本發(fā)明涉及用于運輸和保存離體生物樣品的裝置和用于保存生物樣品的相應(yīng)方法，所述裝置包括用于容納所述生物樣品的腔室和用于保持腔室內(nèi)溫度低于裝置外溫度的冷卻裝置，所述腔室由絕熱材料制成的壁界定。

本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的裝置用于運輸和保存離體生物樣品，并隨后在活的人或動物中移植或用于隨后實驗室研究的用途。

背景技術(shù)：

在本發(fā)明中，“離體生物樣品”的概念涉及可以被運輸用于隨后在活的人或動物中進行移植或用于隨后實驗室研究的器官或組織。

例如，在移植領(lǐng)域，已知缺血/再灌注(i/r)綜合征是原發(fā)性移植物功能障礙(pgd)和原發(fā)性移植物衰竭(pgf)的主要原因之一，在后一種情況中需要再一次的移植。盡管在過去幾十年在外科技術(shù)上取得進展，供體器官在運輸直到植入接受者期間(冷缺血時間)，移植物經(jīng)受的損傷仍然是尚待解決的主要社會和臨床相關(guān)問題。在移植的器官中，pgf的發(fā)生率為5-10％，pgd的發(fā)生率為20-30％。這一切都不利地導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量差、再次移植的需要以及移植器官的可用性方面的更多問題。

從供體取出到植入接受者的時間內(nèi)，有不同的方法存儲移植物。在動態(tài)正常體溫保存的情況下，在整個保持期間盡可能最大程度模擬移植物的體內(nèi)環(huán)境。為此，避免了體溫過低，并且提供氧氣進入移植物以防止缺氧的入口，和用于廢物出口的儲存器。

在靜態(tài)正常體溫保存中(這是常規(guī)的保存方法)，在供體移植物植入接受者之前，供體的一種或多種器官和組織受到固有缺血時間的影響。這種情況下，用于保存器官和組織的方法必須滿足以下要求：從移植物中去除血液并通過在4℃下用溶液灌注移植物的方式快速冷卻移植物，用冰覆蓋移植物以確保冷條件(2-6℃)和缺血條件。因此，在冷缺血期間，即由于在冷條件下缺乏供血和氧氣輸送而導(dǎo)致的移植物經(jīng)受的損傷降低。

從器官從供體中取出時，將移植物置于冷卻器中，浸入保存溶液中，通常保持在4℃，直到植入接受者?，F(xiàn)有技術(shù)中最廣泛使用的溶液是威斯康星大學(xué)的溶液，以下稱uw溶液。

在冷卻器運輸期間直到植入接受者(冷缺血時間，通常不會少于6小時)，移植物經(jīng)受的損傷是關(guān)鍵因素。該因素是造成pgd和pgf的原因，并對術(shù)后結(jié)果、患者的生活質(zhì)量和生存產(chǎn)生負面影響。已知器官在冷卻器中的時間越長，將被移植的移植物的活力越低。移植物的冷缺血階段經(jīng)受的損失是大量器官(35％)鑒于其病理狀況被認為不適合移植的主要原因(來自老年人的腎移植物、糖尿病和/或高血壓供體、脂肪肝移植物等)。這些器官在被植入接受者之前非常容易經(jīng)受運輸期間的損傷，并且具有較高的經(jīng)歷pgd和pgf的風險。因此，它們不適于移植。這些觀察結(jié)果表明，需要找到替代方案來減少移植物在植入接受者之前在冷缺血期間經(jīng)受的損傷。

在保存溶液中存在的大多數(shù)成分的目的是為了在植入接受者之前，在運輸期間的冷卻器中的冷缺血條件下保護移植物，而并不進入移植物，如果進入移植物，它們不會以最佳濃度達到作用位點以保護移植物。實際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當從這種保存溶液中去除一些成分時，術(shù)后和移植后結(jié)果與沒有去除它們時一樣。

專利文件wo2007/143715a2涉及應(yīng)用超聲波以允許向傷口遞送氧氣并幫助傷口愈合。例如，該專利文件非常簡要地公開了在從供體取出器官后保存器官的裝置。為此，將器官置于供應(yīng)有氧氣過飽和的氣體或液體的容器中。這是動態(tài)保存系統(tǒng)，因為其中包含的氧氣或用氧氣飽和的液體溶液以受控的流動從氧氣儲存器逐漸進入容器，并且逐漸去除廢物。將器官容器置于半剛性容器內(nèi)。外部的容器進一步在容器上包含用于引導(dǎo)超聲波的超聲波系統(tǒng)。在內(nèi)部容器和外部容器之間沒有傳遞超聲波的裝置，因此該系統(tǒng)不能像為傷口愈合的目的而在傷口上直接應(yīng)用超聲波這樣有效。

還已知表明應(yīng)用超聲波有助于通過組織例如皮膚將藥物和物質(zhì)遞送至血液的研究。然而，在所述研究中，超聲波是在體內(nèi)應(yīng)用的，即在血液存在下。專利文件4,767,402a涉及通過應(yīng)用超聲波的方式進行透皮藥物遞送的領(lǐng)域，也涉及與該用途有關(guān)的風險。該專利文件特別建議由于與皮膚溫度升高相關(guān)的風險以及該技術(shù)可能引起的損害而不要長期使用超聲波。同一專利文件還公開了超聲波通過空氣傳播差，因此其優(yōu)選的應(yīng)用需要液體介質(zhì)。因此，由于以下提及的因素，不建議對器官和組織保存應(yīng)用超聲波：組織的局部加熱、難以滲透相當?shù)慕M織或器官厚度，以及在氣體介質(zhì)中的傳播困難。

專利文件us5,267,985a公開了通過以兩個或更多不同頻率的超聲波的方式促進物質(zhì)擴散至材料或組織的局部區(qū)域的方法和儀器。該專利文件還公開了當應(yīng)用超聲波時，局部溫度升高對于幫助增加待擴散物質(zhì)的滲透是有利的。

文章(senwang等，medialhypothesis，74，2010；147-149)建議在體內(nèi)以中等強度(0.3-1.2w/cm²)應(yīng)用超聲波以破壞供體器官的特定區(qū)域，使得僅有干細胞被激活且器官可以再生，形成可以與接受者更加相容的雜合器官。

專利文件wo2005/013799a1公開了在缺血時間之后，基于再灌注期間在體內(nèi)應(yīng)用超聲波，即血液供應(yīng)進入組織的方法。僅在短時間間隔內(nèi)(不超過15分鐘)應(yīng)用超聲波以有利于血液和氧氣進入組織，并減少由再灌注引起的微循環(huán)障礙。

因此，從現(xiàn)有技術(shù)可以推斷，在水性介質(zhì)和組織中應(yīng)用超聲波產(chǎn)生熱。單獨地以本領(lǐng)域常規(guī)的頻率和強度應(yīng)用超聲波僅1-10分鐘(大多數(shù)醫(yī)療應(yīng)用中使用的時間)導(dǎo)致組織的加熱，這被解釋為適當儲存離體生物樣品的不利因素。當溫度超過38℃，通常會中斷超聲波暴露，因為它會損傷組織。例如，專利文件us5,267,985公開了使用超聲波15-30分鐘以實現(xiàn)1-2cm的組織滲透的可能性。

實際上，在臨床實踐中經(jīng)常準確地應(yīng)用超聲波作為治療以引起組織加熱。除了僅由超聲波引起的加熱之外，陶瓷換能器傾向于隨著振動而變熱，甚至進一步增加對組織的熱效應(yīng)(watsont等，2008，48：321-329；bakerkg等，2001；81：1351-1358；legay等；2011，id670108；1-17)。

發(fā)明簡述

本發(fā)明的目的是提供用于運輸和保存離體生物樣品的裝置和上述類型的方法，其與可以用已知裝置獲得的相比，降低對生物樣品的損傷，因而增加其活力。在移植物的情況下，本發(fā)明還考慮提高移植患者的生活質(zhì)量的問題，最壞情況下顯著降低再次移植的需要。

該目的通過上述類型的用于離體運輸?shù)难b置來實現(xiàn)，其特征在于，它進一步包括至少一個適于對所述生物樣品產(chǎn)生并應(yīng)用超聲波的超聲波系統(tǒng)。因此，可以進行應(yīng)用超聲波結(jié)合內(nèi)部腔室的冷卻，從而防止生物樣品的局部加熱以及可能造成損傷的隨后的溫度升高。特別地，裝置還包括含有保存溶液的輔助容器，其沒有外部的氧氣遞送且用于容納浸漬在所述保存溶液中的所述生物樣品。

因此，與預(yù)期的不同，本發(fā)明已經(jīng)證實應(yīng)用超聲波(應(yīng)用超聲波使得不在樣品中產(chǎn)生局部加熱)不會對冷卻生物樣品的積極效果產(chǎn)生不利影響，因此也不會損傷樣品。此外，然而，出乎意料地證實用超聲波取得了非常顯著的改進，如將在以下描述中可見，可以證實在裝置的腔室內(nèi)應(yīng)用冷環(huán)境和應(yīng)用超聲波之間的協(xié)同作用。為此，有很多可能的構(gòu)型，例如以低強度在靠近生物樣品處應(yīng)用超聲波，或?qū)Q能器以較高強度置于遠離樣品并與包含樣品的保存溶液接觸。

此外，還與預(yù)期的不同，本發(fā)明沒有發(fā)現(xiàn)應(yīng)用超聲波的持續(xù)時間的問題。換言之，已知在器官運輸中需要將樣品保持在冷缺血條件下幾個小時。根據(jù)本發(fā)明，可以合適的強度持續(xù)應(yīng)用超聲波，除了可以預(yù)期的之外，它也不會損傷生物樣品。

因此，通過應(yīng)用超聲波和防止樣本的局部加熱，已經(jīng)證實細胞損傷的顯著降低。此外，基于進行的試驗，已經(jīng)證實通過同時應(yīng)用兩種處理對器官不受冷缺血誘導(dǎo)的損傷的保護出乎意料地比通過單獨的處理獲得的所有保護的總和更好。

此外，本發(fā)明還涵蓋作為從屬權(quán)利要求主題的一系列優(yōu)選特征，其用途將在本發(fā)明的實施方案的詳細描述中突出。

優(yōu)選所述輔助容器是可關(guān)閉的。

在一個優(yōu)選的實施方案中，已經(jīng)證實所述超聲波系統(tǒng)適用于發(fā)射頻率為25khz-1mhz、聲音強度為0.01-2w/cm²，優(yōu)選為0.02-1w/cm²，尤其優(yōu)選為0.02-0.1w/cm²的超聲波。已經(jīng)證實這些頻率和強度對于降低細胞損傷尤其有利。尤其以較低的強度可以獲得更好的結(jié)果，相對于生物樣品所需要的樣品冷卻和/或換能器的隔離更少，允許裝置更緊湊。

還可以優(yōu)選的考慮，以連續(xù)方式或以脈沖方式應(yīng)用超聲波。此外，本發(fā)明不排除通過相應(yīng)的單獨控制裝置的各個換能器同時應(yīng)用不同頻率的超聲波。

還已經(jīng)證實，溫度越低，超聲波獲得的協(xié)同作用越好。因此，在一個特別優(yōu)選的方式中，冷卻裝置適于將所述腔室內(nèi)的溫度保持為0-15℃，優(yōu)選2-10℃，尤其優(yōu)選2-6℃。如此證實，冷條件和超聲波組合在一起的結(jié)果比單獨的冷條件和超聲波在最好情況下可以預(yù)期的效果總和更好。

在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的裝置在所述腔室內(nèi)包含適于支持生物樣品的片狀支持物，當應(yīng)用所述超聲波時，所述片狀支持物能夠自由振動，超聲波系統(tǒng)包括至少一個安裝在所述片狀支持物的至少一個壁上的換能器。因此，支持物的阻尼效應(yīng)被最小化，并且超聲波以更有效的方式被引入生物樣品，提高其在較大生物樣品中的效果，條件是防止了生物樣品中過量的局部加熱。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個換能器安裝在與所述生物樣品的支持表面相對的所述片狀支持物的表面上，以將所述超聲波應(yīng)用到所述支持表面。從而獲得更均勻的超聲場，甚至進一步有利于冷條件和超聲波對生物樣品的組合效果。片狀支持物為托盤可能是合適的，并且這種托盤允許容納諸如水的流體以改善所應(yīng)用的超聲波的傳播。流體的功能一方面用作冷卻劑，同時有利于將超聲波傳輸?shù)缴飿悠贰?/p>

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述片狀支持物由金屬制成以增加其剛性并最大程度防止阻尼，并且實現(xiàn)生物樣品上超聲波更直接的傳遞。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，裝置包括容納保存溶液的可關(guān)閉輔助容器。再一次，已經(jīng)證實在降低對生物樣品的損傷方面，冷條件和超聲波的組合加上將生物樣品浸漬在保存溶液中提供的結(jié)果比它們單獨的效果的總和更好。

在根據(jù)本發(fā)明的裝置的一個實施方案中，片狀支持物是適于容納流體的托盤。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，片狀支持物是容納水的托盤。

在另一個實施方案中，輔助容器包括遠離所述輔助容器的底部的假底部，并且所述假底部與所述輔助容器的其余部分流體連通。

還在一個特別優(yōu)選的方式中，輔助容器可以包括用于保持生物樣品遠離容器的支持表面的假底部，所述假底部與所述輔助容器的其余部分流體連通。因此，樣品可以放置在輔助容器中，就好像它懸浮在保存溶液中一樣。因此，樣品不會受到超聲波的這種直接作用并且可在較高強度下工作。

此外，本發(fā)明還考慮用于運輸和保存離體可移植生物樣品的方法，其特征在于，它包括以下步驟：從生物樣品中去除并洗出血液，將生物樣品置于由絕熱材料制成的壁界定的腔室中而不需要外部氧氣遞送，并用超聲波照射樣品。更具體地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，通過將所述生物樣品置于由絕熱材料制成的壁界定的腔室中使生物樣品保持浸漬在保存溶液中而不需要外部氧氣遞送。

優(yōu)選地，所述生物樣品浸漬在輔助容器中，所述輔助容器優(yōu)選可關(guān)閉，包含所述保存溶液，并且所述輔助容器置于所述腔室中。

在方法的一個實施方案中，在照射所述生物樣品的照射步驟中，超聲波的頻率為25khz-1mhz，聲波強度為0.01-2w/cm²，優(yōu)選為0.02-1w/cm²，尤其優(yōu)選為0.02-0.1w/cm²。

在另一個實施方案中，方法包括用于將腔室中的溫度冷卻至0-15℃，優(yōu)選2-10℃，尤其優(yōu)選2-6℃的溫度的冷卻步驟。

在另一個實施方案中，方法進一步包括保持所述生物樣品浸漬在保存溶液中的步驟。

最后，方法進一步包括將所述輔助容器置于片狀支持物上的步驟，所述支持物是適于容納流體的托盤，且當應(yīng)用所述超聲波時，所述托盤能夠自由振動。

本發(fā)明還涉及用于運輸和保存離體生物樣品的裝置的用途。使用該裝置，生物樣品保持浸漬在保存溶液中而在低溫條件下不需要氧氣遞送，并且用超聲波照射所述樣品，使得對于待用于隨后的實驗室研究的生物樣品，保存所述生物樣品的不同細胞之間的活力、功能性和相互作用。

此外，本發(fā)明還涵蓋在本發(fā)明實施方案的詳細描述和附圖中闡明的其他細節(jié)特征。

附圖說明

本發(fā)明的其它優(yōu)點和特征將從沒有任何限制特征的以下描述中變得顯而易見，參照附圖公開了本發(fā)明的優(yōu)選實施例。

圖1顯示了用于運輸離體生物樣品的裝置的第一個實施方案的分解透視圖。

圖2顯示了圖4裝置的縱剖面正視圖。

圖3顯示了圖1裝置的生物樣品的支持托盤的第一個實施方案的頂視圖。

圖4顯示了圖3托盤的側(cè)視圖。

圖5顯示了用于生物樣品的支持托盤的第二個實施方案。

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明用于運輸?shù)难b置的第二個實施方案。

圖7a顯示了根據(jù)本發(fā)明用于運輸?shù)难b置的第三個實施方案。

圖7b顯示了圖7a裝置的輔助容器的替代實施方案。

圖8a-13顯示了相對于現(xiàn)有技術(shù)的條件，肝臟和腎臟生物樣品的保護百分比。

發(fā)明詳述

圖1和2顯示根據(jù)本發(fā)明的用于運輸和保存離體可移植生物樣品100的裝置1的第一個實施方案。在一個特別優(yōu)選的方式中，根據(jù)本發(fā)明的裝置是便攜式冷卻器。

如之前所述，生物樣品100包括器官和組織兩者，所述器官可以在供體和接受者(可以是人或動物)之間移植。此外，生物樣品也可以意欲用于研究而不需要移植。

根據(jù)本發(fā)明的用于運輸和保存的裝置1具有在上表面開口的平行六面體形主等溫容器16。主容器16的由絕熱材料制成的壁4(包括其上蓋)界定了用于容納生物樣品100的腔室2。

在主容器16內(nèi)提供冷卻裝置6，用于將腔室2內(nèi)的溫度保持低于所述裝置1外的溫度。這些冷卻裝置6可以包括不同的溶液、冰塊、冷卻凝膠包或包括壓縮機和熱交換器的復(fù)合溶液。裝置1也可以由帶或不帶外部電源的可運輸冷卻器組成。然而，期望溶液盡可能輕，從而不影響組裝物的可運輸性。冷卻裝置6允許將腔室2內(nèi)的溫度保持在0-15℃。在另一個優(yōu)選的實施方案中，腔室2內(nèi)的溫度保持為2-10℃，尤其優(yōu)選2-6℃。

裝置1通過支持在腔室2內(nèi)的金屬托盤在中央部分包括片狀支持物10，使得其可以自由振動。該第一實施方案的托盤的細節(jié)如圖3和4所示。在該實施方案中使用小于1mm，優(yōu)選0.5mm厚的鋁盤。

此外，裝置包括適用于對生物樣品100產(chǎn)生并應(yīng)用超聲波的超聲波系統(tǒng)。為此，根據(jù)附圖的超聲波系統(tǒng)具有電信號發(fā)生器20、放大器22、電池24、和在這種情況下的四個壓電換能器8。

通過四個換能器8，通過鋁盤向片狀支持物10施加振動。所述換能器8安裝在托盤的下表面。這個結(jié)構(gòu)的結(jié)果是，換能器和生物樣品100之間的傳輸更直接，因為振動直接在生物樣品下部的下面產(chǎn)生。在一個特別優(yōu)選的方式中，如圖6所示，托盤可以額外地包含水，但為了改進超聲波的傳輸，考慮生物樣品100容納于填充了保存溶液的袋子或容器中。本文提及的保存溶液例如是lactatedringer溶液、celsior溶液或威斯康星大學(xué)溶液。

在圖5所示的替代實施方案中，托盤可以在側(cè)壁上具有換能器8，以產(chǎn)生側(cè)向的振動場?；蛘邠Q能器8也可以位于托盤的側(cè)壁和底部。

在所述生物樣品100的運輸期間，超聲波換能器8將機械波傳輸至所述腔室2，所述機械波的頻率為25khz-1mhz，聲音強度為0.01-2w/cm²。強度優(yōu)選為0.02-1w/cm²，仍然更優(yōu)選為0.02-0.1w/cm²。使用的聲音強度越高，換能器8將會越遠和/或置于裝置1中的保存溶液流體或冷卻劑的量越大，以滿足防止生物樣品100的局部加熱的目的。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以連續(xù)應(yīng)用超聲波?；蛘撸部梢蚤g歇地應(yīng)用超聲波，即，它不在運輸持續(xù)的整個時間內(nèi)應(yīng)用?；蛘?，它也可以持續(xù)或間歇地以脈沖方式和/或以不同頻率應(yīng)用。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，生物樣品容納于含有保存溶液的貯藏器中，其改善應(yīng)用超聲波的結(jié)果。

以下示出在前述段落中描述的具有很多相同特征的根據(jù)本發(fā)明的用于運輸?shù)难b置1的其他實施方案。因此，以下將僅描述這些實施方案中不同的要素，對于共同的要素，參考第一個實施方案的描述。

圖6的裝置1的實施方案的區(qū)別主要在于，片狀支持物10直接整合在主容器16的壁4上。

最后，在圖7a的裝置的實施方案中，在主容器16內(nèi)提供具有保存溶液的輔助容器14。在一個特別優(yōu)選的方式中，輔助容器14可關(guān)閉，具有剛性壁和鉸接在其壁之一上的蓋。在一個特別優(yōu)選的方式中，當換能器位于托盤的下部時，輔助容器14的尺寸意欲占據(jù)換能器8的整個發(fā)射表面。輔助容器14填充保存溶液的結(jié)果是，超聲波以更有效的方式到達生物樣品100。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，輔助容器14通過使用可成形塑料(例如高密度聚乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二醇酯等)進行熱成形來制造。還在一個特別優(yōu)選的方式中，材料是透明的以使能夠看見生物樣品100而不需要打開輔助容器14。

圖7a顯示輔助容器14的替代實施方案。在這種情況下，輔助容器14包括遠離所述輔助容器14底部的假底部18，并且所述假底部18與所述輔助容器14的其余部分流體連通。因此，假底部使生物樣品100遠離輔助容器14的支持表面放置。這種情況下，假底部18由支持在輔助容器14的側(cè)壁上的剛性塑料片組成。然后，為了實現(xiàn)適當?shù)牧黧w連通，這種情況下提供允許保存溶液通過的多個開口20，使得所述溶液接受來自下部換能器8的超聲波的直接作用。

最后，在一個特別優(yōu)選的實施方式中，輔助容器14包含在無菌條件下的保存溶液，所述保存溶液選自lactatedringer保存溶液、celsior保存溶液或威斯康星大學(xué)保存溶液。這允許在用于其適當保存的更合適的條件下衛(wèi)生得多地處理生物樣品。

目前描述的實施方案代表非限制性的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在示出的實施例之外，要求保護的特征的大量組合也可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

具體實施方式

以下對根據(jù)本發(fā)明的方法進行的不同試驗進行說明。

方法

實驗方案在蘭德斯豬的肝臟和腎臟上進行。于4℃用保存溶液灌注腎臟和肝臟以去除器官中含有的血液，將器官保持在冷條件下，冰浴，直至將器官浸漬在不同保存溶液中。然后，將生物樣品置于冷卻器中，并在有或沒有超聲波下將冷卻器放置8小時(肝臟)和24小時(腎臟)。所有程序均在麻醉下進行，研究依據(jù)歐盟有關(guān)使用動物實驗的規(guī)定(86/609/eec指令)。

實驗設(shè)計

方案1

形成的實驗組如下：

第1組：在具有保存溶液的常規(guī)運輸系統(tǒng)中的冷缺血組。該組根據(jù)所用的保存溶液分為不同的亞組。

1.1)于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)，并于2-6℃下將這些器官用lactatedringer溶液分別保存在常規(guī)運輸系統(tǒng)中8小時(肝臟)和24小時(腎臟)；

1.2)與1.1相同，但使用celsior溶液洗滌和保存器官；

1.3)與1.1相同，但使用uw(威斯康星大學(xué))溶液洗滌和保存器官。

第2組：在具有超聲波(25khz，0.04w/cm²)且不含保存溶液的系統(tǒng)中的冷缺血組：于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)來洗滌器官以除去其中含有的血液。洗滌后，于2-6℃下分別將器官儲存在具有超聲波(25khz，0.04w/cm²)且不含保存溶液的系統(tǒng)中8小時(肝臟)和24小時(腎臟)。

第3組：在具有超聲波(25khz，0.04w/cm²)且含有保存溶液的系統(tǒng)中的冷缺血組。該組根據(jù)所用的保存溶液分為不同的亞組。

3.1)于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)，并于2-6℃的溫度下將這些器官用lactatedringer溶液分別儲存在具有超聲波的運輸系統(tǒng)中8小時(肝臟)和24小時(腎臟)；

3.2)與3.1相同，但使用celsior溶液洗滌和保存器官；

3.3)與3.1相同，但使用uw溶液洗滌和保存器官。

還進行實驗以評估其他頻率和/或強度是否能提供比25khz的頻率和0.04w/cm²的強度實現(xiàn)的保護更多的保護。為此，進行以下實驗。

第4組：在具有超聲波(40、80、200、580khz和1mhz)和強度為0.04w/cm²且含有保存溶液的系統(tǒng)中的冷缺血組。該組根據(jù)所用的頻率分為不同的亞組。

4.1)于4℃下用uw溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)，并于2-6℃的溫度下將器官用uw溶液分別儲存在具有40khz且強度為0.04w/cm²的超聲波的運輸系統(tǒng)中8小時(肝臟)和24小時(腎臟)；

4.2)與4.1相同，但使用80khz，強度為0.04w/cm²，2-6℃；

4.3)與4.1相同，但使用200khz，強度為0.04w/cm²，2-6℃；

4.4)與4.1相同，但使用580khz，強度為0.04w/cm²，2-6℃；

4.5)與4.1相同，但使用1mhz，強度為0.04w/cm²，2-6℃。

還進行實驗以驗證強度大于0.04的超聲波的效果。為此目的進行以下實驗。

第5組：在具有超聲波(25khz，強度為0.1w/cm²且含有保存溶液)的系統(tǒng)中的冷缺血組。于4℃下用uw溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)，并于2-6℃的溫度下將器官分別儲存在具有25khz且強度為0.1w/cm²的超聲波的運輸系統(tǒng)中8小時(肝臟)和24小時(腎臟)。

進一步增加以下實驗以評估保存溶液和冷條件的作用。

第6組：在不含保存溶液的常規(guī)運輸系統(tǒng)中的冷缺血組。于4℃下用lactatedringer溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)來洗滌器官以去除其中含有的血液。洗滌后，于2-6℃下分別將器官儲存在不含保存溶液的常規(guī)冷卻器(不含超聲波)中8小時(肝臟)和24小時(腎臟)。

第7組：非冷條件缺血組和超聲波(25khz，強度為0.04w/cm²)組合或不與超聲波組合。該組分為兩個亞組。

7.1)于20-25℃的溫度下用uw溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)。然后在20-25℃的溫度下分別將器官儲存8小時(肝臟)和24小時(腎臟)；

7.2)于20-25℃的溫度下用uw溶液灌注肝臟移植物(n＝10)和腎臟移植物(n＝10)。然后在20-25℃的溫度和25khz且強度為0.04w/cm²的超聲波下分別將器官儲存8小時(肝臟)和24小時(腎臟)。

收集和處理樣品

在缺血結(jié)束時，收集所有實驗組和亞組中的肝臟和腎臟灌注液樣品以用廣泛標準化的技術(shù)分析由缺血誘導(dǎo)的肝臟和腎臟損傷。通過測定灌注液中的轉(zhuǎn)氨酶水平和通過測定肝組織中的半胱天冬酶3活性來評估肝臟損傷。通過測定灌注液中的乳酸脫氫酶和腎組織的半胱天冬酶3活性來評估腎臟損傷。在肝臟和腎臟組織樣品中測定mda(丙二醛)水平作為氧化應(yīng)激指數(shù)，并測定atp(三磷酸腺苷)水平作為器官能量代謝保存指數(shù)(salahudeenak等，amjtranspl2003；3：273-280；omarr等，gut1989；30：510-514；peralta等，amjphysiol.2000；279：g163-71)。

通過方差分析(anova)進行統(tǒng)計學(xué)研究，然后用student-newman-kels檢驗測定統(tǒng)計學(xué)顯著性水平。

下面詳細解釋獲得的并在附圖中示意性地示出的結(jié)果。

圖8a-8e：示出了當在8小時的冷缺血結(jié)束時評估指示肝臟損傷的參數(shù)(即ast(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、alt(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、半胱天冬酶3活性、mda(丙二醛)和atp(三磷酸腺苷))時，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：uw溶液+冷條件(2-6℃)，在下述條件1-6下由肝臟移植物組成的生物樣品中的保護百分比，或者換言之，肝臟損傷減少的百分比。

條件(1-6)：

1：uw溶液，超聲波頻率為25khz和冷條件(2-6℃)；

2：uw溶液，超聲波頻率為40khz和冷條件(2-6℃)；

3：uw溶液，超聲波頻率為80khz和冷條件(2-6℃)；

4：uw溶液，超聲波頻率為200khz和冷條件(2-6℃)；

5：uw溶液，超聲波頻率為580khz和冷條件(2-6℃)；

6：uw溶液，超聲波頻率為1mhz和冷條件(2-6℃)。

在所有情況1-6中，施加的超聲波強度為0.04w/cm²。

圖9a-9d：示出了當在24小時的冷缺血結(jié)束時評估指示腎臟損傷的參數(shù)(ldh(乳酸脫氫酶)、半胱天冬酶3活性、mda和atp)時，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：uw溶液+冷條件(2-6℃)，在下述條件1-6下由腎臟移植物組成的生物樣品中的保護百分比。

1：uw溶液，超聲波頻率為25khz和冷條件(2-6℃)；

2：uw溶液，超聲波頻率為40khz和冷條件(2-6℃)；

3：uw溶液，超聲波頻率為80khz和冷條件(2-6℃)；

4：uw溶液，超聲波頻率為200khz和冷條件(2-6℃)；

5：uw溶液，超聲波頻率為580khz和冷條件(2-6℃)；

6：uw溶液，超聲波頻率為1mhz和冷條件(2-6℃)。

在所有情況1-6中，施加的超聲波強度為0.04w/cm²。

圖10：示出了當在8小時的冷缺血結(jié)束時評估指示肝臟損傷的參數(shù)ast時，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：不使用保存溶液+冷條件(2-6℃)+沒有超聲波，肝臟中的保護百分比。

1：lactatedringer溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

2：celsior溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

3：uw溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

4：lactatedringer溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)；

5：celsior溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)；

6：uw溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)。

注意：在所用的保存溶液中，臨床實踐中的標準溶液是uw(威斯康星大學(xué))保存溶液。lactatedringer溶液不含藥物，僅包含礦物鹽。celsior溶液含有谷胱甘肽，且uw溶液含有更多的藥物，如腺苷、谷胱甘肽和別嘌呤醇。

圖11：示出了當在24小時的冷缺血結(jié)束時評估指示腎臟損傷的參數(shù)ldh時，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：不使用保存溶液+冷條件(2-6℃)+沒有超聲波，腎臟中的保護百分比。

1：lactatedringer溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

2：celsior溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

3：uw溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

4：lactatedringer溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)；

5：celsior溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)；

6：uw溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)。

圖12：示出了當在8小時的冷缺血結(jié)束時評估指示肝臟損傷的參數(shù)ast時，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：uw保存溶液+沒有冷條件(20-25℃)+沒有超聲波，肝臟中的保護百分比。

1：uw溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

2：uw溶液，有超聲波和沒有冷條件(20-25℃)；

3：沒有保存溶液，有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

4：uw溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)。預(yù)期結(jié)果：保護1+保護2＝保護(1+2)。

5：uw溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)。實際觀察到的結(jié)果：保護1+保護2＜保護(1+2)。

圖13：示出了當在24小時的冷缺血結(jié)束時評估指示腎臟損傷的參數(shù)ldh，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：uw保存溶液+沒有冷條件(20-25℃)+沒有超聲波，腎臟中的保護百分比。

1：uw溶液，沒有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

2：uw溶液，有超聲波和沒有冷條件(20-25℃)；

3：沒有保存溶液，有超聲波和具有冷條件(2-6℃)；

4：uw溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)。預(yù)期結(jié)果：保護1+保護2＝保護(1+2)。

5：uw溶液，有超聲波(25khz，0.04w/cm²)和具有冷條件(2-6℃)。實際觀察到的結(jié)果：保護1+保護2＜保護(1+2)。

實驗結(jié)果的討論

重要的是要指出，如預(yù)期的那樣，不使用超聲波，在冷卻器內(nèi)，保存流體和器官中溫度范圍為2-6℃。此外，在冷條件(2-6℃)下應(yīng)用超聲波沒有改變冷卻器內(nèi)的溫度(所有實驗中為2-6℃)；但失去了器官和保存溶液冷卻。

當應(yīng)用超聲波時，冷卻器內(nèi)的溫度為2-6℃，保存溶液的溫度為14-16℃，器官的溫度為16-18℃。

根據(jù)感興趣的文件的背景，由超聲波引起的加熱作用是預(yù)期的結(jié)果。然而，與預(yù)期的相反，考慮到冷卻器官(4℃)和將保存液和器官的溫度保持在2-6℃之間以在低溫缺血條件下儲存器官的至關(guān)重要性，結(jié)果表明應(yīng)用超聲波不會對生物樣品的冷卻效果產(chǎn)生不利影響，因此不會損傷它。

然而，此外，出乎意料地，已經(jīng)證實取得非常顯著的改進，使得可以確定在裝置的腔室內(nèi)應(yīng)用冷條件和應(yīng)用超聲波之間的協(xié)同效應(yīng)。

圖8a-8e：如這些附圖中所示，在所有情況下(在不同的頻率和相同的0.04w/cm²強度)，應(yīng)用超聲波在冷缺血條件下保護肝臟移植物，所述保護作用在條件1(即，頻率為25khz)下更明顯。圖中沒有示出的其他結(jié)果表明，在高強度下(如0.1w/cm²情況下)，也獲得對肝臟移植物的保護。例如，當在8小時的冷缺血結(jié)束時評估指示肝臟損傷的參數(shù)ast時，相對于由以下條件誘導(dǎo)的損傷：uw溶液+冷條件(2-6℃)，在頻率25khz和強度0.1w/cm²下獲得的保護百分比或損傷減少55％。

圖9a-9d：示出了與圖8a-8e的肝臟所示的相同模式的腎臟保護。

圖10：如預(yù)期的，觀察到在沒有應(yīng)用超聲波的情況下保存溶液提供對肝臟的保護(條件1-3)；相對于兩種溶液(ringer或celsior)，如果用uw保存溶液，對肝臟移植物的保護更好，且celsior溶液獲得的保護比lactatedringer溶液獲得的更好。此外，當觀察在超聲波存在下由保存溶液提供的保護時(條件4-6)，獲得出乎意料的結(jié)果，表明超聲波的更好保護，但這種保護在所有條件(4-6)下類似。換言之，與所用的保存溶液是lactatedringer溶液、celsior溶液或uw溶液無關(guān)，獲得相同程度的保護。

圖11：示出了與圖10的肝臟所示的相同模式的腎臟保護。

圖12：如預(yù)期的，與用uw在4℃和在室溫(20-25℃)下保存相比，沒有應(yīng)用超聲波的冷條件(條件1)且使用uw溶液將肝臟移植物的保護增加了約30％。出乎意料地，條件2(uw溶液，在超聲波存在下且在室溫下)獲得的保護比條件1(uw溶液和冷，沒有超聲波)更好。換言之，在4℃保存溶液的存在下，在室溫下的腔室中應(yīng)用超聲波比在低溫條件下(溫度為2-6℃的腔室)不用超聲波更好。結(jié)果表明，條件3(沒有保存溶液、在冷條件下且有超聲波)獲得的保護比在條件1和2下獲得的更好，這也是出乎意料的。這些結(jié)果表明，與存在保存溶液和冷條件(條件1)或超聲波(條件2)的組合相比，超聲波和冷條件(即使不存在保存溶液)的組合更好。條件4和5分別示出了當使用uw溶液、超聲波和冷條件時，預(yù)期的和觀察到的保護。預(yù)期的保護，在最好情況下是條件1獲得的保護和條件2獲得的保護的總和。換言之，由于超聲波誘導(dǎo)的熱效應(yīng)，預(yù)期保護1+2不會等于單獨考慮的條件1和2的總和。然而，這并不是觀察到的結(jié)果。所得結(jié)果表明當組合兩種處理(冷條件和超聲波)時具有協(xié)同作用，因為當組合兩種處理時獲得的保護比單獨應(yīng)用兩種處理時獲得的保護的總和好得多。此外，當組合兩種處理且在保存溶液存在下獲得的保護比當組合兩種處理但沒有保存溶液(條件3)獲得的結(jié)果好得多。

圖13：示出了與圖5的肝臟所示的相同模式的腎臟保護。

因此，考慮所有結(jié)果，保存溶液、超聲波和冷條件的組合對于冷缺血期間器官的運輸和保存可以是極其有效的策略。

提供了在比目前可獲得的條件更好的條件下，在低溫條件下運輸和儲存生物樣品并且沒有氧氣遞送的方法和設(shè)備，其能有效地將超聲波傳輸?shù)角皇覂?nèi)的器官或組織。所有這些都可以減少冷缺血的有害影響，并且在移植物植入接受者之前增加移植物的活力，從而防止進行再一次移植。

用于保存的設(shè)備和方法也可用于二次器官；可用于移植的器官數(shù)量可能相應(yīng)增加，從而減少等待名單。此外，由于在器官的保存和運輸期間由冷缺血誘導(dǎo)的損傷減少，因此可以延長器官在冷卻器中運輸?shù)街踩虢邮苷咧暗臅r間。此外，設(shè)備易于運輸，以防止除了其他因素外，由器官的動態(tài)保存引起的物流并發(fā)癥。