本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及大花薔薇酮A在防治黃曲霉和/或黃曲霉毒素污染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃曲霉（Aspergillus flavus）是一種常見的絲狀土壤腐生真菌，也是一種危害極大的病原菌，易于侵染植物、動(dòng)物和人。黃曲霉易導(dǎo)致許多重要農(nóng)作物發(fā)病，如玉米穗腐病、花生曲霉病和棉花棉鈴腐爛等，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。黃曲霉也易使人和動(dòng)物患上曲霉病，影響健康，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致死亡。

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是主要由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有急慢性毒性、致癌性、致突變性和致畸性，對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織具有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定和最毒的一種。AFs為一類基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素的聚酮化合物，目前分離鑒定的已超過20種，主要為AFB₁（Aflatoxin B₁）、AFB₂、AFG₁、AFG₂等，其中AFB₁污染最為常見，毒性最強(qiáng)，是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被世界衛(wèi)生組織定義為Ⅰ類可能致癌物，是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物之一。

AFs污染是一個(gè)普遍的現(xiàn)象，主要污染花生、玉米、大米等糧食和糧食制品、堅(jiān)果、植物油、乳制品、調(diào)味品、飼料及中藥材等，其中以花生和玉米污染最為嚴(yán)重。AFs污染已對(duì)食品藥品安全和農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值產(chǎn)生嚴(yán)重影響，已成為一項(xiàng)全球性的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問題。為了保證食品藥品安全，降低AFs對(duì)人類的危害，很多國(guó)家和地區(qū)都對(duì)AFs做出了嚴(yán)格的限量規(guī)定。黃曲霉毒素的污染源頭在于產(chǎn)毒真菌，消除產(chǎn)毒真菌是控制黃曲霉毒素污染的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供大花薔薇酮A在防治黃曲霉和/或黃曲霉毒素污染中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

式（I）所述化合物及其外消旋混合物、對(duì)映體、非對(duì)映體或者其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在抑制和/或殺死黃曲霉中的應(yīng)用，式（I）的結(jié)構(gòu)式為：

。

本發(fā)明的化合物大花薔薇A為假鷹爪屬植物的葉片的醇提取物經(jīng)柱層析后采用制備液相色譜分離制備獲得，所述化合物為5-乙?；?6-苯甲?；跫谆?5H-氧雜4-酮（大花薔薇酮A），將所述化合物加入到接種黃曲霉孢子的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）或馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）中，均能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，將所述的化合物加入到如飼料等樣品中，能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，降低黃曲霉和/或黃曲霉毒素污染。

優(yōu)選地，所述假鷹爪屬植物選自假鷹爪（Desmos chinensi）、毛葉假鷹爪（D. dumosus）、大葉假鷹爪（D. grandifolius）或云南假鷹爪（D. yunnanensis）。

本發(fā)明還提供式（I）所述化合物及其外消旋混合物、對(duì)映體、非對(duì)映體或者其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在制備抑制和/或殺死黃曲霉的藥劑中的應(yīng)用，式（I）的結(jié)構(gòu)式為：

。

本發(fā)明還提供式（I）所述化合物及其外消旋混合物、對(duì)映體、非對(duì)映體或者其藥學(xué)上可接受的鹽或酯在防治黃曲霉毒素污染中的應(yīng)用，式（I）的結(jié)構(gòu)式為：

。

優(yōu)選地，上述應(yīng)用中，式（I）所述化合物的用量為不少于0.05mg/10⁵個(gè)黃曲霉孢子。

更優(yōu)選地，當(dāng)PDB中孢子濃度為10⁵個(gè)/mL時(shí)，最小抑菌濃度為0.05mg/mL。

更優(yōu)選地，當(dāng)PDB中孢子濃度為10⁵個(gè)/mL時(shí)，最小殺菌濃度為0.4 mg/mL。

更優(yōu)選地，當(dāng)PDA中孢子濃度為10⁵個(gè)/mL時(shí)，化合物起抑菌作用的最少用量為100 μg。

本發(fā)明還提供一種用于抑制黃曲霉生長(zhǎng)和/或降低黃曲霉毒素污染的方法，即將式（I）所述化合物噴灑到需要進(jìn)行黃曲霉防治的對(duì)象上。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明所述化合物加入到接種黃曲霉孢子的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）或馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）中，均能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，將所述的化合物加入到如飼料、涂料等樣品中，能抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，降低黃曲霉和/或黃曲霉毒素污染；本化合物來自天然植物資源，將該化合物用于防治黃曲霉和/或黃曲霉毒素污染具有環(huán)境友好，作用效果明顯，效果理想等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)發(fā)展預(yù)防控制AFs污染的有效方法與技術(shù)具有重要的理論和實(shí)際價(jià)值。

附圖說明

圖1是化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2是化合物的紫外光譜圖。

圖3是化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖。

圖4是化合物銨加合離子峰的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖5是化合物的 ¹H-NMR圖譜（CD₃OD）。

圖6是化合物的 ¹³C-NMR圖譜（CD₃OD）。

圖7是化合物的 DEPT圖譜（CD₃OD）。

圖8是化合物的COSY圖譜（CD₃OD）。

圖9是化合物的 HSQC圖譜（CD₃OD）。

圖10是化合物的HMBC圖譜（CD₃OD） 。

圖11是化合物的圓二色譜圖（甲醇）。

圖12是化合物的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)圖。

圖13是化合物在PDB培養(yǎng)基中黃曲霉的生長(zhǎng)情況圖。

圖14是取化合物在PDB培養(yǎng)基上培養(yǎng)黃曲霉2天后的溶液涂布在PDA培養(yǎng)基上菌的生長(zhǎng)情況。

圖15是化合物在PDA培養(yǎng)基上的抑菌情況。

圖16是化合物在飼料中的抑菌情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1化合物的提取分離

（1）取假鷹爪植物葉片洗凈，晾干，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎。

（2）取植物葉片粉末500 g，加無水乙醇4 L，超聲處理2 h，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后加少量二氯甲烷溶解；經(jīng)硅膠（200～300目）柱層析，以石油醚：乙酸乙酯（4：1）為洗脫劑洗脫，洗脫液循環(huán)使用。

（3）取硅膠柱層析的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加少量甲醇溶解并用制備液相分離。

（4）以甲醇：水（50：50）為流動(dòng)相；采用Marsh C18制備柱（50 × 700 mm，5 μm）為固定相。

（5）保持流速為80 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm；色譜柱溫度為室溫；取0.3 mL待制備樣品注入制備液相儀。

（6）收集化合物所對(duì)應(yīng)色譜峰的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，置-20℃保存（紫外光譜如圖2）。

實(shí)施例2化合物的鑒定

（1）取實(shí)施例1提取到的化合物用甲醇溶解，采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析（圖3），并取銨加合離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（圖4）。

（2）根據(jù)液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)化合物的分子式為C₁₆H₁₄O₆，分子量為302。

（3）取化合物采用元素分析儀進(jìn)行元素分析，確認(rèn)化合物分子結(jié)構(gòu)中沒有N元素和S元素，且C元素和H元素的比例結(jié)果和高分辨質(zhì)譜推斷結(jié)果一致。

（4）取化合物，采用CD₃OD作為溶解，進(jìn)行¹H-NMR、¹H-¹HCOSY、¹³C-NMR、 DEPT、HSQC和HMBC等核磁共振試驗(yàn)（圖5～10），化合物的¹H-NMR，¹³C-NMR，HMBC和COSY核磁共振譜結(jié)果（CD₃OD）見表1，推測(cè)其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1。

（5）取化合物的甲醇溶液，用圓二色光譜儀測(cè)定其圓二色光譜值（圖11）。

實(shí)施例3化合物的最小抑菌濃度

（1）在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）溶液（2.4 g/100 mL，pH值為5.1）中加入黃曲霉孢子，終濃度為10⁵個(gè)/mL，往24孔板中加入含孢子的PDB，每孔為2 mL。

（2）在24孔板微孔中分別加入2 mg/mL的化合物甲醇溶液 100 μL，50 μL，25 μL，12 μL，6 μL，0，并以甲醇溶液100 μL，50 μL，25 μL，12 μL，6 μL，0為對(duì)照，每種濃度點(diǎn)兩個(gè)孔。

（3）于30℃避光靜置培養(yǎng)60 h，抑菌情況如圖12。加入化合物甲醇溶液50 μL及以上體積的微孔培養(yǎng)液澄清，無觀察到的黃曲霉生長(zhǎng)，最小抑菌濃度為0.05 mg/mL。

實(shí)施例4化合物的最小殺菌濃度

（1）在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）溶液（2.4 g/100 mL，pH值為5.1)中加入黃曲霉孢子，終濃度為10⁵個(gè)/mL，往24孔板中加入含孢子的PDB，每孔為2 mL。

（2）在24孔板微孔中分別加入8 mg/mL的化合物甲醇溶液 200 μL，100 μL，50 μL，25 μL，并以甲醇溶液200 μL，100 μL，50 μL，25 μL為對(duì)照，每種濃度點(diǎn)兩個(gè)孔。

（3）于30℃避光靜置培養(yǎng)2d，分別取實(shí)驗(yàn)中沒有明顯黃曲霉生長(zhǎng)的培養(yǎng)液各200 μL，涂布到新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5 d觀察PDA培養(yǎng)基上黃曲霉生長(zhǎng)情況，剩余的液體培養(yǎng)樣品繼續(xù)于30℃避光靜置培養(yǎng)5 d時(shí)觀察抑菌情況。在PDB培養(yǎng)基上培養(yǎng)共7 d和在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)共5d的抑菌情況分別如圖13和14。加入化合物甲醇溶液100 μL及100 μL以上體積的培養(yǎng)液所對(duì)應(yīng)的PDA均未見黃曲霉生長(zhǎng)，化合物的最小殺菌濃度為0.4 mg/mL。

實(shí)施例5化合物在固體培養(yǎng)基上的抑菌情況

往含黃曲霉孢子濃度為10⁵個(gè)/mL的PDA培養(yǎng)基孔徑（7mm）內(nèi)加入2 mg/mL的化合物甲醇溶液 25 μL，50 μL，100 μL，并以甲醇溶液100 μL為對(duì)照，于30℃避光靜置培養(yǎng)2 d，抑菌情況分別如圖15，表明化合物具有明顯的抑制黃曲霉生長(zhǎng)的活性。

實(shí)施例6化合物在飼料中的抑菌情況

（1）取黃曲霉孢子(10³個(gè)/mL) 100 μL置15 mL水中，混勻，作為含黃曲霉孢子的水溶液；

（2）取50 mL錐形瓶四個(gè)，每瓶均加飼料各5 g，經(jīng)121 °C高壓滅菌15 min。往第一個(gè)錐形瓶直接加不含黃曲霉孢子的水1.5 mL作為陰性對(duì)照(1#)，往剩余三個(gè)錐形瓶分別加黃曲霉孢子的水溶液1.5 mL，黃曲霉孢子的水溶液1.5 mL和甲醇100 μL，黃曲霉孢子的水溶液1.5 mL和化合物溶液(取化合物適量，用甲醇溶解并配制成濃度為8 mg/mL的溶液) 100 μL，混勻，作為陽(yáng)性對(duì)照(2#)、溶劑對(duì)照(3#)、化合物樣品瓶(4#)。每組平行操作。

（3）密封錐形瓶口，室溫放置30 d后，抑菌情況分別如圖16。未接種黃曲霉孢子的陰性對(duì)照(1#)無黃曲霉生長(zhǎng)，接種黃曲霉孢子的陽(yáng)性對(duì)照(2#)和溶劑對(duì)照(3#)均有黃曲霉生長(zhǎng)，而接種黃曲霉孢子且加入化合物的樣品瓶(4#)無黃曲霉生長(zhǎng)，表明化合物添加到飼料中具有明顯的抑菌效果。