本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛蒴果開裂后種子的無菌播種方法，屬于鐵皮石斛種子無菌播種技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛（Dendrobium officinate Kimura et Migo） 是蘭科石斛屬多年生附生型草本植物，生于海拔2100~2500m的林中樹上或林緣巖石上。鐵皮石斛具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、潤肺止咳等功效，具有較高的藥用價(jià)值。近年來，鐵皮石斛野生資源遭到大量采挖、破壞，并逐年減少，現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài)，被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材品種。

野生狀態(tài)下，鐵皮石斛生長緩慢，從開花授粉至果實(shí)成熟約需6個(gè)月。且由于其花型結(jié)構(gòu)特殊，導(dǎo)致授粉困難，自然條件下所結(jié)蒴果極少。鐵皮石斛每粒蒴果內(nèi)有數(shù)以萬計(jì)的種子，但種子細(xì)小、沒有胚乳，因而無法靠自身儲(chǔ)存的養(yǎng)分生長。在野外，蒴果成熟時(shí)容易裂開， 種子隨風(fēng)飄散，自然繁殖率極低。

目前，運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)已實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛的工廠化生產(chǎn)。由于鐵皮石斛種子數(shù)量龐大，可直接獲得大量種苗，而無菌播種是實(shí)現(xiàn)種苗高效萌發(fā)的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有技術(shù)方案，將成熟的蒴果收集保存于冷藏室中，需要播種時(shí)取出。用手術(shù)刀片把花蒂一端削平，依次使用酒精和升汞溶液進(jìn)行浸泡消毒，隨后使用無菌水沖洗后，將蒴果剖開取出種子，均勻地散布于萌發(fā)培養(yǎng)基上。但是，由于蒴果在冷存、取用、操作過程中難免發(fā)生破損，且成熟的鐵皮石斛蒴果極易開裂，上述消毒方法并不適用于細(xì)小且數(shù)量龐大的鐵皮石斛種子消毒。鑒于鐵皮石斛野生資源瀕?，F(xiàn)狀，應(yīng)采取有效措施最大程度地利用現(xiàn)有資源，才能保證鐵皮石斛擁有足夠豐富的種質(zhì)資源用于植株復(fù)壯，以避免長期工廠化育苗導(dǎo)致的種苗性狀衰退和藥效降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛蒴果開裂后種子的無菌播種方法，能夠消毒鐵皮石斛的種子并進(jìn)行無菌播種，其種子殺菌率和萌發(fā)率均在90%以上，本發(fā)明提高了鐵皮石斛野生資源的保護(hù)和利用效率，有利于穩(wěn)定工廠化生產(chǎn)的植株性狀和品質(zhì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種鐵皮石斛蒴果開裂后種子的無菌播種方法，其特征在于包括以下步驟：

a）將鐵皮石斛種子粉末收集到錐形瓶中，加吐溫溶液，攪拌制得種子懸濁液，靜置4h；

b）過濾，收集種子，并使用清水沖洗3~5次；

c）將步驟b）收集到的種子，投入裝有升汞溶液的錐形瓶中浸泡15min，進(jìn)行消毒；

d）過濾，得到消毒后的種子，并使用無菌水沖洗3~5次；

e）將步驟d）收集到的種子，撥到鐵皮石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

作為本發(fā)明優(yōu)選方案，步驟a）和步驟c）采用的錐形瓶容量為50ml。

作為本發(fā)明優(yōu)選方案，步驟c）所述升汞溶液濃度為1mg/ml，體積為45ml。

作為本發(fā)明優(yōu)選方案，步驟b）和步驟d）采用150目銅網(wǎng)進(jìn)行過濾。

進(jìn)一步地，步驟d）所述銅網(wǎng)采用高溫高壓滅菌。

作為本發(fā)明優(yōu)選方案，步驟c）~步驟e）均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

作為本發(fā)明優(yōu)選方案，步驟c）所述錐形瓶采用高溫高壓滅菌。

作為本發(fā)明優(yōu)選方案，步驟c）在浸泡到7min時(shí)，進(jìn)行攪動(dòng)。

進(jìn)一步地，步驟c）使用高溫高壓滅菌后的滴管進(jìn)行所述攪動(dòng)。

本發(fā)明的有益效果是：

1. 本發(fā)明采用浸泡消毒的方式處理鐵皮石斛種子，殺菌效率高；且升汞溶液對(duì)種子的毒害作用較小，不影響其正常萌發(fā)。

2. 本發(fā)明能夠單獨(dú)處理鐵皮石斛數(shù)量龐大且細(xì)小的種子，顯著提高了種質(zhì)資源的有效利用率。一方面有利于降低工廠化生產(chǎn)成本，另一方面有利于保護(hù)野生種質(zhì)資源，便于維護(hù)植株性狀和品質(zhì)。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體實(shí)施方式如下。

實(shí)施例

（1）種子預(yù)處理

取一粒開裂的鐵皮石斛蒴果，將其種子粉末收集到一個(gè)50ml錐形瓶內(nèi)，加入40ml質(zhì)量體積比濃度為0.5%的吐溫20溶液，攪拌至形成種子懸濁液。靜置4h后，用150目銅網(wǎng)做的漏斗進(jìn)行過濾。過濾得到的種子，使用清水沖洗5次，每次沖洗時(shí)間不少于30s。

（2）器具消毒

將50ml錐形瓶、150目銅網(wǎng)漏斗、膠頭滴管、鑷子、種子萌發(fā)培養(yǎng)基等器具放入高壓滅菌鍋中，121℃滅菌15min。取出后，放入超凈工作臺(tái)中待用。

（3）種子消毒

超凈工作臺(tái)中，在滅菌后的錐形瓶內(nèi)加入45ml濃度為1mg/ml的升汞溶液作為種子消毒劑。將步驟（1）處理后的種子撥入消毒劑中，使用滅菌后的膠頭滴管吹打、混勻，靜止7min后，重復(fù)一次吹打、混勻過程，再靜止7min。

（4）無菌播種

使用滅菌后的銅網(wǎng)漏斗過濾步驟（3）的消毒劑，使用無菌水沖洗銅網(wǎng)漏斗中的種子5次，每次沖洗時(shí)間不少于1min。取滅菌后的種子萌發(fā)培養(yǎng)基，使用滅菌后的鑷子夾取沖洗后的種子，在培養(yǎng)基表面上布勻，完成無菌播種。

對(duì)上述方案進(jìn)一步說明如下：

采用吐溫溶液對(duì)鐵皮石斛細(xì)小的種子進(jìn)行包裹，有利于降低種子地表面張力，一方面便于這些種子分散開，并能夠懸浮在溶液中，而不是漂浮在溶液表面；另一方面，吐溫溶液能夠促進(jìn)后續(xù)消毒液的展布速度和在種子表面的滲透速度，有利于提高種子殺菌效率。

升汞溶液作為消毒劑，處理時(shí)間短，殺菌效果好，因而被廣泛應(yīng)用于組培外植體前處理。本發(fā)明采用升汞溶液浸泡處理鐵皮石斛種子，在消毒過程中途采用滴管吹打的方式進(jìn)行攪拌，混勻方式柔和，有利于避免損傷種子。

由于吐溫和升汞對(duì)種子均具有一定的殺傷性，因而操作時(shí)間必須準(zhǔn)確。

種子消毒以及播種的全過程均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)無菌播種，保證種子萌發(fā)率。

選用銅網(wǎng)作為過濾裝置，其原因在于：升汞溶液具有一定的腐蝕性，而銅具備一定的抗腐蝕能力，且銅網(wǎng)易于清理和消毒，流阻小。150目的濾網(wǎng)篩選的最小粒度為100微米左右，與鐵皮石斛種子粒度相匹配。

一粒鐵皮石斛蒴果的種子，使用30~40ml溶液能夠達(dá)到充分分散效果。過大的容器易于導(dǎo)致種子損耗，因而采用50ml錐形瓶。

采用上述方案進(jìn)行無菌播種的鐵皮石斛種子，平均殺菌率90.6%，22℃培養(yǎng)20天，種子萌發(fā)率93.2%。