本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種苦苣苔科植物一步成苗組培快繁方法。

背景技術(shù)：

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物多為多年生草本植物，種類繁多，全世界約有140屬，2000余種，我國有58屬463種。有的種類既耐旱又耐陰、耐濕，有的種類具有很高的藥用價值，有的種類株型、葉形、花形變化豐富，花葉兼美，觀賞價值高，具有一定的室內(nèi)觀賞盆花開發(fā)前景；但目前大多種類尚未進(jìn)入商品開發(fā)階段，且由于自身的遺傳缺陷及野生資源的過度開發(fā)，很多具有較高應(yīng)用價值的苦苣苔科植物已瀕臨滅菌。

苦苣苔常規(guī)繁殖以扦插和種子繁殖為主，因有些苣苔植物自交不孕，結(jié)實(shí)率低或不結(jié)實(shí)，故通常以扦插繁殖應(yīng)用最多，但使用常規(guī)繁殖方法無法快速高校地滿足科研及大規(guī)模生產(chǎn)需要。利用組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)有助于苦苣苔科植物的商品開發(fā)和種質(zhì)資源保存，還有利于苦苣苔科植物的良種選育、人工種子培育、生理代謝研究等工作的進(jìn)一步開展。

目前，苦苣苔的組織培養(yǎng)技術(shù)已有較多報(bào)道，但普遍是針對三個階段，即不定芽的誘導(dǎo)和分化階段、叢生芽的繼代繁殖階段和生根階段，設(shè)立三種不同培養(yǎng)基進(jìn)行，操作上不僅繁瑣，而且從效果上也較差，主要表現(xiàn)在初代培養(yǎng)不定芽的分化率、繼代增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)比較低，生根率不高，如專利CN102144556A公開的瑤山苣苔組織培養(yǎng)及快速繁殖的方法中，其不定芽分化率僅為31.7％，而繁殖系數(shù)僅為4.6/60d，生根率為90.7％；專利CN103141390A公開的紅苞半蒴苣苔的繁殖方法，其記載的繼代繁殖培養(yǎng)的增殖倍數(shù)為3.6倍；CN105325301A公開了一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法，其記載的不定芽分化率最高為86.9％，增殖系數(shù)最高為6.1/50d，生根率最高為89.5％/30d。CN104823855A公開的短毛唇柱苣苔組培快繁方法中，增殖系數(shù)為15，雖然有所提高，但是仍舊不高。

因此，提供一種一步法組培快繁苦苣苔科植物的方法，可以極大地推動苦苣苔科植物的經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種苦苣苔科植物一步成苗組培快繁方法，使得所述組培快繁方法僅通過一種培養(yǎng)基即可完成苦苣苔科植物三個階段的組織培養(yǎng)，同時具備較高的愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、叢生芽增殖系數(shù)和生根率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種苦苣苔科植物一步成苗組培快繁方法，包括：

步驟1、取苦苣苔科植物的外植體進(jìn)行滅菌；

步驟2、將外植體接種到培養(yǎng)基中，先進(jìn)行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織，而后進(jìn)行光培養(yǎng)分化出不定芽；

步驟3、將分化出不定芽的芽塊轉(zhuǎn)接到新鮮的步驟2所述培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得長有叢生芽的有效苗；

步驟4、將有效苗再次轉(zhuǎn)接到新鮮的步驟2所述培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得完整無菌苗；

其中，步驟2中所述培養(yǎng)基組分包含：

MS鹽、white有機(jī)物、0.3～0.8mg/L的6-BA、0.15～0.3mg/L的NAA、0.05mg/L的IBA、2.5ml/L的植培靈，25g/L的蔗糖，pH值為5.8～6.0MS鹽和white有機(jī)物的體積比為3:1。

本發(fā)明中所用MS鹽和white有機(jī)物是培養(yǎng)基中常用的兩種組分，其中MS鹽表示MS培養(yǎng)基中的大量、微量和鐵鹽部分，而white有機(jī)物表示white培養(yǎng)基中的有機(jī)物。

現(xiàn)有苦苣苔植物的組織培養(yǎng)方法一般分為初代誘導(dǎo)分化、叢生芽繼代增殖以及生根三個階段，而每一個階段都需要特定的培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而從愈傷、不定芽、叢生芽到最后的生根，完成無菌苗的快繁。但是三個不同的培養(yǎng)環(huán)節(jié)給苦苣苔科植物的快繁造成了繁瑣復(fù)雜的問題，本發(fā)明針對這一問題利用組織培養(yǎng)技術(shù)和原理，設(shè)計(jì)一種培養(yǎng)基，同時完成愈傷組織誘導(dǎo)、 分化及叢生芽增殖和生根的過程，即一步法快速獲得苦苣苔科植物無菌苗的方法。

作為優(yōu)選，步驟1為取苦苣苔科植物的外植體用酒精和升汞進(jìn)行滅菌。

進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟1為：

取苦苣苔科植株的外植體，用自來水沖洗干凈后，移入超凈工作臺，用75％酒精浸泡30～40s，無菌水清洗2次，然后用加2滴TWeen-20的0.1％HgCl₂溶液處理6～8min，無菌水清洗6～7次；將外植體置于無菌濾紙上吸干水分，待用。

在本發(fā)明中，所述苦苣苔科植物優(yōu)選為報(bào)春苦苣苔或小花苦苣苔，其中報(bào)春苦苣苔包括鐘冠報(bào)春苣苔(Primulina swinglei)、博白報(bào)春苣苔(Primulina bobaiensis)、鐘氏報(bào)春苣苔(Primulina zhongiana)；小花苦苣苔包括假密毛小花苣苔(Primulina pseudomollifolia)。而所選用的外植體優(yōu)選采用苦苣苔科植物的花梗和/或花蕾。

作為優(yōu)選，所述暗培養(yǎng)在20～25℃下培養(yǎng)，一般時間為2周。所述光培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)以及生根培養(yǎng)均優(yōu)選在20～25℃、光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時間14h/d下培養(yǎng)，三個階段的培養(yǎng)時間分別為3-4周、2周、2-3周。

本方法以4種苦苣苔植物的花梗和/或花蕾為外植體材料，利用本發(fā)明組織培養(yǎng)技術(shù)和原理，在一種培養(yǎng)基的前提下完成愈傷組織誘導(dǎo)、分化及叢生芽增殖和生根的過程，其中愈傷組織誘導(dǎo)及分化率高達(dá)92％，增殖系數(shù)約40～65，生根率95％以上，能夠在相對短的時間內(nèi)獲得大量鐘冠報(bào)春苣苔、博白報(bào)春苣苔、鐘氏報(bào)春苣苔、假密毛小花苣苔無菌苗，達(dá)到快速繁育的目的。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明選擇特定的一種培養(yǎng)基用于苦苣苔科植物三個階段的組織培養(yǎng)，通過一步法獲得了鐘冠報(bào)春、博白報(bào)春、鐘氏報(bào)春、假密毛小花苣苔4種苦苣苔科植物無菌苗，建立了簡單、高效的組培快繁體系。

附圖說明

圖1所示為鐘冠報(bào)春苣苔愈傷組織誘導(dǎo)及分化圖；

圖2所示為博白報(bào)春苣苔愈傷組織形成及分化圖；

圖3所示為鐘氏報(bào)春苣苔愈傷組織形成及分化圖；

圖4所示為假密毛小花苣苔愈傷組織形成及分化圖；

圖5所示為鐘冠報(bào)春苣苔叢生芽增殖圖；

圖6所示為博白報(bào)春苣苔叢生芽增殖圖；

圖7所示為鐘氏報(bào)春苣苔叢生芽增殖及芽苗生根圖；

圖8所示為假密毛小花苣苔叢生芽增殖圖；

圖9所示為鐘冠報(bào)春苣苔芽苗生根圖；

圖10所示為博白報(bào)春苣苔芽苗生根圖；

圖11所示為鐘氏報(bào)春苣苔芽苗生根圖；

圖12所示為假密毛小花苣苔芽苗生根圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種苦苣苔科植物一步成苗組培快繁方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述組培快繁方法已通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的組培快繁方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

以下就本發(fā)明所提供的一種苦苣苔科植物一步成苗組培快繁方法做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：本發(fā)明所述苦苣苔科植物組織培養(yǎng)方法

外植體滅菌：

取鐘冠報(bào)春、博白報(bào)春、鐘氏報(bào)春、假密毛小花苣苔4種苦苣苔科植物幼嫩花梗和(或)花蕾，用自來水沖洗干凈后，移入超凈工作臺，用75％酒精浸泡30～40s，無菌水沖洗2次，再用0.1％HgCl₂(加2滴TWeen-20)溶液處理6～8min，無菌水清洗6～7次。將花梗和(或)花蕾置于無菌濾紙上吸干水分后，切成0.5～1.0cm長的小段，待用。

愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化：

將已滅菌并處理好的花梗和(或)花蕾，接種于啟動培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，暗培養(yǎng)2周，然后進(jìn)行光培養(yǎng)(光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照 時間14h/d)。所用培養(yǎng)基為：MS鹽+white有機(jī)物+6-BA 0.3～0.8mg/L+NAA0.15～0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+植培靈2.5ml/L，其中培養(yǎng)基的蔗糖含量為25g/L，pH為5.8～6.0。培養(yǎng)3～4周后，獲得愈傷組織或分化的芽，誘導(dǎo)分化情況見圖1-4。

增殖培養(yǎng)：

將初代培養(yǎng)所得的芽塊分割成每塊帶1～2個芽的小塊，轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基上生長，所述的培養(yǎng)基仍為MS鹽+white有機(jī)物+6-BA 0.3～0.8mg/L+NAA0.15～0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+植培靈2.5ml/L，在光照1500～2000lx、14h/d，溫度25℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；生長2周后獲得長有叢生芽的有效苗，叢生芽增殖情況見圖5-8。

生根培養(yǎng)：

將上述培養(yǎng)所得的無菌健壯有效苗轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上同時進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基仍為：MS鹽+white有機(jī)物+6-BA 0.3～0.8mg/L+NAA0.15～0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+植培靈2.5ml/L，培養(yǎng)溫度25℃，光照1500～2000lx、14h/d。培養(yǎng)2-3周后，無菌芽苗開始生根，獲得完整植株，各報(bào)春苣苔生根情況見圖9-12。

實(shí)施例2：試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)對象：鐘冠報(bào)春、博白報(bào)春、鐘氏報(bào)春、假密毛小花苣苔4種苦苣苔科植物；

外植體：花梗和(或)花蕾；

方法：實(shí)施例1方法

結(jié)果見表1。

表1

由表1可以看出，本發(fā)明整個組培快繁工藝僅需要一種培養(yǎng)基，就達(dá)到了較高的愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、叢生芽增殖系數(shù)以及生根率，遠(yuǎn)比當(dāng)下需要多種培養(yǎng)基成分的組培方法更有優(yōu)勢。

以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。