本發(fā)明涉及河蜆的多倍體繁育方法，具體涉及河蜆三倍體純系高效育成方法。

背景技術(shù)：

河蜆，俗稱河蜆、黃蜆等，屬雙殼綱，廣泛分布于除南極洲外各大洲水域。殼厚而堅，外形圓形或近三角形。食用可補肝，亦為魚類、禽類的餌料，并可做為農(nóng)田肥料。河蜆3月齡(殼長1.1～1.2cm)達性成熟，雄雌異體(偶有雄雌同體)，分批成熟、分批產(chǎn)卵類型，體外受精。因河蜆三倍體的不育特征，使其在生長速度、抗病性、肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中，要獲得三倍體不育河蜆，最快捷有效的方法是通過四倍體河蜆與二倍體河蜆倍間回交獲得，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體河蜆純系。但在河蜆的遺傳育種中，到目前為止還未見三倍體河蜆高效育成的報道，更未見用全雄四倍體與二倍體母本回交的先例。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定、種群純度高達100%的河蜆三倍體純系高效育成方法。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

河蜆三倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到河蜆人工飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為10～20g/500g飼料，待用；

（2）投喂：在母蜆產(chǎn)卵前5～10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母蜆進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g母蜆投喂10～20g，下午6：00每100g母蜆投喂10～15g；至其卵發(fā)育成熟，然后，取公蜆放在一起，使其自然產(chǎn)卵受精，得受精卵，備用；

（3）熱休克處理：把步驟（2）的受精卵放入溫度為20～24℃恒溫水槽中，在一次卵裂前2～3min，把溫度快速升至39～42℃，保持3～5min；然后取出，放入正常孵育水中待用；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80～140mg/l，睪酮的濃度為20～80mg/l；

（5）取步驟（3）處理后的受精卵放入按步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10～30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至受精卵的胚體在擔輪幼體期之后脫膜，脫膜后進入面盤幼體期；

（6）取步驟（5）中面盤幼體，投喂氯米芬幼體料；配比量為每kg幼體料加10～15g氯米芬，投喂量為每萬只10～20g加有氯米芬的幼體料，直至結(jié)束浮游生活后沉入水底；從而獲得雄性河蜆四倍體純系；

（7）取步驟（6）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中對母本進行添加他莫昔芬飼料投喂，起到抑制DNA分裂和促雄性的雙重作用的同時，將受精卵第一次卵裂的時間推遲了3～5min，并提高所有受精卵第一次卵裂的同步程度（可達99%），為操作下一步提供時間保障和奠定染色體加倍基礎(chǔ)；2、采用短時間熱休克處理，不僅有效減少了熱休克過程對受精卵的破壞程度，提高受精卵的成活率；而且降低了操作難度和加壓成本；3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強化雄性轉(zhuǎn)化率；4、投喂氯米芬幼體料，有效保證雄性的轉(zhuǎn)化率；5、用純系的雄性四倍體與原有的雌性二倍體回交，有效保證了三倍體的純度。因而通過此方法，可獲得100%的三倍體純系，提高了三倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，更主要是對自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境無污染。

具體實施方式

現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。

實施例一

河蜆三倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到河蜆人工飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為15g/500g喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母蜆產(chǎn)卵前5天，按常規(guī)飼料投喂方法對母蜆進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g母蜆投喂10g，下午6：00每100g母蜆投喂10g；至其卵發(fā)育成熟，然后，取公蜆放在一起，使其自然產(chǎn)卵受精，得受精卵，備用；

（3）熱休克處理：把步驟（2）的受精卵放入溫度為20℃恒溫水槽中，在一次卵裂前2min，把溫度快速升至40℃，保持5min；然后取出，放入正常孵育水中待用；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為120mg/l，睪酮的濃度為60mg/l；

（5）取步驟（3）處理后的受精卵放入按步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至受精卵的胚體在擔輪幼體期之后脫膜，脫膜后進入面盤幼體期；

（6）取步驟（5）中的面盤幼體，投喂氯米芬幼體料；配比量為每kg幼體料加15g，投喂量為每萬只20g氯米芬的幼體料，直至結(jié)束浮游生活后沉入水底；從而獲得雄性河蜆四倍體純系。

（7）取步驟（6）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

實施例二

河蜆三倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到河蜆人工飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為20g/500g喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母蜆產(chǎn)卵前10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母蜆進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g母蜆投喂20g，下午6：00每100g母蜆投喂15g；至其卵發(fā)育成熟，然后，取公蜆放在一起，使其自然產(chǎn)卵受精，得受精卵，備用；

（3）熱休克處理：把步驟（2）的受精卵放入溫度為24℃恒溫水槽中，在一次卵裂前2min，把溫度快速升至42℃，保持3min；然后取出，放入正常孵育水中待用；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為140mg/l，睪酮的濃度為80mg/l；

（5）取步驟（3）處理后的受精卵放入按步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至受精卵的胚體在擔輪幼體期之后脫膜，脫膜后進入面盤幼體期；

（6）取步驟（5）中幼體，投喂氯米芬幼體料；配比量為每kg幼體料加10g，投喂量為每萬只10g加有氯米芬的幼體料，直至結(jié)束浮游生活后沉入水底；從而獲得雄性河蜆四倍體純系。

（7）取步驟（6）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式及結(jié)果統(tǒng)計。

附：河蜆三倍體育成結(jié)果統(tǒng)計

注：上述結(jié)果是在河蜆產(chǎn)卵前10天投喂他莫昔芬，一次卵裂前2min熱休克處理3分鐘，雌激素抑制劑常溫浸泡10s，每萬尾投喂氯米芬0.1g所取得的結(jié)果。