本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物防治與微生物肥料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種防治棉花黃萎病的復(fù)合微生物菌肥及其制備方法。
背景技術(shù)：
：棉花黃萎病是由大麗花輪枝菌(Verticilliumdahaliae)引起的危害嚴(yán)重而且難以防治的土傳病害。棉花黃萎病在我國經(jīng)常性地暴發(fā)成災(zāi)，每年受其影響的棉花種植面積在4000萬畝以上，常年造成棉花減產(chǎn)10%-20%左右，病害發(fā)生嚴(yán)重地塊造成減產(chǎn)可高達(dá)60%-70%。防治棉花黃萎病的方法主要有：一是化學(xué)防治，但是化學(xué)防治效果較差，而且容易造成環(huán)境污染，破壞農(nóng)田的生態(tài)平衡；二是輪作，但在以往特定的農(nóng)業(yè)環(huán)境條件下，人多地少且替代棉花的高價作物種類醫(yī)乏，難以推廣應(yīng)用；三是生物防治，生物防治由于具有環(huán)境污染小、對人畜安全、?；詮?qiáng)、不易產(chǎn)生抗藥性、作用持效期長、能有效保護(hù)天敵、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)日益受到人們的青睞。目前，用于防治作物黃萎病的有益菌主要有芽孢桿菌，木霉菌，放線菌等，取得了顯著的防治效果。但是由于病原菌的多樣性和同步進(jìn)化，單一菌株的生防效果已經(jīng)不穩(wěn)定，效果不明顯。芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，同時，由于芽孢桿菌存在于土壤中，是土傳病害防治中研究很熱的區(qū)域。在防治棉花黃萎病方面，用于防治試驗(yàn)的芽孢桿菌有的還可以在棉株體內(nèi)存活和定殖。解淀粉芽孢桿菌HMB-1005菌株可以在棉花體內(nèi)定殖，盆栽試驗(yàn)證明其對棉花黃萎病具有一定的抗性，與此同時，該菌株還可以在土壤中長時間的保持(郭慧娟等2011)。多粘芽孢桿菌7-4菌株被利用瓊脂平板擴(kuò)散法篩選出來，抑菌活性較高(王笑穎等2011)。國內(nèi)目前生物防治黃萎病的最高防效是枯草芽孢桿菌C-02菌株，盆栽防效達(dá)85.4%，其抗菌物質(zhì)也被分離，證明是一種抗菌蛋白或肽類(聶太禮等2011)。從棉花體內(nèi)分離得到的枯草芽抱桿菌BSD-2菌株可以顯著抑制大麗輪枝菌孢子萌發(fā)，其活性產(chǎn)物己經(jīng)得到分離，具有很好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性質(zhì)，很具有應(yīng)用前景(張鐸等2008)。棉花內(nèi)生的用于生物防治的芽孢桿菌還有多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)Jsascd菌株，該菌株可以應(yīng)用于棉苗的灌根處理，同時大田小區(qū)試驗(yàn)證明施用該菌株還有助于棉花產(chǎn)量的提高(林玲等2010)。木霉是一種腐生真菌，具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，在土壤、植物根際和其他脫落物上很容易生長和繁殖。由于木霉分布廣泛，所以容易分離得到，對木霉的研究也比較多。目前，全世界上己經(jīng)有五十多種木霉制劑上市，用來防治多種植物病害并取得了可喜的效果。木霉防治黃萎病方面的研究同樣成果頗豐。木霉可以有效防治大麗輪枝菌的為害，前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn)其防效可達(dá)40%以上。我國對木霉菌的研究也比較多，把木霉菌和大麗輪枝菌在培養(yǎng)皿內(nèi)對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)木霉可以顯著抑制病原菌的生長，顯微觀察可以發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌的菌絲斷裂、溶解和原生質(zhì)濃縮。由于棉花黃萎病有兩次發(fā)病高峰，在發(fā)病高峰時調(diào)查田間病害證明，木霉T34,THT和T24對棉花黃萎病的防效分別達(dá)到38.2%，53.5%和13.6%，36%。把哈茨木霉與烯酰嗎琳制成水分散粒劑發(fā)現(xiàn)，盆栽試驗(yàn)中對黃萎病的防效最高可達(dá)88%，并且不會影響棉花植株的正常生長。生防真菌中，木霉菌研究很多，其作用機(jī)制也比較成熟，目前公認(rèn)的有拮抗、重寄生、競爭、和誘導(dǎo)作物抗性等。放線菌主要生活在地表，可以產(chǎn)生多種抗生素，稱為“抗生素工廠”。從拮抗的角度出發(fā)，選擇放線菌對黃萎病進(jìn)行防治試驗(yàn)對于找到高效的生防方法具有重要意義，事實(shí)上，很多學(xué)者在這方面做了嘗試并取得了一系列成果。這些嘗試圍繞鏈霉菌進(jìn)行，一般利用平板對峙方法篩選拮抗菌，然后測定其防效后再做深入研究。有盆栽試驗(yàn)證明，放線菌與有機(jī)肥結(jié)合可以高效防治黃萎病的發(fā)生，盆栽防效達(dá)到57%。鏈霉菌S23具有較強(qiáng)的抑制大麗輪枝菌的效果，除此之外，我國科研人員還從不同地區(qū)分離得到了S5等高活性菌株，盆栽試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了一定的防效。由于病原菌的多樣性和同步進(jìn)化特性，單一拮抗菌株也無法達(dá)到很理想的防治效果，因此，生防菌的很多生物功能需要依靠兩株或兩株以上的細(xì)菌間的協(xié)同作用，才能發(fā)揮出更好的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種防治棉花黃萎病的復(fù)合微生物菌肥。該復(fù)合微生物菌肥的原料配比為：阿布拉鏈霉菌菌粉10-30份，田無鏈霉菌菌粉10-30份，土壤短芽孢桿菌菌粉10-30份，克勞氏芽孢桿菌菌粉10-30份，桔綠木霉菌粉10-30份，黃腐酸鉀10-30份。在所述微生物菌肥中，阿布拉鏈霉菌，田無鏈霉菌，土壤短芽孢桿菌，克勞氏芽孢桿菌，桔綠木霉，五種菌是從450多株微生物菌株中篩選得到的能共生共存，能產(chǎn)生多種抗菌素如藤黃霉素和阿布拉霉素；它們對抑制棉花黃萎病病原菌--大麗花輪枝菌有特別強(qiáng)大的效果；另一方面，本發(fā)明的菌種能夠全面的利用微生物種間或種內(nèi)的抗生、競爭、重寄生、溶菌作用，或者通過次級代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生抗病性，增強(qiáng)其防病效果；再次，本發(fā)明中所使用的這5株菌株都是可從土壤中直接分離得到，具有固氮與根跡促生作用，可在作物表面、植株內(nèi)部或土壤中繁殖生長的同時，并定向植物根際分泌某些次生代謝產(chǎn)物，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收、刺激植株生長起到肥料的效果；本發(fā)明的第二目的在于提供一種防治棉花黃萎病的復(fù)合微生物菌肥的制備方法，該方法步驟簡單，確保微生物菌肥的藥肥效果突出。為了達(dá)到上述目的，該防治棉花黃萎病的復(fù)合微生物菌肥的制備方法，包括以下步驟：步驟一、阿布拉鏈霉菌菌粉的制備取出阿布拉鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為阿布拉鏈霉菌種子液；二級種子擴(kuò)培：將上述制備的阿布拉鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至滅菌的阿布拉鏈霉菌液體二級種子培養(yǎng)基上，500L的發(fā)酵罐裝液量為350L，通氣量為每分鐘液氣比為1：0.8，28-30℃培養(yǎng)36-48小時，待菌體含量達(dá)到80g/L時，即可作為阿布拉鏈霉菌二級種子液；發(fā)酵：將上述制備的阿布拉鏈霉菌二級種子液以20%的接種量接種至滅菌的阿布拉鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與阿布拉鏈霉菌固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的阿布拉鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-10cm，控溫28-32℃，前兩天空氣濕度保持為60%-75%，過后空氣濕度保持為40%-50%，發(fā)酵3-5天，檢測其孢子含量不低于30億CFU/g，即可低溫風(fēng)干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到渾圓鏈霉菌菌粉；其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5，硫酸鎂：0﹒5，氯化鈉：0﹒5，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的阿布拉鏈霉菌二級液體種子培養(yǎng)基：菜粕粉2%，木薯粉2%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣1%，硫酸鎂0.1%，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的阿布拉鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：粗玉米皮80%，菜粕2%，木薯粉1%，石粉9%，麩皮8%，硫酸錳0.004%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，固體培養(yǎng)基含水量為40%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟二，田無鏈霉菌菌粉的制備取出田無鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為田無鏈霉菌種子液；二級種子擴(kuò)培：將上述制備的田無鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至滅菌的田無鏈霉菌液體二級種子培養(yǎng)基上，500L的發(fā)酵罐裝液量為350L，通氣量為每分鐘液氣比為1：0.8，28-30℃培養(yǎng)36-48小時，待菌體含量達(dá)到60g/L時，即可作為田無鏈霉菌二級種子液；發(fā)酵：將上述制備的田無鏈霉菌二級種子液以20%的接種量接種至滅菌的田無鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與田無鏈霉菌固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的田無鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-10cm，控溫28-32℃，前兩天空氣濕度保持為60%-75%，過后空氣濕度保持為40%-50%，發(fā)酵3-5天，檢測其孢子含量不低于50億CFU/g，即可低溫風(fēng)干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到田無鏈霉菌菌粉；其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5，硫酸鎂：0﹒5，氯化鈉：0﹒5，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的田無鏈霉菌二級液體種子培養(yǎng)基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣1%，硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的田無鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣80%，菜粕2%，木薯粉1%，石粉9%，粗玉米皮8%，硫酸錳0.004%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，固體培養(yǎng)基含水量為40%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟三，土壤短芽孢桿菌菌粉的制備取出土壤短芽孢桿菌保藏管，用無氮固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)72小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有無氮固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L土壤短芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前8小時通氣量為100L/min，8-24小時后通氣量為200L/min，24小時后通氣量為300L/min，30℃培養(yǎng)32-48小時，待總菌數(shù)含量不低于20億cfu/ml，即可作為土壤短芽孢桿菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的土壤短芽孢桿菌種子液以10%-20%的比例接種至土壤短芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上，混勻，在淺盤上發(fā)酵，堆料厚度為5-10cm，控制發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵36-48小時，待芽孢含量不低于50億cfu/g，即可曬干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到土壤短芽孢桿菌菌粉；其中，所述無氮固體培養(yǎng)基：蔗糖10g，磷酸氫二鉀0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，硫酸鈣0.1g，碳酸鈣5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH7.2；其中，所述土壤短芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10g/L，棉粕粉40g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.6g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，碳酸鈣10g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；其中，所述的土壤短芽孢桿菌固體培養(yǎng)基：甘蔗渣57%，麩皮35%，棉粕5%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟四、克勞氏芽孢桿菌菌粉的制備取出克勞氏芽孢桿菌保藏管，用營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L液體種子培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前10小時通氣量為200L/min，10小時后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)16-24小時，待總菌含量不低于20億cfu/ml，即可作為克勞氏芽孢桿菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的克勞氏芽孢桿菌種子液以總接種量的10%-20%的接種量加至克勞氏芽孢桿菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，在淺盤上發(fā)酵，堆料厚度為5-10cm，控制發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵36-48小時，待芽孢含量不低于80億cfu/g，即可曬干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到克勞氏芽孢桿菌菌粉；其中，所述所述營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述液體種子培養(yǎng)基：糖蜜35g/L，豆粕粉20g/L，硫酸鎂0.6g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，碳酸鈣5.0g/L，pH7.0；其中，克勞氏芽孢桿菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50%，粗玉米皮42%，棉粕5%，石粉1%，啤酒糟2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟五、桔綠木霉菌粉的制備A、桔綠木霉種子液的制備：取出桔綠木霉菌種保藏管，用PDA固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)6天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升PDA固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)4-6天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為桔綠木霉種子液；發(fā)酵：將上述制備的桔綠木霉種子液以2%的接種量接種至滅菌的桔綠木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與桔綠木霉固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的桔綠木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-10cm，控溫28-32℃，濕度保持為60%-75%，發(fā)酵4-6天，檢測其總孢子含量不低于30億CFU/g，即可低溫風(fēng)干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到桔綠木霉菌粉；其中，所述的PDA固體培養(yǎng)基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，瓊脂20g；其中，所述的桔綠木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣85%，芝麻渣粕2%，玉米芯5%，石粉4%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%；各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟六、將上述步驟中的阿布拉鏈霉菌菌粉10-30份，田無鏈霉菌菌粉10-30份，土壤短芽孢桿菌菌粉10-30份，克勞氏芽孢桿菌菌粉10-30份，桔綠木霉菌粉10-30份與黃腐酸鉀10-30混勻，包裝即為復(fù)合微生物菌肥。其中，該復(fù)合微生物菌肥在防治黃萎病的方法為拌種與澆根，拌種的用量為每千克種子用50-150克復(fù)合微生物菌肥均勻拌種；澆根的使用方法為：將復(fù)合微生物菌粉稀釋100-200倍，每棵棉花澆根復(fù)合微生物菌粉稀釋液50-100毫升，另外的該復(fù)合微生物菌肥在防治黃萎病的方法為底施：在翻地之前均勻施入本復(fù)合微生物菌肥5-10kg，可更好的抑制病原菌的生長，可起到改良土壤的作用。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：、本發(fā)明中包含的阿布拉鏈霉菌，田無鏈霉菌，土壤短芽孢桿菌，克勞氏芽孢桿菌，桔綠木霉五種菌是從450多株微生物菌株中篩選得到的能共生共存，能產(chǎn)生多種抗菌素如藤黃霉素和阿布拉霉素；它們對抑制棉花黃萎病病原菌--大麗花輪枝菌有特別強(qiáng)大的效果，從而達(dá)到超強(qiáng)防治棉花黃萎病的效果，其對棉花黃萎病的藥效高，平均防效在90.0%以上，且針對性強(qiáng)；、本發(fā)明的菌種能夠全面的利用微生物種間或種內(nèi)的抗生、競爭、重寄生、溶菌作用，以及通過次級代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生抗病性，增強(qiáng)其防病效果；、本發(fā)明中所使用的這5株菌株都是可從土壤中直接分離得到，如土壤短芽孢桿菌具有固氮與根跡促生作用，其他的菌都可在作物表面、植株內(nèi)部或土壤中繁殖生長的同時，并定向植物根際分泌某些次生代謝產(chǎn)物，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收、刺激植株生長起到肥料的效果，增產(chǎn)效果明顯；(4)、本發(fā)明復(fù)合微生物菌肥對人、畜安全，屬于環(huán)境友好型，利用本發(fā)明方法防治棉花黃萎病不易產(chǎn)生抗藥性，本發(fā)明制備方法簡單、成本低、使用簡單。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種防治棉花黃萎病的復(fù)合微生物菌肥，其特征在于，該微生物菌肥的原料配比為：阿布拉鏈霉菌菌粉20份，田無鏈霉菌菌粉20份，土壤短芽孢桿菌菌粉20份，克勞氏芽孢桿菌菌粉20份，桔綠木霉菌粉20份，黃腐酸鉀20份；其制備方法，包括以下步驟：步驟一，阿布拉鏈霉菌菌粉的制備取出阿布拉鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為阿布拉鏈霉菌種子液；二級種子擴(kuò)培：將上述制備的阿布拉鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至滅菌的阿布拉鏈霉菌液體二級種子培養(yǎng)基上，500L的發(fā)酵罐裝液量為350L，通氣量為每分鐘液氣比為1：0.8，28-30℃培養(yǎng)40小時，檢測其菌體含量為82g/L時，即作為阿布拉鏈霉菌二級種子液；發(fā)酵：將上述制備的阿布拉鏈霉菌二級種子液以20%的接種量接種至滅菌的阿布拉鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與阿布拉鏈霉菌固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的阿布拉鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-10cm，控溫28-32℃，前兩天空氣濕度保持為60%-75%，過后空氣濕度保持為40%-50%，發(fā)酵4天，檢測其孢子含量為38億CFU/g，低溫風(fēng)干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到渾圓鏈霉菌菌粉；其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5，硫酸鎂：0﹒5，氯化鈉：0﹒5，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的阿布拉鏈霉菌二級液體種子培養(yǎng)基：菜粕粉2%，木薯粉2%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣1%，硫酸鎂0.1%，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的阿布拉鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：粗玉米皮80%，菜粕2%，木薯粉1%，石粉9%，麩皮8%，硫酸錳0.004%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，固體培養(yǎng)基含水量為40%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟二，田無鏈霉菌菌粉的制備取出田無鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為田無鏈霉菌種子液；二級種子擴(kuò)培：將上述制備的田無鏈霉菌種子液以1%的接種量接種至滅菌的田無鏈霉菌液體二級種子培養(yǎng)基上，500L的發(fā)酵罐裝液量為350L，通氣量為每分鐘液氣比為1：0.8，28-30℃培養(yǎng)38小時，檢測其菌體含量為65g/L時，即作為田無鏈霉菌二級種子液；發(fā)酵：將上述制備的田無鏈霉菌二級種子液以20%的接種量接種至滅菌的田無鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與田無鏈霉菌固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的田無鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-10cm，控溫28-32℃，前兩天空氣濕度保持為60%-75%，過后空氣濕度保持為40%-50%，發(fā)酵3-5天，檢測其孢子含量為54億CFU/g，低溫風(fēng)干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到田無鏈霉菌菌粉；其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5，硫酸鎂：0﹒5，氯化鈉：0﹒5，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的田無鏈霉菌二級液體種子培養(yǎng)基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣1%，硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，PH7﹒2～7﹒4；其中，所述的田無鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣80%，菜粕2%，木薯粉1%，石粉9%，粗玉米皮8%，硫酸錳0.004%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，固體培養(yǎng)基含水量為40%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟三，土壤短芽孢桿菌菌粉的制備取出土壤短芽孢桿菌保藏管，用無氮固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)72小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有無氮固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L土壤短芽孢桿菌種子培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前8小時通氣量為100L/min，8-24小時后通氣量為200L/min，24小時后通氣量為300L/min，30℃培養(yǎng)36小時，檢測總菌數(shù)含量為22億cfu/ml，即可作為土壤短芽孢桿菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的土壤短芽孢桿菌種子液以15%的比例接種至土壤短芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上，混勻，在淺盤上發(fā)酵，堆料厚度為5-10cm，控制發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵44小時，檢測其芽孢含量為58億cfu/g，曬干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到土壤短芽孢桿菌菌粉；其中，所述無氮固體培養(yǎng)基：蔗糖10g，磷酸氫二鉀0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，硫酸鈣0.1g，碳酸鈣5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH7.2；其中，所述土壤短芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10g/L，棉粕粉40g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.6g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，碳酸鈣10g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；土壤短芽孢桿菌固體培養(yǎng)基：甘蔗渣57%，麩皮35%，棉粕5%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘步驟四，克勞氏芽孢桿菌菌粉的制備取出克勞氏芽孢桿菌保藏管，用營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L液體種子培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前10小時通氣量為200L/min，10小時后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)20小時，檢測總菌含量為25億cfu/ml，即可作為克勞氏芽孢桿菌種子液；發(fā)酵：將上述制備的克勞氏芽孢桿菌種子液以總接種量的10%-20%的接種量加至克勞氏芽孢桿菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，在淺盤上發(fā)酵，堆料厚度為5-10cm，控制發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵42小時，檢測芽孢含量為84億cfu/g，曬干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到克勞氏芽孢桿菌菌粉；其中，所述營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述液體種子培養(yǎng)基：糖蜜35g/L，豆粕粉20g/L，硫酸鎂0.6g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，碳酸鈣5.0g/L，pH7.0；其中，克勞氏芽孢桿菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50%，粗玉米皮42%，棉粕5%，石粉1%，啤酒糟2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟五，桔綠木霉菌粉的制備A、桔綠木霉種子液的制備：取出桔綠木霉菌種保藏管，用PDA固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)6天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升PDA固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)4-6天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為桔綠木霉種子液；發(fā)酵：將上述制備的桔綠木霉種子液以2%的接種量接種至滅菌的桔綠木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與桔綠木霉固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的桔綠木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-10cm，控溫28-32℃，濕度保持為60%-75%，發(fā)酵5天，檢測其總孢子含量為34億CFU/g，低溫風(fēng)干，待水分含量低于10%，粉碎過100目篩，即得到桔綠木霉菌粉；其中，所述的PDA固體培養(yǎng)基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，瓊脂20g；其中，所述的桔綠木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣85%，芝麻渣粕2%，玉米芯5%，石粉4%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%；各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。步驟六、將上述步驟中的阿布拉鏈霉菌菌粉20份，田無鏈霉菌菌粉20份，土壤短芽孢桿菌菌粉20份，克勞氏芽孢桿菌菌粉20份，桔綠木霉菌粉20份與黃腐酸鉀20混勻，包裝即為復(fù)合微生物菌肥。實(shí)施例2復(fù)合微生物菌肥對棉花黃萎病的防治效果試驗(yàn)(一)試驗(yàn)處理：(1)試驗(yàn)組一：實(shí)施例1制備的復(fù)合微生物菌肥，拌種的用量為每千克種子用100克復(fù)合微生物菌肥均勻拌種；播種后正常培養(yǎng)。待棉苗生長至兩葉一新片真葉時，切根接種棉花黃萎病原菌-大麗花輪枝菌菌株的孢子懸浮液(108個孢子/毫升)；(2)試驗(yàn)組二：不拌種，直接播種后正常培養(yǎng)。待棉苗生長至兩葉一新片真葉時，切根接種棉花黃萎病原菌-大麗花輪枝菌菌株的孢子懸浮液(108個孢子/毫升)后，將實(shí)施例1制備的復(fù)合微生物菌粉稀釋150倍，每棵棉花澆根復(fù)合微生物菌粉稀釋液60毫升；(3)試驗(yàn)組三：底施：在翻地之前均勻施入實(shí)施例1生產(chǎn)的本復(fù)合微生物菌肥6kg/畝，不拌種，直接播種后正常培養(yǎng)。待棉苗生長至兩葉一新片真葉時，切根接種棉花黃萎病原菌-大麗花輪枝菌菌株的孢子懸浮液(108個孢子/毫升)；藥劑對照組:多菌靈100倍稀釋液拌種，待棉苗生長至兩葉一新片真葉時，切根接種棉花黃萎病原菌-大麗花輪枝菌菌株的孢子懸浮液(108個孢子/毫升)；空白對照:清水拌種，待棉苗生長至兩葉一新片真葉時，切根接種棉花黃萎病原菌-大麗花輪枝菌菌株的孢子懸浮液(108個孢子/毫升)；繼續(xù)培養(yǎng)至空白對照充分發(fā)病時調(diào)查病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。每組三個平行，每個平行100株棉花。試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果見表1：該復(fù)合微生物菌肥在防治黃萎病的方法為拌種，澆根，或直接底施改土，這三種施入方法，相對于化學(xué)藥劑都有明顯的效果，并且相對空白對照組的防效達(dá)到了85%以上，效果非常顯著；相對而言，進(jìn)行底施效果更佳，防效可達(dá)到90%以上，而且可減少水量的施入，減少人工，因此推薦是底施；從增產(chǎn)上也明顯可以看出，使用本發(fā)明的復(fù)合微生物菌肥的效果顯著高于使用化學(xué)藥劑的防治效果。表1復(fù)合微生物菌肥對棉花黃萎病防效試驗(yàn)結(jié)果處理病情指數(shù)防效（%）平均產(chǎn)量（kg）增產(chǎn)率（%）試驗(yàn)組一12.385.598.78442.04試驗(yàn)組二9.189.349.02345.91試驗(yàn)組三8.290.399.48853.43化學(xué)藥劑45.646.577.26217.43空白對照85.346.184當(dāng)前第1頁1 2 3