本發(fā)明涉及一種用于處理哺乳動物精液的方法，該方法不基于化學(xué)試劑，且其目的是通過但不限制于激活所述精液中包含的精子的運(yùn)動力來增加精液的生育力，提高它們對應(yīng)激的抗性，并在總體上提高精子成活力。

該方法基于將裝有精液的容器暴露于電磁(可見光)輻射中進(jìn)行處理。在等溫環(huán)境中，將處理?xiàng)l件優(yōu)化為特定的波長、時間和劑量值。

本發(fā)明屬于哺乳動物的輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明包括一種在授精之前的步驟中使用的所有暴露變量經(jīng)過驗(yàn)證和優(yōu)化的方法以及設(shè)計用于在容器、插管、注射器、試管或類似系統(tǒng)中實(shí)施該方法的設(shè)備。

背景技術(shù)：

精子成活力、活力和運(yùn)動力描述了能順利朝向卵子移動的精子功能。這些因素與精子質(zhì)量直接相關(guān)，且在實(shí)現(xiàn)受精時比總精子數(shù)量更具有決定性。運(yùn)動力不足的或不合適的精子不能到達(dá)卵子，這樣不能自然受精。

精子遷移通過雌性生殖道(內(nèi)部受精)或在合成液體中(體外受精)到達(dá)卵子的是成功受精的關(guān)鍵。另一方面，精子的運(yùn)動力也是穿過卵子周圍的細(xì)胞外基質(zhì)所必需的。

精子運(yùn)動力通過特定的生理變化激活，這些生理變化從一個物種到另一物種會有所不同。這些變化包括，例如，ph、鈣離子濃度和特定配體(例如環(huán)腺苷磷酸)的改變。

不采用技術(shù)干預(yù)，活力低、不能動的精子或具有異常運(yùn)動力的精子不會使卵子受精，這是生育力低或不育的一個主要原因。

在人工授精方法中，將精液懸浮液引入雌性生殖道。在人類不育治療的范圍內(nèi)，那些具有運(yùn)動力的精子進(jìn)行預(yù)先獲能和選擇，然后將具有運(yùn)動力的精子直接引入子宮中。

無論待處理的哺乳動物精子的類型如何，本專利的目的是采用基于暴露于特定條件的可見光的非化學(xué)處理來增加精子的運(yùn)動力。

目前，存在不同實(shí)驗(yàn)室方案用于制備精液懸浮液、進(jìn)行精子獲能，且如果適用的話，選擇具有合適運(yùn)動力的細(xì)胞。一般而言，在特定的離子、營養(yǎng)濃度和特定的ph下制備這些懸浮液。

專利us5,453,354公開了激活精子運(yùn)動力的蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子以及通過從細(xì)胞外液中純化大分子制備該大分子的相應(yīng)方法。

專利us7,780,230提供了包含從非洲爪蟾卵(xenopuslaevis)中純化的細(xì)胞質(zhì)提取物的組合物，其能夠支持人類精子的活化和人類精子基因組的完全復(fù)制。

專利us6,309,815提供了用于延長不能游動的精子的成活力的方法和組合物。該方法包括收集精子并采用儲存緩沖溶液處理精子以大體上抑制精子的運(yùn)動力，然后將精液在特定溫度下儲存一段時間，最后通過將抑制的精子與激活緩沖液混合以再激活精子至正常運(yùn)動力。

另一方面，在2005年公開了公羊和魚(羅非魚)的精子對不同類型的光的反應(yīng)^[1]，根據(jù)精子的類型和光的類型檢測不同類型的反應(yīng)。得出的結(jié)論是：哺乳動物(公羊)的精液的體外處理必須在沒有光或在紅光下進(jìn)行，其中檢測到運(yùn)動力的輕微增加。

分析精子對一般可見光(整個光譜)的反應(yīng)和所涉及的可能的細(xì)胞機(jī)制的研究^[2]最近已經(jīng)公開。該論文得出結(jié)論：短時間的光照射引起運(yùn)動力的顯著提高，但沒有說明可見光譜(其指的是整個光譜)的具體范圍或能量的具體數(shù)量。

采用特定波長激活哺乳動物精子運(yùn)動力的第一種方法分別采用狗精液^[3,4]和水牛精液^[5]在655nm和532nm下進(jìn)行。在第一個案例中，報道了光的類型和劑量與運(yùn)動力之間的比例關(guān)系，在第二個案例中，驗(yàn)證了采用激光系統(tǒng)暴露的明確條件。該近期論文表明了采用激光作為原位改善精液質(zhì)量以優(yōu)化人工授精條件的技術(shù)的可能性。

雖然有證據(jù)表明光療法可能適用于哺乳動物的人工授精療法，但大部分研究至多對精液懸浮液的進(jìn)行研究，且僅證實(shí)運(yùn)動力的某些有限的增加，而沒有評估用于確定精液質(zhì)量的其它重要參數(shù)是否受到影響，以及它們是否實(shí)際上轉(zhuǎn)化為現(xiàn)場試驗(yàn)中妊娠概率的增加或應(yīng)當(dāng)在現(xiàn)實(shí)條件的設(shè)備水平下應(yīng)用的方法。

專利us6379939描述了一種用于增加哺乳動物(特別是人類)的精細(xì)胞的受精能力的方法，并且其提出采用在擴(kuò)展可見光范圍(300至1000nm)中的具有1至1000mw/cm²強(qiáng)度的光照射所述精細(xì)胞且持續(xù)0.5至10分鐘的時間，其中光不是由激光產(chǎn)生。

husseinzm等人的“theeffectofdiodelaserandlightemittingdioseonthebacterialcontaminationofsemenmediumforartificialinsemination”(“二極管激光器和發(fā)光二極管對用于人工授精的精液介質(zhì)的細(xì)菌污染的影響”)公開了一種新的光學(xué)方法，其采用二極管激光器(dl)和商業(yè)廉價的發(fā)光二極管(led)抑制細(xì)菌在含有增量介質(zhì)的精液中生長。根據(jù)所推薦的方法，將樣品浸入冷水中并暴露在兩種不同的光源(led和dl)持續(xù)不同的暴露時間，暴露時間從0變化至20分鐘。在整個吸管長度上以整數(shù)距離照射樣品。采用不同的機(jī)械頻率重復(fù)最后的步驟，所述不同的機(jī)械頻率由兩個信號源的旋轉(zhuǎn)快門切割光束而產(chǎn)生。除了黑暗對照組(未暴露于光的長期精液)之外，檢測所有暴露的細(xì)菌計數(shù)和精子成活力。

需要提供現(xiàn)有技術(shù)的替代方案，現(xiàn)有技術(shù)缺乏詳細(xì)的信息，同時僅允許使用不基于激光器的光學(xué)系統(tǒng)工作，具有明顯的操作缺點(diǎn)：現(xiàn)場工作設(shè)備的價格和實(shí)施的可能性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)和現(xiàn)有成果，本發(fā)明人致力于以光療法作為提高精液質(zhì)量的方法的研究，但是是在人類生殖中心或動物農(nóng)場中建立原位方案。先前的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了這種目的并且在現(xiàn)實(shí)條件下得到確認(rèn)，確定了：在冷卻或恒溫條件下在用于容納這種流體的常規(guī)容器上進(jìn)行該種處理的光周期、光劑量、暴露時間和裝置。

本發(fā)明描述了采用不基于激光的光學(xué)系統(tǒng)處理哺乳動物的精子溶液的條件。在這種情況下，限定了波長的具體范圍、曝光時間和運(yùn)動力最大時精子溶液的使用時間，從而確保精子的最佳授精能力。

為了這個目的，本發(fā)明在第一方面提供了用于增加(例如哺乳動物)精細(xì)胞的受精能力的方法，與已知技術(shù)類似，該方法包括采用非相干紅光照射所述精細(xì)胞。

然而，本發(fā)明的第一方面的方法的特征在于，根據(jù)包括特定持續(xù)時間的兩個照射周期的至少一個序列的模式，采用非相干紅光以不連續(xù)的方式進(jìn)行照射，所述特定持續(xù)時間的兩個照射周期由特定持續(xù)時間的中間黑暗周期間隔開，如本發(fā)明人確認(rèn)的，對于所期望的目的，其產(chǎn)生非常有益的結(jié)果。

照射和黑暗的每個特定周期可以具有8至15分鐘的持續(xù)時間。所述持續(xù)時間優(yōu)選為10分鐘。此外，所提及的暴露和黑暗周期可以具有相同或不同的持續(xù)時間。

另一方面，紅光可以具有620nm至630nm的波長。

根據(jù)一個實(shí)施例，將包含所述精細(xì)胞的至少一種精液樣品在稀釋劑中稀釋，并將所提及的照射施加于稀釋樣品的至少一部分上。同樣地，也可以將稀釋樣品的至少一部分或所述精液樣品的未稀釋部分引入一容器中，該容器具有所述照射紅光的波長能透過的壁，所述照射可以施加于所述容器上。因?yàn)槿萜鞯臍んw，精液保存在黑暗中。

根據(jù)一個實(shí)施例，容器是試管或微量離心管，并且具有適于授精處理的尺寸。

優(yōu)選冷藏保存精液樣品的稀釋部分或未稀釋部分，至少直到立即在其上施加紅光照射之前的時間和/或在所述施加期間。

同樣地，可以將精液樣品的一部分或多部分在經(jīng)受所提及模式的紅光照射之后，在大體16-21℃的等溫介質(zhì)中溫育。一般而言，以不同周期的進(jìn)行溫育，在每個周期之后，所述方法包括對精液樣品的一部分或多部分進(jìn)行分析對照，用于至少確定精子的功能性成活力和運(yùn)動力的狀態(tài)。

本發(fā)明的第二方面提供了一種用于增加(例如哺乳動物)精細(xì)胞的受精能力的裝置，所述裝置包括非相干紅光照明構(gòu)件，所述構(gòu)件配置和布置為采用非相干紅光照射所述精細(xì)胞。該第二方面的裝置的特征在于，所述裝置配置用于實(shí)施本發(fā)明的第一方面的方法，其包括：

-控制構(gòu)件，控制所述照明構(gòu)件，以根據(jù)所述不連續(xù)模式進(jìn)行所述照射，

-支撐件，支撐所述精細(xì)胞的至少一個容器，并且容器的壁能透過所述照射紅光的波長；和

-殼體，其內(nèi)部容納所述支撐件和由所述支撐件支撐的容器，所述照明構(gòu)件布置為朝向至少一個容器發(fā)射光。

該裝置還可以包括冷卻構(gòu)件，所述冷卻構(gòu)件配置和布置用于冷卻容納在殼體內(nèi)的元件。控制構(gòu)件優(yōu)選地至少針對待施加的照射的模式(照射波長、焦點(diǎn)和持續(xù)時間)是可編程的。

一旦根據(jù)本發(fā)明的原理進(jìn)行精細(xì)胞處理，就能驗(yàn)證活動的精子的百分比和它們的運(yùn)動力水平相對于它們的先前基線水平得到提高，以及它們的抗應(yīng)激能力也得到提高。

因?yàn)樗刑岣呋顒拥木拥某苫盍瓦\(yùn)動力的因素在成功的卵子受精過程中是關(guān)鍵因素，所以細(xì)胞成活力和活力的這種增強(qiáng)將增加受精的概率。

附圖說明

基于以下參考附圖的若干實(shí)施例的詳細(xì)描述，將能更好地理解前文的和其它的優(yōu)點(diǎn)和特征，這些附圖必須以說明性和非限制性方式解釋，其中：

圖1是2ml管中的小樣本的示例；

圖2是在50ml容器中的稀釋樣品的示例。

具體實(shí)施方式

為了證實(shí)前述的證據(jù)和光療法對提高精細(xì)胞運(yùn)動力-成活力的不同描述性參數(shù)和精細(xì)胞對環(huán)境應(yīng)激(其被視為在37℃超過1小時的時間)的耐受性的影響的實(shí)際大小，采用豬的精液作為哺乳動物模型進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)室研究。

用豬的精子進(jìn)行研究，因?yàn)樗鼈兪侨菀撰@得的材料，且因?yàn)樗鼈兪怯糜诮Y(jié)果外推至其它哺乳動物(包括人)的良好模型。

使用來自15頭年齡為2-3歲且來自5個不同品種(皮特蘭豬、杜洛克豬、大白豬、比利時長白豬和英國長白豬)的健康成年雄性豬的樣品進(jìn)行研究。這些樣品通過手動刺激獲得，立即在商業(yè)稀釋劑中稀釋至最終精子濃度為3×10⁷個精子/ml，終體積為90ml，并在16-17℃保存。

將1.5ml的兩個等分試樣沉積在微量離心管中，將一個等分試樣在16-17℃下溫育作為對照組，并且通過圖1中描述的裝置將其它等分試樣暴露于不同的光刺激程序中。

實(shí)施的光刺激程序具體如下：

(a)暴露于紅光中10分鐘，停止10分鐘和暴露于紅光中10分鐘。

(b)暴露于紅光中15分鐘，停止10分鐘和暴露于紅光中15分鐘。

(c)暴露于紅光中20分鐘，停止10分鐘和暴露于紅光中20分鐘。

一旦已經(jīng)進(jìn)行過處理，將不同的對照等分試樣和處理的等分試樣引入37℃的恒溫槽中，溫育不同的時間(15、30、60和90分鐘)，之后進(jìn)行分析對照以確定功能性成活力和運(yùn)動力的狀態(tài)。

所述分析對照是：

1)通過采用臺盼蘭/吉姆薩(trypanblue/giemsa)雙重染色法^[6]來評估運(yùn)動力和結(jié)構(gòu)完整的頂體的百分比

2)通過計算機(jī)輔助運(yùn)動力分析(casa)進(jìn)行精子運(yùn)動力分析，測量以下參數(shù)：曲線速度(vcl)、直線速度(vsl)、平均路徑速度(vap)、線性指數(shù)(lin)、前向性指數(shù)(str)、擺動性指數(shù)(wob)、頭側(cè)位移的平均幅度(alh)和平均最佳交叉頻率(bcf)。

通過將不遵循正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)變換(logtransformation)來統(tǒng)計評價5個獨(dú)立測試的結(jié)果。通過sas統(tǒng)計包的lsmeans方法確定顯著性差異(p<0.05)。

表1.實(shí)驗(yàn)1.90分鐘時，對照組和處理組a、b和c之間的顯著差異(*)

*大于對照組#小于對照組

這些研究確定了，過長持續(xù)時間的劑量(暴露于非相干紅光的照射的時間)沒有任何效果或其結(jié)果不是最佳的，并且就提高運(yùn)動力-成活力而言，陽性反應(yīng)和兩種情況中至少2次非相干紅光暴露與好確定的(welldetermined)持續(xù)時間的中間黑暗周期的組合強(qiáng)相關(guān)。一般而言，處理組a和b處理顯示出清楚的保護(hù)效應(yīng)，顯著提高了精子的存活，處理組a中獲得的值比處理組b中的值水平高。因此，處理組a被認(rèn)為是到實(shí)驗(yàn)時為止所評估的所有處理組中最好的，且被認(rèn)為是在現(xiàn)實(shí)情況中哺乳動物輔助生殖的應(yīng)用的起點(diǎn)。

為了驗(yàn)證不連續(xù)處理(具有中間停止周期)相對于等效的但以連續(xù)方式給光的處理是否有明顯的提高，采用與上面描述的相同的材料和方法評估以下治療方案。

光刺激程序是：

(再次用處理組a和未暴露的對照組)

(d)暴露于紅光中10分鐘，

(e)暴露于紅光中20分鐘

(f)暴露于紅光中30分鐘

(g)暴露于紅光中45分鐘

表2.實(shí)驗(yàn)2.90分鐘時，對照組和處理組a、d、e、f和g之間的顯著性差異(*)

*大于對照組#小于對照組

基于表1和2中顯示的結(jié)果的結(jié)論，我們推斷，不連續(xù)處理對哺乳動物精液(使用來自不同種類的豬的精液作為模型)的性質(zhì)有極大的提高，相反，連續(xù)處理使精液的性質(zhì)惡化，這些性質(zhì)是受精的關(guān)鍵。

從上文推斷得出，在10-10-10的刺激模式(照射10分鐘，隨后停止10分鐘和照射最后的10分鐘)中，采用非相干紅色led光(例如波長為620-630nm)的受控光刺激顯著提高了豬的精子的熱應(yīng)激抗性，所述豬精子預(yù)先在商業(yè)稀釋劑中稀釋，所述商業(yè)稀釋劑在16-17℃下冷卻，是在農(nóng)場中人工授精常規(guī)使用的稀釋劑。

這種光刺激模式也使得這些精子實(shí)現(xiàn)孕酮誘導(dǎo)的體外頂體反應(yīng)的能力的提高。這些體外結(jié)果表明光刺激對精子具有顯著的影響，不僅提高抵抗環(huán)境應(yīng)力的能力，而且提高穿透卵子的能力。作為整體和作為最終結(jié)果，兩種效應(yīng)可以提高光刺激的精子的受精能力，隨后提高體內(nèi)生育力和多育性的結(jié)果，特別是在環(huán)境應(yīng)激可能降低所述生育力的和多育性的條件下。

應(yīng)用的示例將是在養(yǎng)豬場中，其中環(huán)境溫度正在損害生殖能力。

第二個應(yīng)用例子將是在人類生殖的范圍內(nèi)，其中由于環(huán)境的和/或有機(jī)的原因?qū)е碌倪\(yùn)動力的缺乏與男性不育有關(guān)。

由于豬是在代謝上與人類似并且在不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上被接受為模型的動物，且由于第二個示例的實(shí)際演示在倫理上是不可行的，事先并沒有至少采用動物模型加以證明，該方法在哺乳動物中的有效性采用豬作為模型來驗(yàn)證。

在育種場中沿用在上文描述的針對商業(yè)化精液劑量的光刺激方法并使用上文描述的設(shè)備(圖2)進(jìn)行的研究中，采用子宮頸授精的方式處理7種不同批次的，總共n＝195的發(fā)情雌性豬。以與采用光刺激的精液懸浮液(n＝78)處理的每批雌性豬的平行方式，采用未處理的懸浮液(n＝117)對第二批進(jìn)行授精。結(jié)果見下表：

表3.對照組和采用光刺激的商業(yè)化劑量進(jìn)行受精的組的生育力百分比

n，妊娠的雌性豬的數(shù)量

％，相對于組總數(shù)的生育力百分比

對照組的95％置信區(qū)間的生育結(jié)果為(90.85-97.01)％，處理的雌性豬的95％置信區(qū)間的生育結(jié)果為(95.07-100)％。統(tǒng)計平均比較檢驗(yàn)(單尾配對t檢驗(yàn))得出p＝0.0448，證明，盡管對照組中生育力的較高百分比表示該研究是在具有高生育率百分比的非常高效的育種場中進(jìn)行，兩組之間仍存在顯著差異。

必須強(qiáng)調(diào)的是，一旦妊娠結(jié)束，在100頭雌性豬的批次中具有陽性受精的2頭雌性豬的差異與每批次的至少16個后代的差異是等同的(每個個體平均有8個后代)，其對家畜的產(chǎn)量具有明顯增殖效應(yīng)。

對照組妊娠的雌性豬的95％置信區(qū)間的活產(chǎn)數(shù)據(jù)為13.73(12.82-14.45)，采用光刺激精液處理的妊娠的雌性豬的95％置信區(qū)間的活產(chǎn)數(shù)據(jù)為14.31(13.29-15.33)。這些結(jié)果表明，一旦妊娠，采用光刺激的精液不會降低其多產(chǎn)性。

本發(fā)明的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求限定。

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