結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基條件對(duì)苔蘚組織培養(yǎng)的影響

使用Knop培養(yǎng)基和Benecke培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基，對(duì)消毒的苔蘚進(jìn)行組織培養(yǎng)。Benecke培養(yǎng)基培養(yǎng)三批苔蘚，沒有新芽長出；Knop培養(yǎng)基上兩周后開始長出新芽，比較兩種培養(yǎng)基，Knop培養(yǎng)基中多了還原型的二價(jià)鐵離子，具體參見圖4-1、4-2、4-3。

苔蘚內(nèi)生菌的分離

將Knop培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周的苔蘚幼苗繼代，在新培養(yǎng)基中再培養(yǎng)兩周后，苔蘚周圍長出白色菌環(huán)即為內(nèi)生菌。挑出菌落在真菌篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)兩代純化后，液體培養(yǎng)，具體參見圖5-1、5-2。

苔蘚內(nèi)生菌的DNA提取及PCR鑒定

（1）選擇純化的菌株，在28℃下?lián)u菌48h。

（2）去1ml離心后，用液氮碾磨破壁，利用CTAB法提取DNA，瓊脂糖電泳檢測DNA提取含量。

（3）利用核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，火溫度55℃。

（4）利用瓊脂糖電泳初步判斷產(chǎn)物大小，對(duì)有條帶的菌株P(guān)CR產(chǎn)物送上海英俊測序，將測序結(jié)果在GENBANK中比對(duì)，具體參見圖6-1、6-2。

不同基質(zhì)對(duì)苔蘚附生的影響

分別用Knop液體培養(yǎng)基、Benecke液體培養(yǎng)基、淀粉、葡萄糖、淘米水、洗菜水、河水等作為培養(yǎng)基浸泡木板。取苔蘚，加入液氮，將其磨成粉末，均勻的涂布在木板上，25℃，弱光，噴霧保濕培養(yǎng)。

參見圖7-1、7-2、7-3、7-4、7-5和7-6，結(jié)果表明：營養(yǎng)較好的基質(zhì)，并不利于苔蘚的生長，河水浸泡兩周的木板，苔蘚長勢最好。

不同基質(zhì)固定培養(yǎng)

將鐵皮石斛用稻草固定在朽木、經(jīng)滅菌的松樹皮的朽木、已滅菌的朽木上、未滅菌的松樹皮的朽木上，作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。參見圖8-1、8-2、8-3、8-4，結(jié)果表明，在朽木上附生鐵皮石斛的長勢最好。

不同培養(yǎng)條件下的鐵皮石斛生長情況比較

將不同培養(yǎng)條件下的鐵皮石斛取出，觀察其根系發(fā)育情況，具體參見圖9-1；稱量其干重與濕重，參見圖9-2，從圖9-2可以看出，苔蘚共伴生培養(yǎng)的鐵皮石斛根系粗壯，濕重干重都高于其他培養(yǎng)方式。

相鄰支撐物2之間的間距分別為支撐物2高度的0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍時(shí)，均可實(shí)現(xiàn)總收益與鐵皮石斛長勢的良好匹配，但在1.0-1.3倍時(shí)，尤其是該間距為支撐物2高度的1.1倍時(shí)，鐵皮石斛組培苗相互之間沒有明顯的相互弱光照的遮蔽，可以得到相對(duì)更優(yōu)的生長數(shù)據(jù)。

鐵皮石斛的有效成分就是石斛多糖含量，而這也是體現(xiàn)種植效果的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，一般的野生的為20%左右，人工栽培在10%，而本申請(qǐng)種植的鐵皮石斛，其液相色譜檢測石斛多糖含量二年生的多糖含量接近30%，一年生的在25%，均高于常規(guī)人工栽培結(jié)果，品質(zhì)可與野生鐵皮石斛相媲美，但生長速度遠(yuǎn)高于野生鐵皮石斛。

本申請(qǐng)通過苔蘚植物作為伴生體系，以木材作為附生支撐物，結(jié)合共生菌，構(gòu)建立體擬生態(tài)種植模式，并且對(duì)伴生的苔蘚的種植條件進(jìn)行探索，摸索伴生條件，探討多種種植條件下，鐵皮石斛的生長狀況。所構(gòu)建的立體擬生態(tài)種植模式具有以下兩大優(yōu)勢：（1）由于本項(xiàng)目篩選和培育的共伴生體系系我省土著菌群和苔蘚，其氣候適應(yīng)性較強(qiáng)，有利于在本地開展后期應(yīng)用及野生珍稀資源恢復(fù)；（2）該體系能最大限度的利用適合鐵皮石斛生長的有限的林業(yè)資源，并利用有益共生真菌和伴生苔蘚植物與鐵皮石斛形成的微生態(tài)環(huán)境，抑制其他有害菌的生長，并提供生長所需的水分養(yǎng)分，實(shí)現(xiàn)兼顧高品質(zhì)-高產(chǎn)量，并減少病害的綠色立體擬生態(tài)栽培模式。

以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施只局限于上述這些說明，對(duì)于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。