本發(fā)明涉及一種超低溫貯藏白芷種子的方法，屬于中藥材種子貯藏領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白芷為傘形科植物白芷(Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f)或杭白芷(Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan)的干燥根，因初生根桿為芷，色白，故名白芷，以根入藥，其性溫，氣芳香，味辛、微苦，歸胃、結(jié)腸、肺經(jīng)，具有散風(fēng)除濕、通竅鎮(zhèn)痛、消腫排膿等功效，可藥食兩用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，白芷組成的成方制劑有600余種，在中藥材中占有重要地位。歷代名方如九味羌活湯、藿香正氣散等皆有其入藥。白芷為川產(chǎn)道地藥材，主產(chǎn)于四川遂寧，其產(chǎn)量高，占全國白芷總產(chǎn)量70％以上，除供應(yīng)國內(nèi)市場外，還遠(yuǎn)銷香港、東南亞、日本及歐美等地。
白芷以種子繁殖為主，多采用育苗移栽，在常規(guī)保存手段下，隔年陳種子發(fā)芽率不高，而制約種子發(fā)芽率的原因尚不清楚。一般情況下，白芷種子壽命約1年，種子優(yōu)劣對(duì)田間出苗率、產(chǎn)量、品質(zhì)有重大影響，從而影響藥材種植戶的收益。因此，白芷藥材的栽培種子是關(guān)鍵。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種超低溫貯藏白芷種子的方法，本發(fā)明對(duì)白芷種子的儲(chǔ)藏時(shí)間長。
本發(fā)明提供的超低溫貯藏白芷種子的方法，包括如下步驟：1)將白芷種子干燥，得到干燥的種子；
2)將所述干燥的種子密封包裝，冷凍儲(chǔ)藏，得到冷凍的種子；
3)對(duì)所述冷凍的種子解凍儲(chǔ)藏。
上述的方法中，步驟2)中還包括將所述干燥的種子與防凍保護(hù)劑混合的步驟。
上述的方法中，所述干燥的種子與所述防凍保護(hù)劑的質(zhì)量比為100：5～10，具體可為100：5或100：10；
所述防凍保護(hù)劑包括二甲基亞砜、甘油和聚乙二醇(簡稱PEG)中的至少一種；所述聚乙二醇的分子量具體可為400。
上述的方法中，所述干燥的種子的含水量可為5～10％，具體可為5.34％、7.70％、9.43％或5.34～9.43％，最優(yōu)選9.43％；具體的干燥過程為采用105℃低恒溫，烘干4h，獲得白芷種子含水量，種子放于以硅膠為干燥劑的干燥器中，經(jīng)不同時(shí)間干燥，種子水分調(diào)節(jié)至所需的含水量。
本發(fā)明中，所述干燥的種子的含水量按照質(zhì)量含水量計(jì)。
上述的方法中，包裝所述干燥的種子的材料包括塑料離心管、塑料自封袋和牛皮紙中的至少一種；
包裝所述干燥的種子的材料的厚度可為0.1～1mm。
本發(fā)明中，所述干燥的種子密閉包裝，采用的所述塑料離心管為帶蓋的離心管；塑料自封袋的厚度具體可為0.1mm。
上述的方法中，所述冷凍儲(chǔ)藏包括快速冷凍方式、慢速冷凍方式和緩速冷凍方式中的至少一種；
所述快速冷凍方式為在液氮中冷凍0～60d；
所述慢速冷凍方式為在1～10℃冷凍0.2～1h，然后在-25～-15℃冷凍4～5h，最后放置于所述液氮中冷凍0～60d；具體可為在5℃冷凍0.5h，然后在-20℃冷凍4h，最后放置于所述液氮中冷凍0～60d；
所述緩速冷凍方式為在1～10℃冷凍0.2～1h，然后在-25～-15℃冷凍0.5～1h，最后放置于所述液氮中冷凍0～60d；具體可為在5℃冷凍0.5h，然后在-20℃冷凍1h，最后放置于所述液氮中冷凍0～60d。
本發(fā)明中，所述液氮環(huán)境中的溫度指的是-196℃。
上述的方法中，所述解凍儲(chǔ)藏包括快速解凍方式、慢速解凍方式和緩速解凍方式中的至少一種；
所述快速解凍方式為從所述液氮中移至30～50℃中解凍；具體可為從所述液態(tài)氮中移至40℃溫水解凍；
所述慢速解凍方式為從所述液氮中依次移至-25～-15℃解凍0.5～2h、3～8℃解凍；具體可為從所述液氮中依次移至-20℃解凍1h、4℃解凍；
所述緩速解凍方式為從所述液氮中移至15～25℃解凍。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明對(duì)白芷種子的儲(chǔ)藏方法簡單易行；儲(chǔ)藏的時(shí)間長；對(duì)白芷種子發(fā)芽率、電導(dǎo)率、過氧化物酶(POD)活性和可溶性蛋白質(zhì)含量影響小。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中，供試白芷(Angelica dahurica)種子來源于四川遂寧市永興鎮(zhèn)中脊村，2014年采收；
含水量的測定，參照文章(楊枝中，蔣運(yùn)斌，穆向榮等.川白芷種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究[J].種子，2013，3(12):119～122.)中的方法；具體過程為采用105℃低恒溫，烘干4h，獲得白芷種子含水量；種子放于以硅膠為干燥劑的干燥器中，經(jīng)不同時(shí)間干燥，種子水分調(diào)節(jié)至所需的含水量。
實(shí)施例1、白芷種子的儲(chǔ)藏
1)白芷種子干燥，水分調(diào)節(jié)至5.34％、7.70％和9.43％三種不同含水量，然后將不同含水量的種子置密閉鋁盒中備用。
2)將上述1)中不同含水量的白芷種子，分別與二甲基亞砜、甘油、聚乙二醇400(PEG400)作為防凍保護(hù)劑混合(白芷種子與防凍保護(hù)劑的質(zhì)量比如表1所示)，然后均分別裝在塑料離心管(帶蓋)、塑料自封袋(0.1mm厚)中，分別采用下述三種方式冷凍儲(chǔ)藏：
快速冷凍：液態(tài)氮；
慢速冷凍：冰箱(5℃，0.5h)-冰箱(-20℃，4h)-液態(tài)氮；
緩速冷凍：冰箱(5℃，0.5h)-冰箱(-20℃，1h)-液態(tài)氮。
3)將上述2)中冷凍的種子，分別采用下述三種方式解凍儲(chǔ)藏：
快速解凍：液態(tài)氮移至40℃溫水解凍；
慢速解凍：液態(tài)氮-冰箱(-20℃，1h)-冰箱(4℃)解凍；
緩速解凍：液態(tài)氮移至20℃環(huán)境解凍。
上述2)-3)中在液態(tài)氮中保存的時(shí)間均為7d、30d或60d，具體如表1中所示。
上述條件采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了最佳方案的優(yōu)化，得到最佳的種子超低溫儲(chǔ)存組合；選用L18(21+37)正交表。正交試驗(yàn)的各因素及其水平見表1。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行18次試驗(yàn)，試驗(yàn)以4℃環(huán)境下未進(jìn)行超低溫貯藏的種子為對(duì)照。
表1正交試驗(yàn)欄目表
由表1中可知，本發(fā)明選用的包裝材料為塑料離心管和0.1mm塑料自封袋，種子含水量設(shè)置3個(gè)水平分別是5.34％、7.70％和9.43％，保護(hù)劑二甲基亞砜、甘油、PEG均分別設(shè)置0％、5％和10％3個(gè)水平，冷凍方式、解凍方式均分為快、慢、緩3個(gè)檔次，冷藏時(shí)間設(shè)置7天、30天、60天3個(gè)水平。
經(jīng)上述的儲(chǔ)藏方法后，白芷種子活性測定實(shí)驗(yàn)按照如下1-5的方法進(jìn)行測定：
1、種子發(fā)芽試驗(yàn)
培養(yǎng)箱設(shè)置25℃/18℃晝夜變溫，光照12h，每份材料每種處理隨機(jī)數(shù)取100粒種子，3次重復(fù)。
發(fā)芽率(GR)(％)＝n/N×100％(n為最終發(fā)芽數(shù)；N為供試種子數(shù))。
待突破種皮的胚軸長度達(dá)到真種子自身長度時(shí)計(jì)為發(fā)芽，并作為初次計(jì)數(shù)時(shí)間。種子萌發(fā)達(dá)到最高，以后再無新萌發(fā)種子的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。
2、電導(dǎo)率測定
隨機(jī)數(shù)取白芷種子50粒凈種子，3次重復(fù)。用離子水沖洗3遍，用濾紙吸干表面水分，將種子放入250mL燒杯中，加入100mL去離子水，測定初始電導(dǎo)率；用保鮮膜將燒杯封口，室溫條件下靜置24h后測定種子浸出液電導(dǎo)率。
種子浸出液電導(dǎo)率[μs/(cm*g)]＝(種子浸出液電導(dǎo)率-初始電導(dǎo)率)/種子樣品質(zhì)量。
3、過氧化物酶(POD)活性
取白芷種子0.5g，置于研缽中，加入5ml 0.02mol/L KH2PO4研磨成勻漿，4000r/min，離心15min，收集上清液保存在冰上。所得殘?jiān)儆?ml 0.02mol/L KH2PO4提取一次，合并兩次上清液，酶提取液10ml冰浴研磨，在4℃1200r/min離心15min，上清液為酶粗提液，在0～4℃下保存。
取酶提取液0.5ml(視酶活性大小稀釋原液)，加POD反應(yīng)液3ml，內(nèi)含0.08％H2O2，0.1％愈創(chuàng)木酚的PBS(pH 7.0)，立即于470nm處比色，每30s記錄一次讀數(shù)，記錄讀數(shù)3min，取呈線部分計(jì)算OD值變化，酶活性單位以△OD 470/min·g表示。
反應(yīng)混合液配置100mmol/L pH 6.0磷酸緩沖液50ml，加入愈創(chuàng)木酚28ul，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30％過氧化氫19ul，混合均勻，保存于冰箱中，備用。
4、可溶性蛋白質(zhì)含量測定
參照高俊鳳的方法[8]測定白芷種子中可溶性蛋白質(zhì)含量，略有改動(dòng)。
取白芷種子0.5g，置于研缽中用pH 7.0磷酸緩沖液研磨成勻漿后，定容25ml，10000r/min離心10min，取上清1ml(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)于試管中，備用。
吸取樣品提取液0.1ml，放入具塞刻度試管中(設(shè)兩個(gè)重復(fù)管)，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y＝0.0608x+0.2218(R2＝0.9073)查得蛋白質(zhì)含量。
蛋白質(zhì)含量(％)＝C×V2×V0×100/(m×V1)
式中：C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)濃度，g/mL
V0——樣品溶液的總體積，mL
V1——測定時(shí)加樣量，mL
V2——測定時(shí)定容體積，mL
m——樣品的質(zhì)量，g
5、數(shù)據(jù)分析處理
采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
上述1-5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(1)-(4)所示。
(1)超低溫保存對(duì)白芷種子發(fā)芽的影響
表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L18(21+37)和種子發(fā)芽率
表2中，A:包裝材料；B:含水量；C:二甲基亞砜；D:甘油；E:PEG；F:冷凍方式；G:解凍方式；H:貯藏時(shí)間；M:均值；R：極差。
表3發(fā)芽試驗(yàn)方差分析表
表3中，MS:偏差平方和；df：自由度。
表4白芷種子超低溫貯藏重要影響因素對(duì)照表
表2中應(yīng)用正交設(shè)計(jì)L18(21+37)，因素A、B、C、D、E、F、G和H分別為包裝材料、含水量、二甲基亞砜、甘油、PEG400、冷凍方式、解凍方式和貯藏時(shí)間，均按照實(shí)施例1中表1中試驗(yàn)條件進(jìn)行。A因素為2個(gè)水平，其余因素選擇3個(gè)水平，每個(gè)水平作3次重復(fù)，結(jié)果如表2所示。
從表2中可以看出，在各因素中對(duì)白芷種子發(fā)芽影響最大的是冷凍方式，其次是解凍方式。8個(gè)因素影響白芷種子發(fā)芽率的順序是：F>G>A>D>C>H>B>E。方差分析表明，冷凍方式、解凍方式能極顯著影響白芷種子發(fā)芽，包裝材料能顯著影響種子發(fā)芽，其余5個(gè)因素對(duì)種子發(fā)芽的影響不顯著(如表3所示)，但有同一因素的不同水平之間是有差異的。另外，包裝材料采用塑料離心管時(shí)白芷種子的發(fā)芽率較高，為43.19％?？焖倮鋬龊吐倮鋬龇謩e為種子發(fā)芽率最高(52.45％)和最低(32.95％)的兩種冷凍方式，極差為19.50％。在解凍方式中慢速解凍時(shí)種子發(fā)芽率最高，為45.5％，快速解凍時(shí)發(fā)芽率最低，為39.28％(如表4所示)。
(2)超低溫保存對(duì)白芷種子電導(dǎo)率的影響
對(duì)應(yīng)用正交設(shè)計(jì)處理的白芷種子進(jìn)行電導(dǎo)率測定，一般情況下，種子活力越低，電導(dǎo)率越高。從表2可以看出，白芷種子在超低溫保存過程中，各因素中對(duì)浸出液電導(dǎo)率影響最大的是冷凍方式，其次是解凍方式。8個(gè)因素影響白芷種子電導(dǎo)率的順序依次是：F>G>E>D>C>A>H>B。方差分析表明，冷凍方式能極顯著影響白芷種子浸出液電導(dǎo)率，PEG、解凍方式對(duì)白芷種子浸出液電導(dǎo)率的影響呈顯著差異，其它7個(gè)因子對(duì)白芷種子浸出液電導(dǎo)率的影響不顯著(見表3)。另外，PEG的體積分?jǐn)?shù)為10％時(shí)浸出液電導(dǎo)率在3個(gè)處理水平中最低，為17.79μs/cm*g。在3種冷凍方式中，快速冷凍的效果最好，浸出液電導(dǎo)率最低，為15.73μs/cm*g，慢速冷凍的效果最差，浸出液電導(dǎo)率最高，為20.52μs/cm*g，二者極差為4.79μs/cm*g。慢速解凍在3種解凍方式中效果最好，浸出液電導(dǎo)率低于對(duì)照(見表4)。
(3)超低溫保存對(duì)過氧化物酶(POD)活性的影響
過氧化物酶是細(xì)胞內(nèi)很重要的抗逆酶之一，用POD活性來衡量種子活力，高活力種子抗逆性酶活力強(qiáng)。由表2可知，各因素對(duì)白芷種子POD活性影響最大的是冷凍方式，其次是解凍方式。8個(gè)因素影響白芷種子POD活性的順序依次是：F>G>C>A>D>E>H>B。方差分析表明，冷凍方式能極顯著影響POD活性，其它7個(gè)因子對(duì)POD活性的影響不顯著。另外，在3冷凍方式中，快速冷凍的效果最好，POD活性最高16.59U·g-1min-1，慢速冷凍的效果最差，POD活性最低13.44U·g-1min-1，低于對(duì)照14.33U·g-1min-1。
(4)超低溫保存對(duì)可溶性蛋白的影響
種子內(nèi)可溶性蛋白大多是參與各種代謝的酶類，其含量高低反映了植物體內(nèi)各類酶的活性水平，與種子活力具有一定相關(guān)性，種子活力降低其可溶性蛋白含量下降。由表2可知，各因素對(duì)白芷種子可溶性蛋白含量影響最大的是冷凍方式，其次是PEG。8個(gè)因素影響白芷種子可溶性蛋白含量的順序依次是：F>E>G>A>C>B>D＝H。方差分析表明，冷凍方式和解凍方式能極顯著影響可溶性蛋白含量，PEG對(duì)可溶性蛋白含量呈顯著差異，其它5個(gè)因子對(duì)可溶性蛋白含量的影響不顯著。另外，隨著PEG的體積分?jǐn)?shù)的增加可溶性蛋白含量不斷上升，但均低于對(duì)照。在3種冷凍方式中，快速冷凍的效果最好，可溶性蛋白含量最高，為6.92mg/g，高于對(duì)照的5.62mg/g，慢速冷凍方式時(shí)可溶性蛋白最低，為4.09mg/g。慢速解凍在3種解凍方式中效果最好可溶性蛋白含量最高，為5.78mg/g，快速解凍時(shí)可溶性蛋白最低，為5.11mg/g。
上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明白芷種子能在超低溫方式進(jìn)行貯藏，在9.43％含水量的白芷種子用塑料離心管作為包裝材料、在10％PEG防凍保護(hù)劑的保護(hù)下，采用快速方式冷凍，經(jīng)液氮超低溫保存后，以慢速方式解凍，能有效地降低種子的電導(dǎo)率，提高種子的發(fā)芽率、POD活性和可溶性蛋白含量，延緩種子衰老。本發(fā)明的最佳處理組合為：塑料離心管+9.43％含水量+10％PEG+快速冷凍+慢速解凍。