一種中華石蝴蝶組織培養(yǎng)快速繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)快速繁殖方法，特別是一種中華石蝴蝶組織培養(yǎng)快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中華石蝴蝶(Petrocosmea sinensis Oliv.)系苦苣笞科石蝴蝶屬多年生草本，產(chǎn)云南北部、四川和湖北西部，生于低山陰處的石上。目前，苦苣苔科(Gesneriaceae)植物在全世界約有140屬，2000余種，中國有58屬463種，從遼寧到海南均有分布，多數(shù)的屬、種分布于分布于云南、廣西和廣東等省熱帶及亞熱帶的石灰?guī)r的陡崖上。
[0003]中華石蝴蝶花色美麗，具有很高的觀賞價值。同時也是一種中藥材，以全草入藥，具要清熱解表、健脾和胃，用于治療感冒，小兒疳積等癥狀。中華石蝴蝶地域分布的范圍有限，生長于低山陰處的石上，近年來隨著市場需求的不斷增大，民間的采挖，使其生長環(huán)境受到不同程度的破壞，其資源瀕臨枯竭，而生產(chǎn)上難以實現(xiàn)大面積的栽培。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種中華石蝴蝶組織培養(yǎng)快速繁殖方法，它可以有效的縮短中華石蝴蝶的生產(chǎn)周期，提高種苗的質(zhì)量，減低生產(chǎn)的成本，從而大大的滿足中華石蝴蝶生產(chǎn)上的需要。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達到上述目的:一種中華石蝴蝶組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](1)外植體的選擇和消毒:取中華石蝴蝶的幼嫩葉片作為外植體，將外植體在流水下緩慢沖洗，并去除外植體表面的污垢，放入燒杯中，用2v/v%的洗潔精液浸泡15min后，再用流水沖洗lOmin，將外植體移至超凈工作臺上，用75￥八％的酒精表面消毒15s，再用添加了 1-2滴吐溫-20的100ml濃度為0.lv/v%取(:12消毒8?15min，無菌水浸泡3次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0007](2)不定芽的誘導(dǎo):將步驟⑴得到的外植體接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)15d獲得不定芽，所述M S誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還加入0.5mg/L的2，4 一二氯苯氧乙酸2，4_D、0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0008](3)叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)得到的不定芽接種到叢生芽MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)15d獲得叢生芽，所述叢生芽MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5?1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.1?0.4mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1?0.4mg/L的吲哚乙酸IAA，30g/L蔗糖，4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0009](4)叢生芽壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽切割成單芽接種于MS壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)30d得到健壯植株，所述MS壯苗培養(yǎng)基中添加1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0010](5)健壯植株生根培養(yǎng):將步驟(4)中得到的健壯植株接種到MS生根培養(yǎng)基中，在溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)30d，獲得根系發(fā)達的生根苗，所述MS生根培養(yǎng)基中添加0.1?1.0mg/L的吲哚丁酸ΙΒΑ、0.1?0.5mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0?lg/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;
[0011](6)生根苗的煉苗與移栽:將步驟(5)中得到的生根苗在25°C的大棚內(nèi)打開瓶蓋，煉苗3d，取出生根苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到沙土壤中進行生長30d，培養(yǎng)條件為溫度23?30°C，光照為自然光，大棚上部覆蓋一層遮陽網(wǎng)，遮光度為15?30%，相對濕度為85?90%，獲得根系發(fā)達，適宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
[0012]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:
[0013](1)通過葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)出芽，在短時間內(nèi)培育出大量長勢良好的可供移栽的中華石蝴蝶幼苗，提供優(yōu)質(zhì)種苗，滿足生產(chǎn)上的需要。
[0014](2)采用6-BA、NAA、2，4-D、IAA植物外源激素，能夠提高種苗的生產(chǎn)速率，縮短培養(yǎng)時間，采用活性炭可促進生根。
[0015](3)在壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的無菌植株，健康粗壯、顏色翠綠、無玻璃化現(xiàn)象，接種到生根培養(yǎng)基上生根情況良好，生根率達到99.3%。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進一步說明。
[0017]實施例1
[0018]本發(fā)明所述的中華石蝴蝶組織培養(yǎng)快速繁殖方法的一個實例，包括如下步驟:
[0019](1)外植體的選擇和消毒:取中華石蝴蝶的幼嫩葉片作為外植體，將外植體在流水下緩慢沖洗，并用軟毛刷輕輕的擦拭去除表面的污垢，放入燒杯中，用2v/v%的洗潔精液浸泡15min后，再用流水沖洗lOmin。將外植體移至超凈工作臺上，75v/v%的酒精表面消毒15s，再用添加了 1-2滴吐溫-20的100ml濃度為0.lv/v%取(:12消毒8、12、15min，無菌水浸泡3次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0020](2)不定芽的誘導(dǎo):將步驟⑴得到的外植體接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)15d獲得不定芽，所述MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的2，4 一二氯苯氧乙酸2，4_D、0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0021](3)叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟⑵得到的不定芽接種到MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)15d獲得叢生芽，所述MS繁殖培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA，30g/L蔗糖，4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，芽增殖的倍數(shù)為 6.2。
[0022](4)叢生芽壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽切割成單芽，接種于MS壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)30d得到健壯植株，所述MS壯苗培養(yǎng)基中添加1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0023](5)健壯植株生根培養(yǎng):將步驟(4)中得到的健壯植株接種到MS生根培養(yǎng)基中，在溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)30d，獲得根系發(fā)達的生根苗，所述MS生根培養(yǎng)基中添加0.lmg/L的吲哚丁酸IBA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0024](6)生根苗的煉苗與移栽:將步驟(5)中得到的生根苗取出，在25°C的大棚內(nèi)打開瓶蓋，煉苗3d。洗凈根部殘留培養(yǎng)基后，移栽到沙土壤中進行生長30d，培養(yǎng)條件為溫度23?30°C，光照為自然光，大棚上部覆蓋一層遮陽網(wǎng)，遮光度為15?30%，相對濕度為85?90%。獲得根系發(fā)達，適宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
[0025]實施例2
[0026]本發(fā)明所述的中華石蝴蝶組織培養(yǎng)快速繁殖方法的一個實例，包括如下步驟:
[0027](1)外植體的選擇和消毒:取中華石蝴蝶的幼嫩葉片作為外植體，將外植體在流水下緩慢沖洗，并用軟毛刷輕輕的擦拭去除表面的污垢，放入燒杯中，用2v/v%的洗潔精液浸泡15min后，再用流水沖洗lOmin。將外植體移至超凈工作臺上，75v/v%的酒精表面消毒15s，再用添加了 1-2滴吐溫-20的100ml濃度為0.lv/v%取(:12消毒8、12、15min，無菌水浸泡3次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0028](2)不定芽的誘導(dǎo):將步驟⑴得到的外植體接種到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)15d獲得不定芽，所述MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的2，4 一二氯苯氧乙酸2，4_D、0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0029](3)叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟⑵得到的不定芽接種到MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)15d獲得叢生芽，述MS繁殖培養(yǎng)基中添加1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、
0.lmg/L的吲哚乙酸IAA，30g/L蔗糖，4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，芽增殖的倍數(shù)為 7.8o
[0030](4)叢生芽壯苗培養(yǎng):將步驟(3)中得到的叢生芽切割成單芽接種于MS壯苗培養(yǎng)基中，溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)30d得到健壯植株，所述MS壯苗培養(yǎng)基中添加1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0031 ] (5)健壯植株生根培養(yǎng):將步驟(4)中得到的健壯植株接種到MS生根培養(yǎng)基中，溫度為25±3°C，平均光照為1500-22001x，光照時間為12d/h條件下培養(yǎng)30d，獲得根系發(fā)達的生根苗，所述MS生根培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、0.lmg/L的萘乙酸NAA、
1.0g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
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