本發(fā)明涉及轉基因棉花技術領域，具體涉及一種高成活率的轉基因棉花再生株移栽法。

背景技術：

傳統(tǒng)的棉花農桿菌介導轉化研究使用下胚軸為外植體，其轉化和再生經歷體細胞胚胎發(fā)生途徑，再生植株的高頻轉化再生體系等。受轉化周期長、成胚率低、易出現(xiàn)畸形胚、體細胞胚植株再生比例低和缺乏莖的伸長等多因素的限制，獲得轉基因再生株的整個過程相對較長。一般從農桿菌共培養(yǎng)開始，到獲得完整再生幼苗需8～12個月。在此基礎上，通過分子檢測證實目的基因已經成功導入受體的轉基因再生苗就更為珍貴。盡管如此，轉基因再生苗只有移栽成活才能真正實現(xiàn)進入常規(guī)遺傳育種應用。因此，提高轉基因再生株的移植成活率一直是棉花轉基因領域非常重要的研究環(huán)節(jié)。目前，轉基因棉花再生株的移植主要采用常規(guī)移栽法和嫁接法。

李燕娥等(2010)報道了轉基因棉花再生株的常規(guī)移栽法，其主要程序包括：轉基因再生株生根苗打開瓶蓋→培養(yǎng)間煉苗1-2天→洗去再生株根部培養(yǎng)基→栽入裝有滅菌的土壤或砂土中→一次性澆透水→放入濕度70％、溫度27℃～29℃培養(yǎng)箱中先整株蓋株培養(yǎng)8～10天，然后移去蓋株的容器，再在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天左右→移入溫室或網室中至棉花吐絮成熟(李燕娥,上官小霞,吳霞等.一種轉基因棉花再生株移植法.專利公告號CN 101773039A)。

陳天子等(2013)也報道了轉基因棉花再生幼苗簡易移栽方法。其主要程序包括：將有健壯根系的再生幼苗，直接移栽到商品化的有機栽培基質，移栽后保濕14d左右再緩慢透氣7d左右、溫度控制在25～30℃相對穩(wěn)定的溫度范圍內，轉基因棉花再生幼苗移栽成活(陳天子，秦郁，張保龍.轉基因棉花再生幼苗簡易移栽方法.江蘇農業(yè)科學，2013,41(11):87-89)。

王清連等(1999)報道的轉基因棉花再生株嫁接法，其主要程序包括：在溫室或網室把轉基因棉花再生株嫁接在盆缽內種植的(棉花)砧木上，然后用塑料薄膜(或特殊容器)包裹整株棉花苗，7天后逐步放風，最后取掉包裹的塑料薄膜或容器(王清連,張寶紅,劉方。一種適用于再生植株和轉基因移栽的新方法。河南職技師院學報，1999，27(3):27～29)。

由于經過組織培養(yǎng)再生體系獲得的轉基因棉花再生株長勢較弱，根系不發(fā)達。利用前人報道的常規(guī)移栽法獲得的轉基因再生株成活率一般50％～80％，跨度較大，程序也較繁瑣；而轉基因棉花再生株嫁接法對于操作人員的技術要求較高，工作量較大。要求轉基因再生苗和砧木的長勢大小要協(xié)調，符合嫁接要求，在時間上不好控制。同時，嫁接苗與砧木在包裹的環(huán)境中極易發(fā)生腐爛，特別在夏季高溫季節(jié)腐爛更為突出。為有效避免上述弊端，簡化操作程序，提高棉花再生植株和轉基因苗的移栽成活率，我們發(fā)明了一種高成活率的轉基因棉花再生株移栽法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高成活率的轉基因棉花再生株移栽法，它能有效解決背景技術中所存在的問題，簡便易操作，大大提高了棉花再生植株和轉基因苗的移栽成活率。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種高成活率的轉基因棉花再生株移栽法，將轉基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈再生株根部的培養(yǎng)基轉移至新的栽培容器中，向栽培容器中加水至浸沒再生株根部進行水培煉苗，經水培煉苗，生長健壯的轉基因植株移栽到基質或土壤中，培養(yǎng)至棉花吐絮成熟。

上述高成活率的轉基因棉花再生株移栽法，包括以下步驟：

(1)將轉基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈再生株根部的培養(yǎng)基轉移至新的栽培容器中，向栽培容器中加水至浸沒再生株根部進行水培煉苗；

(2)將轉基因棉花再生株在濕度60％～70％、溫度為27℃～29℃、光照為白天/晚上16h/8h，12000～15000Lx的條件下進行培養(yǎng)；每隔2～3天更換一次栽培容器中的水，直至轉基因再生株植株健壯，生長出更多根系；

(3)經水培煉苗后的轉基因再生株移栽到基質或土壤中，培養(yǎng)至棉花吐絮成熟。

上述的高成活率的轉基因棉花再生株移栽法，根據(jù)再生株的根系及幼苗生長情況確定水培煉苗的天數(shù)，一般水培煉苗7～15天。

上述的高成活率的轉基因棉花再生株移栽法，所述的水為自來水。

上述的高成活率的轉基因棉花再生株移栽法，所述的栽培容器為三角瓶。

本發(fā)明高成活率的轉基因棉花再生株移栽法的詳細步驟為：

待轉基因棉花再生株生根苗在培養(yǎng)基中生長至三角瓶瓶蓋，將再生株根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到一個空三角瓶中，裝入適量的自來水浸沒再生株根部。在濕度60％～70％、溫度27℃～29℃、光照(白天/晚上：16h/8h,12000～15000Lx)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天更換一次三角瓶中的自來水，直至轉基因再生株植株健壯，生長出更多根系。根據(jù)再生株的根系及幼苗生長情況決定具體培養(yǎng)天數(shù)，一般培養(yǎng)7～15天。經水培煉苗后的轉基因再生株移栽到基質或土壤中，在正常條件的溫室或網室中成活，直到棉花吐絮成熟。

選擇轉基因棉花再生株生根苗，歷經上述培養(yǎng)基培養(yǎng)——根部培養(yǎng)基洗凈——水培煉苗——基質/土壤移栽等步驟后，繼續(xù)在溫室中培養(yǎng)15天，統(tǒng)計移栽成活率。每次移栽50株，共設計6次重復實驗。結果表明，每批次移栽成活率均非常高，6次重復的平均成活率達98.67％(表1)。該方法簡便易操作，可高效、安全地用于轉基因再生株的移栽，確保轉基因再生株的正常生長發(fā)育。

表1轉基因棉花再生株移栽成活率評價

本發(fā)明旨在提高轉基因棉花再生株的移栽苗成活率。在轉基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基到基質/土壤的移栽過程中，增加自來水煉苗環(huán)節(jié)，能夠增強移栽苗的長勢及根系密集程度，培養(yǎng)健壯苗。避免了再生株直接從培養(yǎng)基移栽到基質/土壤中，容易使根部和莖部腐爛的難題。利用本發(fā)明的方法，其移栽苗成活率達到98％以上，且操作方法簡單易行。

采用上述技術方案，本發(fā)明具有以下有益效果：

1)將培養(yǎng)基上的轉基因棉花再生株首先洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝自來水的三角瓶中培養(yǎng)1-2周，避免攜帶培養(yǎng)基帶來的污染，使再生株的根系發(fā)達，植株長勢增強；

2)水培移栽法可使再生株從培養(yǎng)基生長條件向自然生長條件過渡間有一個緩沖階段，為更好的適應自然環(huán)境奠定基礎；

3)解決了再生株直接從培養(yǎng)基移栽到基質/土壤中，容易使根部和莖部腐爛，不易成活的難題。

4)轉基因再生株移栽用的基質/土壤無需滅菌，無需地膜或燒杯等大量容器保濕，操作方法簡便易行。

5)為珍貴的轉基因棉花再生苗提供了一種高成活率的移栽法。利用本發(fā)明的方法，其移栽苗成活率達到98％以上。

附圖說明

圖1剛從培養(yǎng)基中移栽到裝有自來水的三角瓶中的轉基因棉花再生株

圖2經水培煉苗15天后的轉基因棉花幼苗生長發(fā)育表現(xiàn)

圖3轉基因棉花再生株水培煉苗后移栽至基質或土壤中生長一周的生長發(fā)育表現(xiàn)

具體實施方式

實施例1

(1)待轉基因棉花再生株生根苗在培養(yǎng)基中生長至三角瓶瓶蓋，將再生株根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到一個空三角瓶中，裝入適量的(浸沒再生株根部)自來水(如圖1為剛從培養(yǎng)基中移栽到自來水瓶中的轉基因棉花再生株)進行水培煉苗。

(2)在濕度60％～70％、溫度27℃～29℃、光照(白天/晚上：16h/8h,12000～15000Lx)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天更換一次三角瓶中的自來水，培養(yǎng)15天，直至轉基因再生株植株健壯，生長出更多根系(圖2為經水培煉苗15天后的轉基因棉花幼苗)。

(3)水培煉苗后的轉基因再生株移栽到基質或土壤中，在正常條件的溫室或網室中成活，移栽一周后，生長健壯的轉基因棉花幼苗(圖3為移栽一周后，生長健壯的轉基因棉花幼苗)。進一步生長發(fā)育，直到棉花吐絮成熟。

本發(fā)明在轉基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基到基質/土壤的移栽過程中，增加自來水煉苗環(huán)節(jié)，能夠增強移栽苗的長勢及根系密集程度，培養(yǎng)健壯苗。避免了再生株直接從培養(yǎng)基移栽到基質/土壤中，容易使根部和莖部腐爛的難題。利用本發(fā)明的方法，其移栽苗成活率達到98％以上，且操作方法簡單易行。