本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一種用于魚類單殖吸蟲的體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

單殖吸蟲病是養(yǎng)殖魚類最嚴(yán)重的寄生蟲病之一。單殖吸蟲種類繁多，幼蟲直接發(fā)育成成蟲，沒有中間宿主，繁殖速度非?？?。它們通常以其后附著器的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)插入魚類的組織，破壞鰓及皮膚組織，單殖吸蟲寄生后通過繼發(fā)感染致病細(xì)菌和真菌，造成魚類“爛鰓病”的臨床癥狀，引起養(yǎng)殖魚類大量死亡。

目前，研究用于單殖吸蟲的活體樣本，主要方法是借助寄生在魚鰓和幼魚鰭條上的單殖吸蟲，在自然繁殖下感染其它健康魚體獲得。該方法存在一些弊端：

(1)單殖吸蟲病的流行具有明顯的季節(jié)性，一年的流行時(shí)段只有3～4個(gè)月左右，除了這段時(shí)間就很難找到攜帶大量單殖吸蟲的活體樣本，并且單殖吸蟲(包括幼蟲、成蟲)離開魚體后，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)大多就死亡，這就給藥物篩選和藥理研究造成了極大的限制；

(2)借助魚體培養(yǎng)的方法不利于實(shí)驗(yàn)觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，因?yàn)閱沃澄x在魚鰓上分布不均勻，在實(shí)驗(yàn)操作過程中魚鰓位置容易移動(dòng)變化，不利于進(jìn)行單殖吸蟲的觀察，且不同魚的鰓上寄生的蟲體數(shù)量差別較大，不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的檢測結(jié)果存在較大差異，人為影響因素較大，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性不佳；

(3)借助魚體培養(yǎng)的方法不便于單殖吸蟲的機(jī)理研究，水環(huán)境是非常復(fù)雜的，在研究單個(gè)環(huán)境因素對(duì)單殖吸蟲的作用時(shí)難以控制。

因此，提供一種可行的單殖吸蟲體外培養(yǎng)的方法，對(duì)于單殖吸蟲的研究及其防治技術(shù)研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，目的在于提供一種用于魚類單殖吸蟲的體外培養(yǎng)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種用于魚類單殖吸蟲的體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)無菌條件下，將經(jīng)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞重懸于第一培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度后轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)皿中，置于第一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去所述第一培養(yǎng)基，加入第二培養(yǎng)基，待用；

(2)將從魚體剝離的單殖吸蟲重懸于第二培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)接于步驟(1)所述培養(yǎng)皿中，于第二培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，獲得在體外存活的魚類單殖吸蟲。

上述方案中，所述細(xì)胞密度為1.0×10⁶～3.0×10⁶個(gè)/mL。

上述方案中，所述單殖吸蟲為指環(huán)蟲。

上述方案中，所述細(xì)胞為鯉魚上皮細(xì)胞。

上述方案中，所述第一培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和抗生素的混合液，所述M199培養(yǎng)基和胎牛血清的體積比為9:1，所述抗生素為青霉素和鏈霉素的混合液，所述青霉素的工作濃度為100U/mL，所述鏈霉素的工作濃度為100μg/mL。

上述方案中，所述第一培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，通入體積濃度為5％的CO₂氣體。

上述方案中，所述第二培養(yǎng)基為第一培養(yǎng)基和細(xì)胞等滲液的混合液，所述細(xì)胞等滲液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65％的NaCl溶液。

上述方案中，所述第一培養(yǎng)基和細(xì)胞等滲液的體積比為1:9～7:3。更為優(yōu)選地，所述第一培養(yǎng)基和細(xì)胞等滲液的體積比為5:5。

上述方案中，所述第二培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃。

本發(fā)明用于魚類單殖吸蟲的體外培養(yǎng)方法，可以廣泛推廣應(yīng)用于多種魚類寄生蟲的體外培養(yǎng)，對(duì)于不同寄生蟲的體外研究具有更好地指導(dǎo)性意義。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明提供了一種用于魚類單殖吸蟲的體外培養(yǎng)方法，解決了傳統(tǒng)的魚類單殖吸蟲必須寄生在魚體上，無法離體存活的問題；(2)本發(fā)明采用鯉魚上皮細(xì)胞作為寄生載體，鯉魚上皮細(xì)胞貼壁生長后固定附著在培養(yǎng)皿底部，因此可以較好的觀察單殖吸蟲的形態(tài)，并且可以根據(jù)研究條件選擇不同規(guī)格的培養(yǎng)皿，加入確定數(shù)量的單殖吸蟲，便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。(3)本發(fā)明所述體外培養(yǎng)方法的模型為細(xì)胞模型，所采用的寄生載體(鯉魚上皮細(xì)胞)非常容易大量獲得，不受時(shí)間限制，因此，可以極大地縮短單殖吸蟲創(chuàng)新藥物的篩選周期，同時(shí)更方便進(jìn)行單殖吸蟲食性研究。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80，其中1為指環(huán)蟲，11為指環(huán)蟲的固著盤，12為指環(huán)蟲的頭器，2為鯉魚上皮細(xì)胞。

圖2為本發(fā)明所述指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)的光鏡下形態(tài)觀察截圖，×80；其中，

(A)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)0秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(B)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)1秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(C)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)2秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(D)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)3秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(E)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)4秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(F)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)5秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(G)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)6秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(H)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)7秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(I)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)8秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(J)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)9秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(K)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)10秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80；

(L)指環(huán)蟲體外培養(yǎng)作尺蠖運(yùn)動(dòng)11秒時(shí)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

圖1示出了本發(fā)明的指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的光鏡下形態(tài)觀察圖，×80，示出了本專利的單殖吸蟲寄生在細(xì)胞的形態(tài)。

本發(fā)明所述用于魚類單殖吸蟲的體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)無菌條件下，將經(jīng)傳代培養(yǎng)的鯉魚上皮細(xì)胞重懸于第一培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×10⁶～3.0×10⁶個(gè)/mL后轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)皿中，置于第一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去所述第一培養(yǎng)基，加入第二培養(yǎng)基，待用；

(2)將從魚體剝離的單殖吸蟲重懸于第二培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)接于步驟(1)所述培養(yǎng)皿中，于第二培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，獲得在體外存活的魚類單殖吸蟲。

顯微鏡下觀察所述單殖吸蟲，可見所述單殖吸蟲穩(wěn)定粘附于細(xì)胞上作尺蠖狀運(yùn)動(dòng)，與所述單殖吸蟲在魚鰓上和鰭條上的運(yùn)動(dòng)方式一致。步驟(1)中的高密度細(xì)胞在貼壁后，形成一層緊密排列的單層細(xì)胞層，意在模擬魚鰓鰓絲表面結(jié)構(gòu)，為單殖吸蟲提供寄生載體，并且將細(xì)胞固定在細(xì)胞平皿上，待單殖吸蟲粘附到細(xì)胞表面后，便于單殖吸蟲的觀察與計(jì)數(shù)，這種培養(yǎng)方法可以讓單殖吸蟲在脫離寄生宿主后，在體外條件下存活較長時(shí)間，便于研究的進(jìn)行。

所述單殖吸蟲為指環(huán)蟲。圖1中為指環(huán)蟲1的固著盤11吸附在鯉魚上皮細(xì)胞2上，頭器12伸縮活動(dòng)，圖2為指環(huán)蟲1粘附在鯉魚上皮細(xì)胞2上后作尺蠖運(yùn)動(dòng)，從第0秒～第10秒，每隔1秒截取的光鏡下形態(tài)觀察靜態(tài)圖，可見指環(huán)蟲1的活性非常好，與寄生在魚鰓上一致。

所述細(xì)胞為鯉魚上皮細(xì)胞。鯉魚上皮細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，最適培養(yǎng)溫度為25℃，單殖吸蟲的最適培養(yǎng)溫度也為25℃，因此在培養(yǎng)條件上比較合適。

所述第一培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和抗生素的混合液，所述抗生素為青霉素(工作濃度為100U/mL)和鏈霉素(工作濃度為100μg/mL)，所述M199培養(yǎng)基和胎牛血清的體積比為9:1。M199培養(yǎng)基是培養(yǎng)鯉魚上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，富含比較全的營養(yǎng)成分，相比其他培養(yǎng)基而言，并且在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，M199培養(yǎng)基比RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)出的單殖吸蟲活力更強(qiáng)，由于青霉素和鏈霉素是細(xì)胞培養(yǎng)所需的主要抗生素，且具有廣譜抑菌作用，故選擇這兩種抗生素作為本發(fā)明的抗生素，但其他抗生素亦可以得到相同效果，并不局限于此。

所述第一培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25℃，通入體積濃度為5％的CO₂氣體。鯉魚上皮細(xì)胞的培養(yǎng)條件為最適培養(yǎng)溫度為25℃，該溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞擁有較好的形態(tài)及活力。

所述第二培養(yǎng)基為所述第一培養(yǎng)基：細(xì)胞等滲液的體積分?jǐn)?shù)比為1:9～7:3。當(dāng)?shù)谝慌囵B(yǎng)基：細(xì)胞等滲液的體積分?jǐn)?shù)比為1:9～7:3時(shí)，短時(shí)間內(nèi)，第二培養(yǎng)基可以保持無菌狀態(tài)，且單殖吸蟲可以短時(shí)間內(nèi)體外存活。

所述第二培養(yǎng)基為所述第一培養(yǎng)基：細(xì)胞等滲液的體積分?jǐn)?shù)比為5:5。當(dāng)?shù)谝慌囵B(yǎng)基：細(xì)胞等滲液的體積分?jǐn)?shù)比為5:5時(shí)，第二培養(yǎng)基可以長期保持無菌狀態(tài)，且單殖吸蟲可以體外存活更長時(shí)間。

所述細(xì)胞等滲液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65％的NaCl溶液。與水相比，細(xì)胞等滲液能更好地維持單殖吸蟲形態(tài)和活性，由于魚是變溫動(dòng)物，所以細(xì)胞等滲液使用兩棲類動(dòng)物生理鹽水更為合適，但細(xì)胞等滲液不僅僅指0.65％的NaCl溶液，D-Hanks溶液和PBS溶液亦可達(dá)到相同效果。

所述第二培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃。鑒于25℃為鯉魚上皮細(xì)胞和單殖吸蟲的最適培養(yǎng)溫度，缺乏通入體積濃度為5％的CO₂氣體不會(huì)對(duì)細(xì)胞形態(tài)造成變化，并且通入體積濃度為5％的CO₂氣體會(huì)造成單殖吸蟲的死亡，故選擇25℃作為第二培養(yǎng)條件。

下面通過實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的有效性作進(jìn)一步說明。

實(shí)驗(yàn)一

為了摸索M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)按體積比9:1混合的混合液對(duì)單殖吸蟲的影響，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：取25個(gè)從魚鰓剝離的單殖吸蟲，分為5組，每組5個(gè)單殖吸蟲，置于等倍稀釋(稀釋液為細(xì)胞等滲液，實(shí)驗(yàn)一～實(shí)驗(yàn)四中的稀釋液均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65％的NaCl溶液)的不含抗生素的混合液中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，每隔24小時(shí)顯微鏡下觀察一次。

表1 M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)的混合液對(duì)單殖吸蟲的影響

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)混合液(無抗生素)稀釋后雖然可以延緩細(xì)菌繁殖速度，但最終還是無法控制，仍需要添加抗生素；推測高濃度的混合液可能不適合單殖吸蟲的生長。

實(shí)驗(yàn)二

為了確定高濃度的M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)的混合液對(duì)單殖吸蟲生長的影響，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：取55個(gè)從魚鰓剝離的單殖吸蟲，分為11組，每組5個(gè)單殖吸蟲，向混合液(M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)按體積比9:1混合)中加入抗生素，將單殖吸蟲置于抗生素濃度逐步稀釋的混合液中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，每隔24小時(shí)顯微鏡下觀察一次，其中，工作濃度為100U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素的抗生素混合液的濃度，記為1×；含有1×抗生素的混合液即為第一培養(yǎng)基。

表2含抗生素的M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)的混合液對(duì)單殖吸蟲生長的影響

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，未經(jīng)稀釋液稀釋的混合液(無論是否添加抗生素)對(duì)單殖吸蟲都是有傷害的；抗生素工作濃度在0.3×～1×?xí)r，都是有較好的抑菌效果的。

實(shí)驗(yàn)三

為了進(jìn)一步摸索單殖吸蟲體外培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基及抗生素工作濃度，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)：取55個(gè)從魚鰓剝離的單殖吸蟲，分為11組，每組5個(gè)單殖吸蟲，置于用稀釋液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65％的NaCl溶液)逐步稀釋的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，每隔24小時(shí)顯微鏡下觀察一次。

表3稀釋液稀釋的第一培養(yǎng)基對(duì)單殖吸蟲生長的影響

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，體外培養(yǎng)適宜條件為實(shí)驗(yàn)組第六組和第七組，但考慮到實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二中高濃度的混合液和高濃度的抗生素對(duì)單殖吸蟲有不好的影響，故選擇第六組為第二培養(yǎng)基作為后面單殖吸蟲離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)四

在實(shí)驗(yàn)三中，與在稀釋液中相比，單殖吸蟲可以在第二培養(yǎng)基中存活兩天，但仍然時(shí)間不夠長，因此，推測單殖吸蟲的離體培養(yǎng)的難點(diǎn)不僅僅是營養(yǎng)因素，還存在缺乏寄生載體的原因。為了模擬魚鰓表面層，選擇培養(yǎng)至形成單分子層的鯉魚上皮細(xì)胞(EPC)做為寄生載體，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)：取30個(gè)從魚鰓剝離的單殖吸蟲，分為6組，包括4個(gè)對(duì)照組和兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組5個(gè)單殖吸蟲，培養(yǎng)溫度25℃，每隔24小時(shí)于顯微鏡下觀察單殖吸蟲的狀態(tài)。

表4寄生載體EPC細(xì)胞對(duì)單殖吸蟲生長的影響

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)比照組1和對(duì)照組2，我們發(fā)現(xiàn)在沒有EPC細(xì)胞作為寄生載體時(shí)，即便培養(yǎng)介質(zhì)是第二培養(yǎng)基，通入體積濃度為5％的CO₂氣體仍會(huì)造成單殖吸蟲的死亡；對(duì)比對(duì)照組3和對(duì)照組4可知，在有或無5％CO₂下，第二培養(yǎng)基均可以長期維持EPC細(xì)胞的形態(tài)不變；對(duì)比實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，發(fā)現(xiàn)單殖吸蟲可以粘附在EPC細(xì)胞上，EPC細(xì)胞可作為單殖吸蟲體外培養(yǎng)的寄生載體，并且在無5％CO₂環(huán)境下的EPC細(xì)胞上附著存活更長時(shí)間。

該發(fā)明解決了單殖吸蟲必須寄生在魚鰓或幼魚鰭條上，無法離體存活的問題，不會(huì)像傳統(tǒng)的單殖吸蟲病研究受到流行季節(jié)的限制，因此具有縮短單殖吸蟲病新藥創(chuàng)制研究周期的作用。

該發(fā)明使用細(xì)胞模型體外培養(yǎng)單殖吸蟲，方便移植到其他魚類寄生蟲的體外培養(yǎng)，不僅可以讓魚類寄生蟲的研究不受活體樣本的限制，還可以人為地控制接種寄生蟲的密度，使得各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。