本發(fā)明屬栽培植物良種苗木技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人類栽培的植物(農(nóng)作物、果樹、林木、花卉等)在其長期無性繁殖過程中，大多感染并積累了多種病毒。世界各地報(bào)道的蘋果病毒有39種，梨病毒23種，葡萄病毒43種、草莓病毒25種、桃病毒39種、李病毒28種、甜櫻桃病毒36種、酸櫻桃病毒21種、杏病毒19種、柑桔病毒20種、還有香蕉病毒、馬鈴薯病毒，郁金香病毒、唐菖蒲病毒、無花果病毒等。這些病毒在植物細(xì)胞內(nèi)干擾了正常的生理代謝活動(dòng)，引起植物體生長減弱，早衰，植株矮化，葉片變色、卷曲、皺縮、黃化，果實(shí)畸形，變小，不著色，含糖量降低，落花、落果，使栽培植物產(chǎn)量減產(chǎn)20％-100％，給人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在現(xiàn)代高效優(yōu)質(zhì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中，栽培植物病毒病已引起全世界的高度重視。七十年代以前人們發(fā)現(xiàn)把栽培植物的枝條放置在高溫條件下進(jìn)行熱處理，可使部分病毒鈍化，暫時(shí)失去生物活性，能降低病毒病對(duì)植物體的危害程度。但這種熱處理方法并沒有徹底從植物體內(nèi)清除病毒，經(jīng)過一個(gè)較長時(shí)間后病毒又會(huì)在植物體內(nèi)重新蔓延。特別是對(duì)那些多年生植物來說，這種熱處理方法效果不佳。以后人們又發(fā)現(xiàn)病毒在植物體內(nèi)分布是不均勻的。植物的莖尖和根尖的分生組織區(qū)和伸長區(qū)這一微小區(qū)域內(nèi)沒有病毒。于是人們應(yīng)用植物組織培養(yǎng)方法，切取0.2-0.5毫米無維管束組織的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了脫病毒的苗木。但是這種莖尖抗病毒方法切取的莖尖很小需要在顯微解剖鏡下進(jìn)行工作，具體操作十分困難，莖尖培養(yǎng)成活率、脫毒率也很低。進(jìn)入九十年代后，人們又將熱處理方法與莖尖培養(yǎng)方法結(jié)合起來進(jìn)行抗病毒。先將要抗毒的植物莖尖(如盆栽苗木或試管苗)放置在35-40℃條件熱處理1個(gè)多月，在高溫下病毒被鈍化，使其在植物體內(nèi)的繁殖傳播速度大減。在這一高溫環(huán)境中長出的新植株莖尖很可能抗掉病毒，可切取較長的莖尖1-3毫米進(jìn)行培養(yǎng)，能獲得抗病毒苗木。目前生產(chǎn)中培育抗病毒良種苗木采用的是上述這種方法。在實(shí)際生產(chǎn)操作中切取較大的莖尖(如3毫米長)培養(yǎng)成活率高，但脫毒率很低；切取較小的莖尖(1毫米以內(nèi))抗毒率較高，但成活率很低，而且培養(yǎng)成活的抗毒試管苗還有可能發(fā)生變異，改變優(yōu)良品種的性狀。所以，在實(shí)際生產(chǎn)中這些問題始終困擾著人們培育抗病毒良種苗木的正常工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的就是針對(duì)上述情況，采用完全無光黑暗條件對(duì)苗木進(jìn)行熱處理培養(yǎng)，成倍的擴(kuò)大了莖尖無病毒區(qū)域，再切取莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，即能夠完全抗除病毒，提高抗毒率，又能夠切取較長的莖尖，提高莖尖培養(yǎng)成活率，防止發(fā)生良種苗木的變異。為實(shí)際生產(chǎn)提供了一種新的高效率培育抗病毒良種苗木的方法。

本發(fā)明一種培育抗病毒良種苗木的方法是：先將要抗病毒的苗木采用植物組織培養(yǎng)的方法，把它們培養(yǎng)成試管苗，最好是在試管內(nèi)生根階段的苗或叢生芽狀階段的苗。把這種生長旺盛的試管苗放置在完全無光黑暗的條件下進(jìn)行熱處理培養(yǎng)45-60天。熱處理溫度為35-40℃。或者將要抗病毒的盆栽苗木(最好是剛經(jīng)過休眠階段的苗木)放置在完全無光黑暗的條件下進(jìn)行熱處理培養(yǎng)45-50天，熱處理溫度為35-40℃。苗木經(jīng)過45-60天的無光黑暗熱處理以后，試管苗莖尖能長出1-4厘米長的淡黃色的幾乎無葉片的新生莖尖；盆栽苗木能長出5-10厘米的淡黃色的頂端幾乎無葉片的新生莖尖。對(duì)這些新生莖尖進(jìn)行縱向石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)：試管苗新生莖尖的分生組織區(qū)和伸長區(qū)，這些無微管束區(qū)長度可達(dá)5-10毫米以上；盆栽苗木新生莖尖的分生區(qū)和伸長區(qū)(無微管束區(qū))長度可達(dá)10-15毫米以上。病毒在植物體內(nèi)主要就是通過微管束來傳播的，微管束能將下部成熟植物體內(nèi)的病毒傳送到微管束區(qū)與伸長區(qū)交界處，莖尖分生區(qū)和伸長區(qū)無微管束，所以莖尖分生區(qū)和伸長區(qū)屬于植物體上無病毒區(qū)域。通過無光黑暗熱處理培養(yǎng)，阻止了植物體內(nèi)正常的光形態(tài)建成過程，使莖尖的分生區(qū)和伸長區(qū)的細(xì)胞分化成微管束的過程被減慢，所以分生區(qū)和伸長區(qū)這一無病毒區(qū)域被擴(kuò)大。再加上35-40℃的長期熱處理，使植物體內(nèi)的病毒被鈍化，暫時(shí)失去植物活性，不能繁殖和快速傳播。所以經(jīng)過無光黑暗條件下熱處理苗木的新生莖尖，無病毒區(qū)域被擴(kuò)大。本發(fā)明的特點(diǎn)在于無光黑暗條件下長期熱處理苗木，能極大地?cái)U(kuò)大新生莖尖的無病毒區(qū)域。

本發(fā)明一種培育抗病毒良種苗木的方法是：第一條途徑，按照植物組織培養(yǎng)方法，在無菌條件下切取經(jīng)過無光黑暗熱處理的新生莖尖長5-8毫米，接種到新配制的莖尖培養(yǎng)基上。在光照強(qiáng)度1500-3000勒克斯，溫度25-28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使莖尖生長，分化。經(jīng)過幾代反復(fù)擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，對(duì)每一個(gè)莖尖的無性系苗木進(jìn)行病毒檢測。采用指示植物檢測法、酶聯(lián)免疫法，電子顯微鏡檢測法，確定這一無性系苗木完全抗病毒后，應(yīng)用植物組培快速繁殖方法對(duì)抗病毒良種苗木進(jìn)行繁殖，為生產(chǎn)提供大批量抗病毒良種苗木。第二條途徑，經(jīng)過無光黑暗熱處理的盆栽苗木，可切取10-12毫米長的莖尖，嫁接到事先準(zhǔn)備好的無病毒砧木上，每一個(gè)莖尖嫁接一個(gè)砧木。當(dāng)莖尖接穗成活生長后，對(duì)每一個(gè)莖尖苗木進(jìn)行病毒檢測，確定這一莖尖苗木無病毒后，以這一抗病毒良種苗木為母體，剪取其新枝條作接穗，進(jìn)行大量嫁接繁殖抗病毒良種苗木。本發(fā)明的特點(diǎn)在于切取5-8毫米長的經(jīng)過無光黑暗熱處理試管苗的莖尖，通過組培快速繁殖方法大量繁殖抗病毒良種苗木；切取10-12毫米長的經(jīng)過無光黑暗熱處理的盆栽苗木莖尖，通過嫁接方法大量繁殖抗病毒良種苗木。

采用本發(fā)明方法培育抗病毒良種苗木，具有操作方法簡單、易行、抗病毒率和成活率很高等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用效果良好。用本發(fā)明方法抗葡萄扇葉病毒、卷葉病毒、莖痘病毒，栓皮病毒，試管苗經(jīng)過無光黑暗熱處理培養(yǎng)后，可直接切取8毫米長的莖尖，不需要在顯微解剖鏡下操作切取0.3毫米長的莖尖，所以本發(fā)明方法操作簡單易行。這樣8毫米長的莖尖接種到培養(yǎng)基上成活率都在100％。用指示植物檢測病毒，結(jié)果抗病毒率為100％。因此本發(fā)明方法抗病毒率高，成活率高。培育出來的抗病毒葡萄良種苗木在生產(chǎn)中栽培結(jié)果后，葡萄果粒增大，甜度明顯提高，結(jié)果產(chǎn)量增產(chǎn)70-80％，經(jīng)濟(jì)效益顯著增加。

實(shí)施例1：

冬季將經(jīng)過休眠期的感染有梨石痘病毒的盆栽庫爾勒香梨，放置在完全無光黑暗條件下，在38℃±1℃的環(huán)境中熱處理培養(yǎng)60天。要定期給盆栽香梨澆水，防止因缺水造成苗木死亡。同時(shí)在溫室中，播種無病毒的杜梨種子，培養(yǎng)杜梨營養(yǎng)缽苗作嫁接砧木。切取無光黑暗熱處理的香梨莖尖10毫米長，操作時(shí)要注意刀具器械不要與莖尖下部組織相接觸，以免交叉感染病毒。采用劈接法將香梨莖尖嫁接到杜梨砧木上，2周后香梨莖尖開始萌動(dòng)、生長，莖尖嫁接成活率為80％，每一個(gè)莖尖嫁接一個(gè)砧木，并按順序編號(hào)。春夏季香梨莖尖嫁接苗長大后進(jìn)行病毒檢測，可采用血清學(xué)快速檢測法，檢測結(jié)果脫除梨石痘病毒的苗木為95％。將培育得到的無毒梨良種苗木作為采穗母株，采其枝芽作接穗，大量繁殖抗毒香梨苗木，為生產(chǎn)栽培提供無毒良種苗木。

實(shí)施例2：

如大棗感染病毒后，大棗變小，葉片出現(xiàn)明顯缺綠斑塊，落花落果嚴(yán)重，產(chǎn)量大幅下降。將感染病毒的大棗，通過植物組織培養(yǎng)方法，培養(yǎng)出試管叢生芽。將這種哈密大棗試管苗放置在完全無光黑暗的條件下，在38℃±0.5℃環(huán)境中熱處理培養(yǎng)50天。這時(shí)候大棗試管苗重新生長出2-3厘米長的淡黃色無葉片莖尖。在無菌室的凈化工作臺(tái)上，直接切取8毫米長的莖尖，操作時(shí)刀具器械不要接觸莖尖下部組織，防止病毒交叉感染新莖尖組織。將每一個(gè)莖尖分別接種到一個(gè)三角瓶中的新培養(yǎng)基中，并對(duì)每一個(gè)三角瓶中的莖尖進(jìn)行編號(hào)。莖尖培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基+1.0毫克/升的激動(dòng)素+1.0毫克/升的6-基氨基嘌呤+0.02毫克/升萘乙酸。在光照強(qiáng)度1500-3000勒克斯，溫度25-30℃條件下，培養(yǎng)1周莖尖開始萌動(dòng)、生長，莖尖培養(yǎng)成活率為100％。經(jīng)過幾代的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，每個(gè)莖尖可以獲得許多試管叢生芽。采用酶聯(lián)免疫法對(duì)試管苗進(jìn)行病毒檢測，結(jié)果脫病毒率為100％。然后通過植物組培快速繁殖方法，大批量地生產(chǎn)抗病毒良種棗苗，為生產(chǎn)栽培提供無毒良種苗木。