本文提供的技術(shù)整體涉及經(jīng)基因修飾的高等植物，例如c3和c4植物及其后續(xù)世代，該經(jīng)基因修飾的高等植物包括“萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)co2濃縮機(jī)制”(ccm)的至少一種基因產(chǎn)物(如mrna或蛋白質(zhì))的穩(wěn)定和/或瞬時(shí)表達(dá)，其中該表達(dá)在高等植物的葉綠體的膜間隙和/或一個(gè)或多個(gè)亞細(xì)胞隔室中發(fā)生，并且其中該表達(dá)增加了經(jīng)基因修飾的高等植物(t0)的和/或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)植物世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及高等植物，其包括衣藻屬(chlamydomonas)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lcia、lcib)和碳酸酐酶(cah1、cah3)在c3或c4植物的葉綠體的不同亞細(xì)胞隔室中的單獨(dú)或組合表達(dá)。在一些方面，lcia、lcib、cah1和cah3在經(jīng)基因修飾的高等植物的典型定位中表達(dá)，在其他方面，它們?cè)诮?jīng)基因修飾的高等植物的非典型定位中表達(dá)。一般來(lái)講，本發(fā)明涉及改善的谷類(lèi)、豆類(lèi)、果類(lèi)、根部和塊莖、油料作物、纖維作物和喬木。此外，本發(fā)明涉及此類(lèi)經(jīng)基因修飾的高等植物的方法和用途。
背景技術(shù)：
：c3碳固定是用于光合作用的碳固定的三種代謝途徑之一，其余兩種是c4和cam。在c3過(guò)程中，二氧化碳和核酮糖二磷酸(rubp，5碳糖)通過(guò)以下反應(yīng)轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸：co2+rubp→(2)3-磷酸甘油酸。c3植物來(lái)源于中生代和古生代期間，早于c4植物，并且仍代表著大約95％的地球植物生物質(zhì)。c3植物會(huì)經(jīng)蒸騰作用喪失97％通過(guò)其根部吸收的水。單獨(dú)以c3固定存活的植物(c3植物)往往在其中日光強(qiáng)度適度、溫度適度、二氧化碳濃度為約200ppm或更高并且地下水豐富的區(qū)域中生長(zhǎng)。c3植物的例子包括稻米、小麥、橘樹(shù)、葡萄植物、咖啡植物、煙草植物、茶植物、花生植物、檸檬樹(shù)、馬鈴薯、胡蘿卜、番茄、桃樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)、芒果樹(shù)和大麥。另外的例子包括燕麥、裸麥、黑小麥、干菜豆、大豆、綠豆、蠶豆、豇豆、豌豆、鷹嘴豆、木豆、兵豆、香蕉、椰子、芋頭、薯蕷、甘薯、木薯、甜菜、棉花、黃麻、劍麻、芝麻、向日葵、油菜籽和紅花。c3植物不利于在炎熱地區(qū)生長(zhǎng)，因?yàn)殡S著溫度的升高，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)將更多的氧摻入rubp。這導(dǎo)致了光呼吸作用的增加，從而導(dǎo)致植物的碳和氮的凈損失，因此可限制生長(zhǎng)。在干燥區(qū)域，c3植物關(guān)閉其氣孔以減少水分喪失，但這阻止了co2進(jìn)入葉片，因此減少了葉片中的co2濃縮。這降低了co2:o2比率，因此也增加了光呼吸作用。在另一個(gè)方面，對(duì)c4和cam植物進(jìn)行了改進(jìn)，以使它們能在炎熱和干燥地區(qū)存活，因此它們優(yōu)于c3植物。c4碳固定是用于碳固定的三種生物化學(xué)機(jī)制之一，其余兩種是c3和cam光合作用。它因存在于稱(chēng)為c4植物的少數(shù)植物中的碳固定的第一個(gè)產(chǎn)物中的4碳分子而得名，相比之下，c3植物中為3碳分子產(chǎn)物。c4固定是對(duì)更常見(jiàn)的c3碳固定的細(xì)化，并且據(jù)信是更晚進(jìn)化得來(lái)。c4和cam克服了在所謂的光呼吸作用中rubisco酶浪費(fèi)于固定氧而非二氧化碳的趨勢(shì)。這通過(guò)使用葉肉細(xì)胞中的更有效的固定co2的酶，并且關(guān)閉該通過(guò)進(jìn)入維管束鞘細(xì)胞的蘋(píng)果酸或天冬氨酸來(lái)進(jìn)行的碳固定實(shí)現(xiàn)。在這些維管束鞘細(xì)胞中，rubisco與大氣氧隔離，并被蘋(píng)果酸或草酰乙酸的脫羧作用釋放的co2飽和。然而，這些另外的步驟需要更多atp形式的能量。由于該額外能量要求，c4植物能夠僅在某些條件下更有效地固定碳，而在其他條件下更常見(jiàn)的c3途徑更有效。然而，也可根據(jù)本發(fā)明修飾c4，以便更進(jìn)一步改善碳固定。c4植物的例子包括馬唐、玉米(玉蜀黍)、莧菜、高粱、粟、甘蔗、香附、馬唐、稗、四翅濱藜和藜科植物。衣藻屬是由存在于死水和潮濕土壤中，存在于淡水、海水中，甚至雪中(如“雪生藻類(lèi)”)的單細(xì)胞鞭毛藻組成的綠藻屬。衣藻屬被用作分子生物學(xué)，特別是鞭毛運(yùn)動(dòng)性和葉綠體動(dòng)力學(xué)、生源論和遺傳學(xué)的研究的模式生物。水生光合生物諸如萊茵衣藻可調(diào)節(jié)其光合作用，以通過(guò)誘導(dǎo)碳濃縮機(jī)制(ccm)來(lái)適應(yīng)co2限制脅迫，該碳濃縮機(jī)制包括碳酸酐酶(cah)和無(wú)機(jī)碳(ci)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。碳濃縮機(jī)制(ccm)允許萊茵衣藻優(yōu)化用于光合作用的碳獲取。當(dāng)無(wú)機(jī)碳(ci；co2和/或hco3-)受到限制時(shí)，ccm起到促進(jìn)co2同化的作用。通過(guò)活性ci攝取系統(tǒng)，提高了內(nèi)部ci水平，然后碳酸酐酶通過(guò)積聚的碳酸氫鹽的脫水作用為核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(“rubisco”)提供足夠的co2。在本發(fā)明中，將新鑒定的ccm組分整合進(jìn)高等植物，以增加所述經(jīng)基因修飾的高等植物的后續(xù)植物世代，特別是t1和/或t2世代和任何其他世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。通過(guò)該修飾，高等植物不僅可以更快地生長(zhǎng)，在已知的棲息地中更具競(jìng)爭(zhēng)力，而且甚至可在該植物傳統(tǒng)上未占據(jù)的氣候條件下生長(zhǎng)。高等植物的另外例子包括谷類(lèi)、豆類(lèi)、果類(lèi)、根部和塊莖、油料作物、纖維作物和喬木。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)方面涉及經(jīng)基因修飾的高等植物及其后續(xù)世代，所述經(jīng)基因修飾的高等植物包括“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)的至少一種基因產(chǎn)物的穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)，其中該表達(dá)在植物的葉綠體的膜間隙和/或一個(gè)或多個(gè)亞細(xì)胞隔室中發(fā)生。在一個(gè)方面，該表達(dá)增加了經(jīng)基因修飾的高等植物(t0)的和/或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。在一個(gè)方面，所述經(jīng)基因修飾的高等植物是c3植物，在另一個(gè)方面，所述經(jīng)基因修飾的高等植物是c4植物。另一個(gè)方面涉及選自萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia、碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib、碳酸酐酶cah1和/或碳酸酐酶cah3的“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)的基因產(chǎn)物。在又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，cah1、cah3、lcia和lcib中的任一者的表達(dá)使所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1世代生長(zhǎng)更快和/或營(yíng)養(yǎng)期更短。在一個(gè)方面，“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”的所述基因產(chǎn)物是萊茵衣藻的碳酸酐酶cah1。在另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶cah1在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的非典型定位膜間隙中表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)方面是在葉綠體的非典型隔室中的表達(dá)(比如如實(shí)例中所示的cah1的非典型表達(dá))增加了經(jīng)基因修飾的高等植物(t0)的和/或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在葉綠體的典型隔室中的表達(dá)增加了經(jīng)基因修飾的高等植物(t0)的和/或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的膜間隙中所述碳酸酐酶cah1的表達(dá)提高了所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的光合速率至少8％、葉綠素水平至少7％和/或生物質(zhì)至少22％。這些植物的葉片數(shù)量也增加。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在cah1t2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+22％·鮮重：+26％·干重：+29％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在cah1t2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+142％/+22％·葉綠素含量：+15％/+13％·葉片數(shù)量：+21％/+24％·鮮重：+nd/+26％·干重：+nd/+29在本發(fā)明的另一個(gè)方面，“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)的所述基因產(chǎn)物是萊茵衣藻的碳酸酐酶cah3。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述碳酸酐酶cah3在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的類(lèi)囊體腔中表達(dá)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的類(lèi)囊體腔中所述碳酸酐酶cah3的表達(dá)，使得在所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代中，與野生型對(duì)照相比，光合速率提高至少8％、葉綠素水平提高至少10％，氣孔大小增加最多50％和/或生物質(zhì)增加至少31％。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在cah3t2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+24％·鮮重：+34％·干重：+31％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在cah3t2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+78％/+24％·葉綠素含量：+11％/+10％·葉片數(shù)量：+26％/+64％·鮮重：+nd/+34％·干重：+nd/+31％在本發(fā)明的另一個(gè)方面，“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)的所述基因產(chǎn)物是萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的內(nèi)被膜中表達(dá)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的內(nèi)被膜中所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia的表達(dá)增加了所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的光合速率至少8％、葉綠素水平至少15％和/或生物質(zhì)至少33％。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在lciat2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+33％·鮮重：+54％·干重：+41％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在lciat2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+93％/+33％·葉綠素含量：+11％/+16％·葉片數(shù)量：+17％/+19％·鮮重：+nd/+54％·干重：nd/+41％在本發(fā)明的另一個(gè)方面，“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)的所述基因產(chǎn)物是萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的基質(zhì)中表達(dá)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的基質(zhì)中所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib的表達(dá)增加了所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的生物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在lcibt2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+23％·鮮重：+30％·干重：+28％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在lcibt2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+78％/+23％·葉綠素含量：+10％/+15％·葉片數(shù)量：+27％/+24％·鮮重：+nd/+30％·干重：+nd/+28％本發(fā)明的一個(gè)方面還涉及用于制備經(jīng)基因修飾的高等植物的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面還涉及經(jīng)基因修飾的高等植物的用途，其中該高等植物的修飾，與野生型對(duì)照相比，增加了所述經(jīng)基因修飾的高等植物所生成的天然和/或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的產(chǎn)率。本發(fā)明的另一個(gè)方面是經(jīng)基因修飾的高等植物的用途，其中經(jīng)基因修飾的高等植物所產(chǎn)生的天然產(chǎn)物選自植株的花、果實(shí)、種子、堅(jiān)果、葉、莖和/或任何其他適于商業(yè)化部分。本發(fā)明的又一個(gè)方面是經(jīng)基因修飾的高等植物的用途，其中經(jīng)基因修飾的高等植物所生成的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物選自核酸、蛋白質(zhì)、肽和/或通過(guò)轉(zhuǎn)基因方式生成的任何其他代謝產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，上述經(jīng)基因修飾的高等植物是c3植物，在另一個(gè)方面，所述經(jīng)基因修飾的高等植物是c4植物。本發(fā)明的又一個(gè)方面是本發(fā)明的方法用于增加經(jīng)基因修飾的高等植物(c3植物或c4植物)的t1和/或t2的和/或任何后續(xù)世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征的用途。本發(fā)明的又一個(gè)方面是本發(fā)明的方法用于制備經(jīng)基因修飾的高等植物的用途，該經(jīng)基因修飾的高等植物能夠在這樣的氣候和/或營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)：該條件不允許野生型對(duì)照生長(zhǎng)或野生型對(duì)照僅以低效率生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一些方面，c3植物屬于雙子葉植物綱(dicotyledons)，在其他方面，屬于茄目(solanales)，在又一個(gè)方面，屬于茄科(solanaceae)，在又一個(gè)方面，屬于煙草屬(nicotiana)，在又一個(gè)方面，c3植物是煙草植物(nicotianatabacum)。在本發(fā)明的一些方面，所公開(kāi)的用途是增加經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2的和/或任何后續(xù)世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所公開(kāi)的用途是制備經(jīng)基因修飾的高等植物，該經(jīng)基因修飾的高等植物能夠在這樣的氣候和/或營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)：該條件不允許野生型對(duì)照生長(zhǎng)或野生型對(duì)照以低效率生長(zhǎng)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，該經(jīng)基因修飾的高等植物選自：稻米、小麥、橘樹(shù)、葡萄植物、咖啡植物、煙草植物、茶植物、花生植物、檸檬樹(shù)、馬鈴薯、胡蘿卜、番茄、桃樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)、芒果樹(shù)、大麥、燕麥、裸麥、黑小麥、干菜豆、大豆、綠豆、蠶豆、豇豆、豌豆、鷹嘴豆、木豆、兵豆、香蕉、椰子、芋頭、薯蕷、甘薯、木薯、甜菜、棉花、黃麻、劍麻、芝麻、向日葵、油菜籽、紅花、馬唐、玉米(玉蜀黍)、莧菜、高粱、粟、甘蔗、香附、馬唐、稗、四翅濱藜和/或藜科植物。在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本公開(kāi)不限于本公開(kāi)的具體方面。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述具體方面的目的，并非旨在進(jìn)行限制。必須指出，如說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求所用，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括單數(shù)和/或復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確表明相反。還應(yīng)當(dāng)理解，在給出由數(shù)值界定的參數(shù)范圍的情況下，該范圍被認(rèn)為包括這些端值。附圖說(shuō)明圖1.萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制(ccm)整合進(jìn)高等植物，例如c3植物圖1示出了不同ccm蛋白在高等植物例如c3植物中的定位。請(qǐng)注意cah1的“非典型”定位。cah1和cah3是指萊茵衣藻的碳酸酐酶。lcia和lcib是指萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。圖2.衣藻屬碳酸酐酶和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在煙草葉綠體(t2植株)中的表達(dá)制備生成cah1、cah3、lcia或lcib的轉(zhuǎn)基因煙草。此處描述了不同ccm蛋白在高等植物(如煙草植物)的細(xì)胞隔室中的定位?？s寫(xiě)“bt”是指內(nèi)源性煙草碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，縮寫(xiě)“ca”指內(nèi)源性煙草碳酸酐酶。a：cah1定位于膜間隙(非典型定位)。b：cah3定位于類(lèi)囊體腔(典型或天然定位)。c：lcia定位于內(nèi)膜(典型或天然定位)。d：lcib定位于基質(zhì)(典型或天然定位)。圖3.轉(zhuǎn)基因t2植物的轉(zhuǎn)錄物表征通過(guò)使用基因特異性引物進(jìn)行rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶pcr)來(lái)確認(rèn)rna轉(zhuǎn)錄物存在于t2植物中。品系1–4是指cah1、cah3、lcia或lcib的轉(zhuǎn)基因品系。使用非轉(zhuǎn)基因煙草作為對(duì)照(wt)。nc是rt-pcr的陰性對(duì)照。第1–4道分別指cah1或cah3轉(zhuǎn)基因在四種不同cah1或cah3轉(zhuǎn)基因t2品系中的積聚；而第1–2道分別指lcia或lcib轉(zhuǎn)基因在lcia或lcib轉(zhuǎn)基因t2品系中的積聚。圖4.轉(zhuǎn)基因t2植株的重組蛋白質(zhì)表征重組蛋白質(zhì)的存在通過(guò)免疫印跡分析進(jìn)行。蛋白質(zhì)的產(chǎn)率(單位μg/g)在右邊示出?！癴w”意指“鮮重”。品系1–4是指cah1、cah3、lcia或lcib的轉(zhuǎn)基因品系。使用非轉(zhuǎn)基因煙草作為對(duì)照(wt)。cah1、lcia和lcib通過(guò)tag54特異性抗體檢測(cè)。cah3使用cah3的特異性抗體檢測(cè)。第1-4道和第1-5道是指不同的轉(zhuǎn)基因植株。圖5.通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察重組蛋白質(zhì)的定位圖5示出了通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到的所有emgfp融合蛋白在經(jīng)基因修飾的高等植物細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白質(zhì)的煙草葉綠體中的正確定位。圖6.重組蛋白質(zhì)在t2煙草葉綠體中發(fā)揮功能圖6示出了在經(jīng)基因修飾的高等植物如煙草的葉綠體中表達(dá)的所有重組蛋白質(zhì)是有功能的。該分析通過(guò)測(cè)定碳酸酐酶(ca)活性分析進(jìn)行。該測(cè)定發(fā)生在5.5周齡植物中，所有值均為平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)；每次分析的植株數(shù)量(n＝4)。生成cah1和cah3的植株顯示出體外ca活性。生成lcia或lcib碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)基因品系顯示出高ca活性。lcia和lcib表達(dá)影響內(nèi)源性植物ca活性。縮寫(xiě)“t.c.”表示“非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡??！皐t”意指野生型對(duì)照(未經(jīng)修飾的煙草植物)。圖7.轉(zhuǎn)基因t2品系中更高的葉綠素含量圖7示出了轉(zhuǎn)基因t2品系中的葉綠素含量增加。使用spad-設(shè)備(konicaminolta)測(cè)定8.5周齡煙草植物，以測(cè)試葉綠素a+b的含量。與野生型和非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，所有轉(zhuǎn)基因品系具有顯著(p<0.0005)較高的葉綠素含量?？s寫(xiě)“t.c.”表示“非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡??！皐t”意指野生型對(duì)照(未經(jīng)修飾的煙草植物)。圖8.轉(zhuǎn)基因品系在發(fā)育的早期的生長(zhǎng)增強(qiáng)圖8a：示出了ms平板中的3周齡小株(煙草)。+/-是指ms平板中存在或不存在卡那霉素選擇性。與野生型對(duì)照相比(wt)，在所有轉(zhuǎn)基因植株中，苗的生物質(zhì)、葉片數(shù)量和總?cè)~片面積增加?？s寫(xiě)“t.c.”表示“非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?。圖8b：示出了土壤中的4.5周齡植物。與野生型對(duì)照相比(wt)，在所有轉(zhuǎn)基因植株中，苗的生物質(zhì)、葉片數(shù)量和總?cè)~片面積也增加。圖9.煙草t2轉(zhuǎn)基因品系的生長(zhǎng)增強(qiáng)圖9a示出了具有轉(zhuǎn)基因ccm蛋白的煙草植物的生長(zhǎng)增強(qiáng)。每周測(cè)定5至8周齡植物的葉片面積。以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。植株的數(shù)量(n＝6)。圖9b示出了具有l(wèi)cia的8周齡煙草植物的生長(zhǎng)增強(qiáng)?？扇菀椎赜^察到葉片大小較大。圖10.t2轉(zhuǎn)基因品系的早開(kāi)花表型圖10示出了t2轉(zhuǎn)基因品系的早開(kāi)花表型。轉(zhuǎn)基因植物花比野生型和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵?.5-2周。所有植物均為8周齡。圖11.葉片大小增加圖11示出了8周齡植物的葉片大小增加。圖12.t2轉(zhuǎn)基因品系的葉片的淀粉含量增加圖12示出了與野生型相比，在所有轉(zhuǎn)基因品系的光照期結(jié)束時(shí)，淀粉水平顯著增加。對(duì)6周齡植物的葉片進(jìn)行淀粉分析。圖13.轉(zhuǎn)基因植物的光合作用增強(qiáng)。在植物7-8周齡時(shí)進(jìn)行分析。nwt＝7；ncah1＝8；ncah3＝10；nlcia＝11；nlcib＝3。圖14.cah1的核酸序列圖15.cah3的核酸序列圖16.lcia的核酸序列圖17.lcib的核酸序列圖18.在缺氮(氮含量少75％)的水耕栽培中生長(zhǎng)的t4轉(zhuǎn)基因品系顯示出生長(zhǎng)增強(qiáng)圖19示出了6周齡lcia和lcib轉(zhuǎn)基因煙草植物的生長(zhǎng)增強(qiáng)?？扇菀椎赜^察到，與野生型(wt)和非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ?t.c.)相比，lcia和lcib植物的葉片大小較大。具體實(shí)施方式本公開(kāi)涉及經(jīng)基因修飾的高等植物及其后續(xù)世代，所述經(jīng)基因修飾的高等植物包括“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)的至少一種基因產(chǎn)物(如mrna或蛋白質(zhì))的穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)，其中該表達(dá)在高等植物的葉綠體的膜間隙和/或一個(gè)或多個(gè)亞細(xì)胞隔室中發(fā)生，并且其中該表達(dá)增加了經(jīng)基因修飾的高等植物(t0)的和/或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何其他世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征。在一些方面，還公開(kāi)了所述經(jīng)基因修飾的高等植物的更快生長(zhǎng)和更早開(kāi)花。其中術(shù)語(yǔ)“高等植物”是指具有維管組織木質(zhì)部和韌皮部的許多植物。維管植物包括所有種子植物(裸子植物和被子植物)和羊齒植物(包括蕨類(lèi)、石松門(mén)和木賊)。也稱(chēng)為導(dǎo)管植物。在一個(gè)方面，該術(shù)語(yǔ)涵蓋c3植物。在另一個(gè)方面，涵蓋c4植物。其中術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定表達(dá)”涉及基因持續(xù)超過(guò)數(shù)周或數(shù)月或甚至數(shù)年時(shí)間的持續(xù)表達(dá)(從而持續(xù)生成重組蛋白質(zhì)和/或其他基因產(chǎn)物)。在一個(gè)方面，該表達(dá)在后續(xù)世代，諸如t1、t2和后續(xù)世代進(jìn)行。從而，經(jīng)基因修飾的高等植物的后代中攜帶遺傳信息?；蚩烧线M(jìn)高等植物基因組中和/或葉綠體的遺傳信息(擬核)中和/或細(xì)胞或細(xì)胞器(諸如例如線粒體)中存在的任何其他dna組分中。術(shù)語(yǔ)“瞬時(shí)表達(dá)”是指基因在一段很短的時(shí)間期(幾小時(shí)、幾天、幾周)內(nèi)的瞬間表達(dá)(因此瞬間生成重組蛋白質(zhì)和/或其他基因產(chǎn)物)。不受該方法的嚴(yán)格束縛，通常瞬時(shí)表達(dá)由導(dǎo)入細(xì)胞的人工質(zhì)粒促進(jìn)。本文的術(shù)語(yǔ)“經(jīng)基因修飾的高等植物”涉及遺傳物質(zhì)已通過(guò)基因工程技術(shù)改變的高等植物。經(jīng)基因修飾的高等植物可以是經(jīng)基因修飾的食品的來(lái)源，并且還廣泛用于科學(xué)研究以及制造商品而非食品。術(shù)語(yǔ)經(jīng)基因修飾的高等植物還涵蓋如下定義：“具有通過(guò)使用現(xiàn)代生物技術(shù)獲得的遺傳物質(zhì)的新組合的高等植物”。本文的術(shù)語(yǔ)“c3植物”涉及單獨(dú)以c3固定存活的植物。c3碳固定通過(guò)以下反應(yīng)將二氧化碳和核酮糖二磷酸(rubp，5碳糖)轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸：co2+rubp→(2)3-磷酸甘油酸本文的術(shù)語(yǔ)“c4植物”涉及使用至少一條潛在的c4碳固定途徑的植物。在c4植物中，繞過(guò)了c3植物中存在的光呼吸途徑。c4植物形成了將co2更有效地遞送至rubisco酶的機(jī)制。它們利用了特定的葉片解剖結(jié)構(gòu)，其中葉綠體不僅存在于葉片外部的葉肉細(xì)胞中，而且還存在于維管束鞘細(xì)胞中。co2不在卡爾文(calvin)循環(huán)中直接固定到rubisco，而是摻入4碳有機(jī)酸，它能夠在維管束鞘細(xì)胞的葉綠體中再生co2。然后維管束鞘細(xì)胞可利用該co2通過(guò)常規(guī)的c3途徑生成碳水化合物。c4途徑存在很多變型：·從葉肉細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的4碳酸可以是蘋(píng)果酸或天冬氨酸。·從維管束鞘細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)回的3碳酸可以是丙酮酸或丙氨酸?！ぴ诰S管束鞘細(xì)胞中催化脫羧作用的酶可不同。在玉蜀黍和甘蔗中，該酶是nadp-蘋(píng)果酸酶；在粟中，該酶是nad-蘋(píng)果酸酶；在大黍中，該酶是pep羧化激酶。然而，本發(fā)明對(duì)任何這些變型均有效。本文的術(shù)語(yǔ)“植株世代”、“后續(xù)世代”、“t0世代”、“t1世代”、“t2世代”涉及在轉(zhuǎn)化事件之后植株的連續(xù)世代。親本轉(zhuǎn)化植株是t0，其直接子代是t1，t1的子代是t2植株等。后續(xù)世代可包括t3、t4、t5和/或任何后續(xù)世代。然而，特別關(guān)注的是t0至t2及其后世代的轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定性。本文的術(shù)語(yǔ)“萊茵衣藻co2濃縮機(jī)制”(ccm)涉及在萊茵衣藻中鑒定的濃縮co2的機(jī)制。ccm可基于不同的生物化學(xué)機(jī)制，諸如c4光合作用和景天酸代謝(cam)，基于ci的主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，或基于涉及通過(guò)特定細(xì)胞隔室的酸化來(lái)局部提高co2濃度的過(guò)程(giordano等人，2005)。ccm的作用是提高用于rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)的co2濃度，該酶負(fù)責(zé)co2的最初固定。因此，ccm可用于不同co2濃縮機(jī)制的領(lǐng)域。因此，為清晰起見(jiàn)，現(xiàn)指出在本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“ccm”永遠(yuǎn)僅涉及萊茵衣藻的ccm。所提出的濃縮萊茵衣藻中的co2的模型如圖1所示。圖的左部表示所提出的衣藻屬中的ccm模型，而圖1的右部表示本發(fā)明的將co2濃縮機(jī)制的酶整合進(jìn)高等植物的葉綠體的策略。萊茵衣藻的核編碼的碳酸酐酶(cah1和cah3)和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(clcia和lcib)將在植物葉綠體的不同位置表達(dá)，以提高rubisco部位的co2濃度。lcia*表示靶向信號(hào)序列的修飾，以允許重組蛋白質(zhì)整合進(jìn)類(lèi)囊體膜。在該模型中，ccm可分為兩個(gè)階段。ccm的第一階段涉及從環(huán)境獲取無(wú)機(jī)碳，并將co2和hco3-遞送至葉綠體。該部分ccm的組分將包括周質(zhì)空間中的ca(碳酸酐酶)(cah1和可能地cah8)和細(xì)胞質(zhì)中的ca(cah9)，以及原生質(zhì)膜和葉綠體被膜二者上的hco3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和co2通道。所提出模型的第二部分利用類(lèi)囊體膜兩側(cè)的ph梯度引發(fā)葉綠體基質(zhì)中hco3-水平升高。該部分ccm包括位于葉綠體基質(zhì)的ca(cah6)和位于類(lèi)囊體腔內(nèi)的ca(cah3)以及類(lèi)囊體膜上的hco3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，萊茵衣藻具有嚴(yán)格的c3生物化學(xué)，因?yàn)榕c其中轉(zhuǎn)運(yùn)的碳以有機(jī)c4存儲(chǔ)的c4途徑不同，萊茵衣藻將無(wú)機(jī)碳特別是hco3-積聚于葉綠體基質(zhì)中。此外，雖然實(shí)驗(yàn)表明，海洋硅藻威氏海鏈藻(thalassiosiraweisflogii)具有類(lèi)c4途徑，但相同的研究人員推斷類(lèi)c4途徑不可能在綠藻中工作(reinfelder等人，2004)。除已顯示出作為萊茵衣藻中ccm的一部分的許多ca之外，還討論了在ccm中發(fā)揮作用的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的兩種lcia和lcib是本發(fā)明特別關(guān)注的。lcia也稱(chēng)為nar1.2。lcia/nar1.2首先稱(chēng)為亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且與細(xì)菌亞硝酸鹽/甲酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族具有很強(qiáng)的相似性。nar1.2屬于由萊茵衣藻中六個(gè)nar基因組成的基因家族，意外的是，這些基因與擬南芥屬(arabidopsis)或任何其他高等植物的同源性不明顯。nar1.2的表達(dá)在低co2條件下誘導(dǎo)，并且部分在其他ccm基因表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄因子cia5的控制下(miura等人，2004)。預(yù)期nar1.2定位于葉綠體類(lèi)囊體或葉綠體被膜，并且具有六個(gè)跨膜域。nar1.2在爪蟾(xenopus)卵母細(xì)胞中的功能表達(dá)顯示，與對(duì)照相比，nar1.2的存在使進(jìn)入卵母細(xì)胞的碳酸氫鹽增加兩倍(mariscal等人，2006)。本發(fā)明的一部分是，據(jù)發(fā)現(xiàn)與野生型對(duì)照相比，可在生成lcia或lcib碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)基因品系中測(cè)定到更高的碳酸酐酶活性，表明lcia和lcib表達(dá)影響了內(nèi)源性植物碳酸酐酶的活性。lcib與其他生物的蛋白質(zhì)不具有任何顯著同源性，但其預(yù)測(cè)氨基酸序列與萊茵衣藻基因組中三個(gè)基因lcic、lcid和lcie的預(yù)測(cè)氨基酸序列具有相似性。在低co2條件下lcic和lcid也上調(diào)。雖然這些觀察結(jié)果指向lcib在適應(yīng)低co2的作用，但預(yù)計(jì)lcib本身不可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因?yàn)樗狈θ魏问杷缒び?。因此，lcib被認(rèn)為具有相當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)作用或可以是轉(zhuǎn)運(yùn)ci(無(wú)機(jī)碳(ci＝co2+hco3-))的復(fù)合物的一部分(van等人，2001)。術(shù)語(yǔ)“膜間隙”涉及線粒體或葉綠體的內(nèi)膜和外膜之間的區(qū)域。膜間隙的主要功能是氧化磷酸化。這與術(shù)語(yǔ)“周質(zhì)空間”形成對(duì)比，周質(zhì)空間是革蘭氏陰性菌中兩個(gè)可選擇性滲透屏障，即作為革蘭氏陰性菌的內(nèi)膜(即細(xì)胞質(zhì)膜)和外膜的生物膜所界定的空間。本文的術(shù)語(yǔ)“葉綠體的亞細(xì)胞隔室”涉及葉綠體的不同結(jié)構(gòu)實(shí)體。而在c3植物中，葉綠體通常為透鏡形，直徑5–8μm、厚1–3μm，與藻類(lèi)中存在的葉綠體形狀有很大的差異。而例如衣藻屬中的葉綠體的形狀則像杯子。然而，所有葉綠體具有至少三個(gè)膜系統(tǒng)—葉綠體外膜、葉綠體內(nèi)膜和類(lèi)囊體系統(tǒng)。作為次級(jí)內(nèi)共生產(chǎn)物的葉綠體可具有另外的圍繞這三個(gè)膜的膜。在葉綠體外膜和內(nèi)膜內(nèi)部的是葉綠體基質(zhì)，構(gòu)成大部分葉綠體體積的半凝聚樣流體，其中漂浮著類(lèi)囊體系統(tǒng)(被類(lèi)囊體腔填充的類(lèi)囊體膜)。因此，當(dāng)本發(fā)明使用術(shù)語(yǔ)“葉綠體的亞細(xì)胞隔室”時(shí)，其包括至少葉綠體外膜、膜間隙、葉綠體內(nèi)膜、葉綠體基質(zhì)、類(lèi)囊體膜和類(lèi)囊體腔。本文所用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)被膜”有時(shí)指葉綠體內(nèi)膜。術(shù)語(yǔ)“典型定位”和“非典型定位”是指ccm相關(guān)蛋白，諸如例如lcia、lcib、cah1和cah3在源細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)的定位?！暗湫投ㄎ弧被颉疤烊欢ㄎ弧焙wccm相關(guān)蛋白的所有定位，類(lèi)似于在天然來(lái)源如萊茵衣藻的葉綠體隔室中的定位。這與“非典型”定位形成對(duì)比，在“非典型”定位中ccm相關(guān)蛋白定位于葉綠體和/或細(xì)胞的隔室，此處天然不存在。然而，萊茵衣藻和高等植物細(xì)胞的細(xì)胞隔室有時(shí)所指之處是不同的。因此，應(yīng)根據(jù)本發(fā)明利用下表來(lái)定義“相似的隔室”：表1：隔室的比較萊茵衣藻的隔室高等植物的葉綠體的隔室外(細(xì)胞)膜質(zhì)膜/原生質(zhì)膜周質(zhì)空間--內(nèi)(細(xì)胞)膜質(zhì)膜/原生質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)葉綠體外膜葉綠體外膜膜間隙膜間隙葉綠體內(nèi)膜/內(nèi)被膜葉綠體內(nèi)膜/內(nèi)被膜基質(zhì)葉綠體基質(zhì)類(lèi)囊體膜類(lèi)囊體膜淀粉核--例如：cah1定位于萊茵衣藻的周質(zhì)空間，因此定位于經(jīng)基因修飾的植物的葉綠體膜間隙將視為“非典型”。相比之下，cah3、lcia、lcib的定位被視為“典型”或“天然”定位，因?yàn)樗鼈兎謩e定位于淀粉核/類(lèi)囊體腔、葉綠體內(nèi)被膜或葉綠體基質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“增加所述經(jīng)基因修飾的c3植物和/或c4植物的t1和/或t2世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征”涉及與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，任何所述特征的增加。而增加可在至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％和至多5％、至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％、至多95％、至多99％、至多100％、至多110％、至多120％、至多130％、至多140％、至多150％、至多160％、至多170％、至多180％、至多190％、至多200％、至多250％、至多260％、至多270％、至多280％、至多290％和/或至多300％之間。然而，在一些方面，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，增加可為至少兩倍(即100％)、三倍(即200％)、四倍(300％)、五倍(400％)、六倍(500％)和至多七倍(600％)、八倍(700％)、九倍(800％)和十倍(900％)。如無(wú)另外說(shuō)明，本文的測(cè)定在植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)進(jìn)行。在本發(fā)明的一些方面，在cah1表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2世代和/或后續(xù)世代的光合速率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％；葉綠素水平提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％；生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％。在本發(fā)明的一些方面，在cah1表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2世代和/或后續(xù)世代的光合速率提高在1％-5％、2％-6％、3％-7％、4％-8％、5％-9％、6％-10％、7％-11％、8％-12％、9％-13％、10％-14％之間；葉綠素水平提高在1％-5％、2％-6％、3％-7％、4％-8％、5％-9％、6％-10％、7％-11％、8％-12％、9％-13％、10％-14％之間；生物質(zhì)增加在10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％之間。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的膜間隙中所述碳酸酐酶cah1的表達(dá)提高了所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的光合速率至少8％、葉綠素水平至少7％和/或生物質(zhì)至少22％。這些植物的葉片數(shù)量也增加。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在cah1t2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+22％·鮮重：+26％·干重：+29％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在cah1t2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+142％/+22％·葉綠素含量：+15％/+13％·葉片數(shù)量：+21％/+24％·鮮重：nd/+26％·干重：nd/+29在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在cah3表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2的和/或任何后續(xù)世代的光合速率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％，葉綠素水平提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％，生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在本發(fā)明的一些方面，在cah3表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2世代和/或后續(xù)世代的光合速率提高在1％-5％、2％-6％、3％-7％、4％-8％、5％-9％、6％-10％、7％-11％、8％-12％、9％-13％、10％-14％之間；葉綠素水平提高在1％-5％、2％-6％、3％-7％、4％-8％、5％-9％、6％-10％、7％-11％、8％-12％、9％-13％、10％-14％之間；生物質(zhì)增加在10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％之間。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的類(lèi)囊體腔中所述碳酸酐酶cah3的表達(dá)，使得在所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代中，與野生型對(duì)照相比，光合速率提高至少8％、葉綠素水平提高至少10％，氣孔大小增加最多50％和/或生物質(zhì)增加至少31％。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在cah3t2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+24％·鮮重：+34％·干重：+31％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在cah3t2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+78％/+24％·葉綠素含量：+11％/+10％·葉片數(shù)量：+26％/+64％·鮮重：nd/+34％·干重：nd/+31％在本發(fā)明的又一個(gè)方面在lcia表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2的和/或任何后續(xù)世代的光合速率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％，葉綠素水平提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％，和/或生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在本發(fā)明的一些方面，在lcia表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2世代和/或后續(xù)世代的光合速率提高在1％-5％、2％-6％、3％-7％、4％-8％、5％-9％、6％-10％、7％-11％、8％-12％、9％-13％、10％-14％之間；葉綠素水平提高在1％-5％、2％-6％、3％-7％、4％-8％、5％-9％、6％-10％、7％-11％、8％-12％、9％-13％、10％-14％之間；生物質(zhì)增加在10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％之間。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的內(nèi)被膜中所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia的表達(dá)提高了所述經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的光合速率至少8％、葉綠素水平至少15％和/或生物質(zhì)至少33％。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在lciat2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+33％·鮮重：+54％·干重：+41％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在lciat2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+93％/+33％·葉綠素含量：+11％/+16％·葉片數(shù)量：+17％/+19％·鮮重：nd/+54％·干重：nd/+41％在本發(fā)明的一個(gè)方面，在lcib表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2的和/或任何后續(xù)世代的生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在lcib表達(dá)的情況下，與未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，t1和/或t2世代和/或后續(xù)世代的生物質(zhì)增加在10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％之間。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，葉片面積增加23％，鮮重增加30％，干重增加28％，葉片數(shù)量增加24％，葉綠素增加15％。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，與野生型對(duì)照相比，在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的基質(zhì)中所述碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib的表達(dá)增加了所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2世代或任何后續(xù)世代的生物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在lcibt2植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，定義生物質(zhì)的三個(gè)參數(shù)增加：·葉片面積：+23％·鮮重：+30％·干重：+28％在本發(fā)明的又一個(gè)方面，在lcibt2植物的第3周和營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，與野生型對(duì)照相比，百分比增加如下(在第3周的百分比增加/在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)的百分比增加；nd：不確定)：·葉片面積：+78％/+23％·葉綠素含量：+10％/+15％·葉片數(shù)量：+27％/+24％·鮮重：nd/+30％·干重：nd/+28％在另一個(gè)方面，在lcib表達(dá)的經(jīng)基因修飾的高等植物的t2世代的第6周，葉片面積增加78％，葉片數(shù)量增加24％，葉綠素增加10％。在一個(gè)方面，在cah3表達(dá)的情況下，葉片面積增加約80％，在lcia表達(dá)的情況下，增加約154％，在lcib表達(dá)的情況下，增加約171％，或在cah1表達(dá)的情況下，甚至增加約260％。在另一個(gè)方面，在cah1表達(dá)的情況下，葉綠素水平提高約6.7％，或在lcia表達(dá)的情況下約11.5％。在又一個(gè)方面，與野生型植物相比，對(duì)于cah1，葉片面積增加22％(p<0.005)，對(duì)于cah3，24％(p<0.005)，對(duì)于lcia，33％(p<0.005)以及對(duì)于lcib，23％(p<0.005)；對(duì)于cah1，鮮重(fw，“鮮重”)增加26％(p<0.005)，對(duì)于cah3，34％(p<0.005)，對(duì)于lcia，54％(p<0.0005)以及對(duì)于lcib，30％(p<0.005)；對(duì)于cah1，干重(dw)增加29％(p<0.005)，對(duì)于cah3，31％(p<0.005)，對(duì)于lcia，41％(p<0.005)以及對(duì)于lcib，28％(p<0.005)(參見(jiàn)實(shí)例部分的表3)。例如，可觀察到以下增加：例如，葉片數(shù)量(2-6)和表面積(最多33％)增加；鮮重(26-54％)和干重(28-54％)增加；在cah3和lcia轉(zhuǎn)基因品系中，氣孔大小增加(最多51％)，氣孔數(shù)量和密度減少；在cah3植物中，很多莖在早期發(fā)育；在lcia品系中，葉片更光滑、更大。技術(shù)人員將清楚，本發(fā)明的經(jīng)基因修飾的高等植物可包括cah1、cah3、lcia或lcib的單個(gè)轉(zhuǎn)基因，或ccm機(jī)制的任何其他成員(如cah6)，或這些轉(zhuǎn)基因在一個(gè)植株中的許多組合。如cah1和lcia、cah3和lcib、cah1和cah3、lcia和lcib等。如技術(shù)人員可容易地從圖2、結(jié)果和實(shí)驗(yàn)推斷的那樣，經(jīng)基因修飾的高等植物可根據(jù)個(gè)別需要定制。因?yàn)槟切┙M合具有另外的作用，具有單個(gè)轉(zhuǎn)基因和僅稍微改善的特征的植株可通過(guò)添加ccm機(jī)制的另外轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步改善。因此，本發(fā)明還涵蓋所涉及的ccm物類(lèi)(cah1、cah3、lcia、lcib)的兩者、三者或全部四者的組合，或甚至與ccm機(jī)制的其他成員(如cah6)的組合。本文涉及的植物特征增加的計(jì)算可通過(guò)下式進(jìn)行：從上式可顯而易見(jiàn)，只要在經(jīng)基因修飾的植物和未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照之間測(cè)試相同特征，并且將相同的測(cè)試系統(tǒng)用于測(cè)試，百分比增加與所測(cè)定特征的單位無(wú)關(guān)。可增加的特定特征包括經(jīng)基因修飾的高等植物本身(t0)或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t1或所述經(jīng)基因修飾的高等植物的t2世代和/或任何其他世代的光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)。如上所述，本文的特征測(cè)定通常在植物的營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)進(jìn)行。在脫離此規(guī)則之處，將明確說(shuō)明。例如，“光合速率”可通過(guò)co2的攝取、o2的生成、碳水化合物的生成和/或干重(如收集植物、干燥至恒重并稱(chēng)重)的增加測(cè)定。例如，“光合碳固定”可通過(guò)痕量nah14co3的攝取測(cè)定。然后通過(guò)過(guò)濾顆粒物和通過(guò)測(cè)定其放射性或通過(guò)酸化和鼓泡技術(shù)(其測(cè)定顆粒和溶解產(chǎn)物二者)確定該組合。例如，“葉綠素水平”可通過(guò)分光光度法、高效液相色譜法(hplc)和/或熒光測(cè)定法測(cè)定。例如，“生物質(zhì)”可通過(guò)葉片面積、全植株重量(干重，如收集植物、干燥至恒重并稱(chēng)重)和/或葉片數(shù)量測(cè)定。技術(shù)人員理解，光合速率增加也可導(dǎo)致生物質(zhì)增加和/或碳固定增加，反之亦然。不同特征的測(cè)定也可根據(jù)實(shí)例部分所述的測(cè)試進(jìn)行(不受這些測(cè)試的束縛)。合適的測(cè)試為例如：種子重量和數(shù)量、代謝物分析、碳水化合物含量諸如淀粉含量或糖含量、新鮮和干燥生物質(zhì)等。在一個(gè)方面，萊茵衣藻ccm的任何成員可用于增加植物特征。然而，在另一個(gè)方面，ccm的基因產(chǎn)物選自萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia、碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib、碳酸酐酶cah1和/或碳酸酐酶cah3。在一些方面，ccm的基因產(chǎn)物是在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的膜間隙穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)的萊茵衣藻的碳酸酐酶cah1。在一些方面，與相同齡期、相同栽培品種和在相同條件下生長(zhǎng)的未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，葉綠體的膜間隙中的此類(lèi)表達(dá)使葉綠素水平提高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％；和/或使生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些方面，ccm的基因產(chǎn)物是在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的類(lèi)囊體腔穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)的萊茵衣藻的碳酸酐酶cah3。在一些方面，與相同齡期、相同栽培品種和在相同條件下生長(zhǎng)的未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，葉綠體的膜間隙中的此類(lèi)表達(dá)使光合速率增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少7％、至少9％或至少10％；使葉綠素水平提高至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％；和/或使生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些方面，與野生型對(duì)照相比，經(jīng)基因修飾的高等植物生長(zhǎng)得更快和/或營(yíng)養(yǎng)期更短。在一些方面，ccm的基因產(chǎn)物是在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的膜間隙穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)的萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcia。在一些方面，與相同齡期、相同栽培品種和在相同條件下生長(zhǎng)的未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，葉綠體的內(nèi)被膜中的此類(lèi)表達(dá)使光合速率增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少7％、至少9％或至少10％；使葉綠素水平提高至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％；和/或使生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些方面，ccm的基因產(chǎn)物是在經(jīng)基因修飾的高等植物的葉綠體的膜間隙穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)的萊茵衣藻的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lcib。在一些方面，與相同齡期、相同栽培品種和在相同條件下生長(zhǎng)的未經(jīng)修飾的野生型對(duì)照植物相比，葉綠體的基質(zhì)中的此類(lèi)表達(dá)使生物質(zhì)增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。本發(fā)明還涉及制備本文所述的經(jīng)基因修飾的高等植物的方法。此外，本發(fā)明還涉及使用經(jīng)基因修飾的高等植物，來(lái)提高與野生型對(duì)照相比，所述經(jīng)基因修飾的高等植物所生成的天然和/或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的產(chǎn)率的用途。此類(lèi)“天然產(chǎn)物”可以是花、種子、果實(shí)、植物、堅(jiān)果、油、蛋白質(zhì)、肽、核酸、代謝物諸如醇、抗氧化劑、有機(jī)酸、多元醇、氨基酸、維生素和/或核苷酸、木材、纖維、葉片或所述經(jīng)修飾的有機(jī)植物增量生成的并且可從該植物收集的任何其他物質(zhì)。通常此類(lèi)天然產(chǎn)物是植物的具有商業(yè)用途部分。技術(shù)人員理解，本發(fā)明可應(yīng)用于c3以及c4植物二者。c3植物的例子包括稻米、小麥、橘樹(shù)、葡萄植物、咖啡植物、煙草植物、茶植物、花生植物、檸檬樹(shù)、馬鈴薯、胡蘿卜、番茄植物、桃樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)、芒果樹(shù)和大麥；從此類(lèi)植物收集的天然產(chǎn)物可以是例如稻粒、小麥粒、橘果、葡萄、咖啡豆、煙草葉片、茶葉和茶芽、花生、檸檬、馬鈴薯、胡蘿卜、番茄、桃、蘋(píng)果、梨、芒果或大麥粒等。另外的例子包括燕麥、裸麥、黑小麥、干菜豆、大豆、綠豆、蠶豆、豇豆、豌豆、鷹嘴豆、木豆、兵豆、香蕉、椰子、芋頭、薯蕷、甘薯、木薯、甜菜、棉花、黃麻、劍麻、芝麻、向日葵、油菜籽和紅花。另外的例子包括谷類(lèi)、豆類(lèi)、果類(lèi)、根部和塊莖、油料作物、纖維作物和喬木。就c4植物而言，例子包括來(lái)源于馬唐、玉米(玉蜀黍)、莧菜、高粱、粟、甘蔗、香附、馬唐、稗、四翅濱藜和藜科植物的任何產(chǎn)物。然而，此類(lèi)天然產(chǎn)物還包括例如來(lái)源于稻米的支鏈淀粉、來(lái)源于馬鈴薯的淀粉、來(lái)源于煙草的尼古丁、來(lái)源于咖啡或茶植物的咖啡因等。在一些方面，可從根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)基因修飾的高等植物制備生物柴油和/或生物乙醇?！稗D(zhuǎn)基因產(chǎn)物”包括非野生型植物天然生成，而是由于通過(guò)除基因修飾(其使植物特征增加)之外的轉(zhuǎn)基因和/或生物技術(shù)方法將包含一個(gè)或多個(gè)編碼基因產(chǎn)物的基因的核酸引入植物而生成的任何產(chǎn)物。此類(lèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括核酸、蛋白質(zhì)、肽和/或通常非該植物生成的任何其他代謝物諸如醇、抗氧化劑、有機(jī)酸、多元醇、氨基酸、維生素和/或核苷酸。在一些方面，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可包括藥物活性物質(zhì)，也稱(chēng)為活性成分(ai)、活性藥物成分(api)或有時(shí)也成為植物藥物。作為活性成分(ai)，包括具有生物活性的任何物質(zhì)。此類(lèi)成分可用于動(dòng)物或人類(lèi)藥物，或可以例如是殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑、抗生素等等。例如，在一個(gè)方面，疫苗、酶、抗體和/或激素由經(jīng)修飾的植物生成。本發(fā)明還涉及增加經(jīng)基因修飾的高等植物的t1和/或t2的和/或任何后續(xù)世代的選自光合速率、光合碳固定、葉綠素水平和/或生物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特征的方法的用途。此類(lèi)用途可包括增加經(jīng)基因修飾的高等植物的抗性或耐久性能力，以增加在其天然環(huán)境中的可持續(xù)性。在其他方面，該方法用于增加經(jīng)基因修飾的高等植物的抗性或耐久性能力，以允許該植物在野生型對(duì)照植物難以生存的條件下生長(zhǎng)。在一些方面，涵蓋了該方法用于制備經(jīng)基因修飾的高等植物的用途，該經(jīng)基因修飾的高等植物能夠在這樣的氣候和/或營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)：該條件不允許野生型對(duì)照生長(zhǎng)。在其他方面，經(jīng)基因修飾的高等植物屬于雙子葉植物綱，屬于茄目，屬于茄科和/或?qū)儆跓煵輰?。在一個(gè)方面，經(jīng)基因修飾的高等植物是煙草植物(nicotianatabacum)。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”或“核酸”旨在表示cdna、基因組dna、合成dna或rna、肽核酸(pna)或lna來(lái)源的任何單鏈或雙鏈核酸分子。術(shù)語(yǔ)“突變”是指單個(gè)或多個(gè)核苷酸三聯(lián)體的置換或替換、一個(gè)或多個(gè)密碼子的插入或缺失、不同基因之間的同源或異源重組、另外的編碼序列融合至編碼序列的任一端、或插入另外的編碼序列或這些方法的任何組合，它們產(chǎn)生編碼所需蛋白質(zhì)的多核酸序列。因此，術(shù)語(yǔ)“突變”還指一個(gè)或多個(gè)上述變化修飾的多核酸序列編碼的多肽序列的所有變化。本公開(kāi)還涉及包含本公開(kāi)的核苷酸分子的載體。術(shù)語(yǔ)“載體”包括能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另外的核酸的核酸分子。一種類(lèi)型的載體是“質(zhì)?！?，它是指可連接另外的dna片段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。另一種類(lèi)型的載體是其中另外的dna片段可連接至病毒基因組的病毒載體。某些載體能夠在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和附加體哺乳動(dòng)物載體的細(xì)菌載體)。其他載體(如，非附加體哺乳動(dòng)物載體)可在引入宿主細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠引導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中稱(chēng)為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱(chēng)“表達(dá)載體”)。一般來(lái)講，重組dna技術(shù)所用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用形式的載體。然而，本公開(kāi)旨在包括這些具有等同功能的其他形式的表達(dá)載體，諸如病毒載體(如，復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。一般來(lái)講，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很好地構(gòu)建載體和設(shè)計(jì)方案，用于重組基因表達(dá)。載體構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，并且可適于結(jié)合本文提供的重組融合多肽的使用。例如，轉(zhuǎn)基因植物制備是已知的，并且構(gòu)建體生成和植物制備可根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)改進(jìn)。在一些方面，植物中的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是所期望的。一般來(lái)講，本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可用于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)或栽培植物、植物細(xì)胞和/或植物組織(如克隆植物、克隆植物細(xì)胞、克隆根、克隆根系、芽、發(fā)芽幼苗、植物等)，分別用于生物質(zhì)制備或重組多肽和代謝物制備。在本公開(kāi)的一些方面，分離例如用于疫苗產(chǎn)物、酶、抗體、激素等等的重組多肽是所期望的。當(dāng)根據(jù)本公開(kāi)從表達(dá)蛋白質(zhì)的植物組織或它們的一部分如根、根細(xì)胞、植物、植物細(xì)胞制備該蛋白質(zhì)時(shí)，本領(lǐng)域已知的方法可用于任何部分或完整的分離的植物體。當(dāng)希望從表達(dá)產(chǎn)物的一些或所有植物細(xì)胞或組織分離該表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，可利用任何可用的純化技術(shù)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉一系列廣泛的分級(jí)和分離工序(參見(jiàn)例如scopes等人,proteinpurificationprinciplesandpractice,第3版,janson等人,1993,proteinpurificationprincipleshighresolutionmethods,andinventions,wiley-vch,1998,springer-verlag,ny,1993和roe,proteinpurificationtechniques,oxforduniversitypress,2001，每個(gè)參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，獲得所需的重組融合多肽產(chǎn)物的方法是提取?？商崛≈参矬w(如，根、葉片等)，以從殘留的生物質(zhì)移除所需的產(chǎn)品，從而提高產(chǎn)物的濃縮和純度。可在緩沖液中提取植物。例如，可以按重量計(jì)一比一的比率將植物體轉(zhuǎn)移至一定量的冰冷水(已使用如磷酸鹽緩沖液緩沖)中?？筛鶕?jù)需要加入蛋白酶抑制劑?？赏ㄟ^(guò)劇烈混合或研磨破壞植物體，同時(shí)懸浮于緩沖液中，并通過(guò)過(guò)濾或離心移除所提取的生物質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)另外的步驟進(jìn)一步純化溶液中獲得的產(chǎn)物，或通過(guò)冷凍干燥或沉淀轉(zhuǎn)化為干粉?？赏ㄟ^(guò)在壓機(jī)中壓制植物或根，或在它們通過(guò)間隔緊密的輥時(shí)壓碎來(lái)進(jìn)行提取。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法收集和加工來(lái)源于壓碎的植物或根的流體。通過(guò)壓制提取允許以更濃縮的形式釋放產(chǎn)物。在一些方面，可通過(guò)色譜法進(jìn)一步純化多肽，該色譜法包括但不限于陰離子交換色譜(q柱)或超濾。包含his標(biāo)簽的多肽可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用鎳交換色譜純化。在一些方面，所制備的蛋白質(zhì)或多肽不從植物組織分離，而是以活植物(如，發(fā)芽幼苗)的背景提供。在一些方面，當(dāng)植物為可食用時(shí)，直接提供包含表達(dá)蛋白或多肽的植物組織用于消耗。因此，本公開(kāi)提供包含表達(dá)蛋白或多肽的可食用的秧苗生物質(zhì)(如可食用的發(fā)芽幼苗)。另外的加工步驟諸如純化步驟可通過(guò)許多本領(lǐng)域已知的工序進(jìn)行，該工序包括但不限于色譜(如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和體積排阻)、電泳工序(如，制備性等電聚焦)、差別溶解(如，硫酸銨沉淀)或提取。此外，所關(guān)注的分離和純化多肽可進(jìn)一步加工，諸如例如配制成組合物，如藥物組合物。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“工藝”可與術(shù)語(yǔ)“方法”或“工序”互換使用，特別指根據(jù)本公開(kāi)的用于純化重組制備的融合蛋白的過(guò)程步驟的任何組合和/或順序。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“多步驟”工藝用于描述用于純化蛋白質(zhì)和/或肽的工藝，其包括一系列昂貴的和/或費(fèi)力的和/或耗時(shí)的和/或技術(shù)復(fù)雜的純化步驟。作為一般原則，與本公開(kāi)的方法描述的具有一個(gè)或僅具有幾個(gè)步驟工藝相比，多步驟工藝包括用于宿主細(xì)胞的初始破壞和用于從宿主細(xì)胞蛋白和污染物第一次粗分離異源蛋白的至少兩個(gè)明顯分開(kāi)的過(guò)程步驟。通常，這些步驟在至少一個(gè)純化步驟之后再次進(jìn)行。雖然多步驟工藝和本公開(kāi)涉及的工藝還可包括多個(gè)另外的純化步驟，但如果需要更高純度的所關(guān)注的蛋白質(zhì)，這不是本公開(kāi)所述的工藝必須的。本公開(kāi)的生成實(shí)際上不含污染性宿主細(xì)胞蛋白的基本上純的重組融合蛋白的工藝可優(yōu)選地以基本上單個(gè)過(guò)程步驟進(jìn)行。方法和實(shí)例以下提供了本公開(kāi)的實(shí)例、材料和方法。應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)例僅為了說(shuō)明的目的，并且不應(yīng)解釋為以任何方式限制本公開(kāi)。本文引述的所有公開(kāi)、專(zhuān)利和專(zhuān)利發(fā)明全文據(jù)此以引用方式并入，用于所有目的。實(shí)例1：萊茵衣藻cah1、cah3、lcia和lcibcdna的合成萊茵衣藻的cah1(genbank:d90206.1)、cah3(genbank:u73856)、lcia(genbank:ay612639.1)和lcib(genbank:ab168093.1)的編碼序列通過(guò)化學(xué)dna合成獲得(genscript,piscataway,usa)。在合成之前，每個(gè)cdna是根據(jù)煙草密碼子使用而進(jìn)行密碼子優(yōu)化的，以使表達(dá)產(chǎn)量最大化。此外，使用泛型算法同時(shí)為一大組競(jìng)爭(zhēng)參數(shù)而優(yōu)化合成cdna，諸如mrna二級(jí)結(jié)構(gòu)、隱蔽剪接位點(diǎn)、密碼子和基序重復(fù)和均一gc含量。合成cah3、lcia和lcibcdna包含萊茵衣藻的天然轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，使重組cah3、lcia和lcib蛋白分別靶向類(lèi)囊體腔、葉綠體內(nèi)膜和基質(zhì)。合成cah1cdna包含擬南芥(arabidopsisthaliana)的tic22轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，使重組cah1蛋白靶向萊茵衣藻cah1的非典型定位內(nèi)膜間隙。每個(gè)合成構(gòu)建體包含cah1、cah3、lcia或lcibcdna的上游和tag54編碼序列下游的歐芹(petrosilium)查耳酮合酶基因的5’-非翻譯區(qū)。通過(guò)限制性酶位點(diǎn)ecori和xbai將四個(gè)合成cdna單獨(dú)轉(zhuǎn)移至載體puc18。實(shí)例2：cah1、cah3、lcia和lcib分別亞克隆至植物表達(dá)載體為評(píng)估萊茵衣藻cah1、cah3、lcia或lcib分別在煙草cv.petithavanasr1植株中對(duì)碳酸酐酶活性和生物質(zhì)生成的體內(nèi)作用，將每個(gè)編碼cah1、cah3、lcia或lcib的cdna單獨(dú)插入單獨(dú)或融合至emgfpcdna的植物表達(dá)載體ptra。轉(zhuǎn)基因表達(dá)由具有重復(fù)增強(qiáng)子區(qū)的花椰菜(cauliflower)花葉病毒35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。ptra質(zhì)粒包含煙草rb7基因(gi3522871)和ppcv002的nptii盒的支架結(jié)合區(qū)(konzetshell,1986)，用于在含卡那霉素的瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)基因植物。指定的最終構(gòu)建體為：·ptra-35s-attic22-tp:cah1,ptra-35s-attic22-tp:cah1-gfp,·ptra-35s-crtl-tp:cah3,ptra-35s-crtl-tp:cah3-gfp·ptra-35s-crim-tp:lcia,ptra-35s-crim-tp:lcia-gfp·ptra-35s-crs-tp:lcib,ptra-35s-crs-tp:lcib-gfp以下公開(kāi)了植物表達(dá)載體的例子ptra-35s-attic22-tp:cah1的序列(8882bp)：實(shí)例3：煙草植物轉(zhuǎn)化和再生使用genepulserii電穿孔系統(tǒng)(biorad,hercules,ca,usa)根據(jù)制造商的說(shuō)明將植物表達(dá)載體引入根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)gv3101(pmp90rk,gmr,kmr,rifr)細(xì)胞。4–5周齡野生型煙草(n.tabacumcv.petithavanasr1)植株的葉盤(pán)通過(guò)攜帶上述雙元載體的重組根癌農(nóng)桿菌的感染來(lái)轉(zhuǎn)化(dietze等人，1995)。愈傷組織在含50mg/l卡那霉素的murashige-skoog培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且植株從抗性愈傷組織再生。將可能的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移至溫室中的土壤，然后自交產(chǎn)生t1世代。在溫室的13l反應(yīng)釜的de73標(biāo)準(zhǔn)土壤中栽培轉(zhuǎn)基因煙草植物，使用16h自然光光周期和22℃白天/20℃白天/黑夜溫度。使用pcr篩選最多25個(gè)存在整合進(jìn)基因組的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因t0品系(即cah1-1至cah1-25；cah1-gfp-1至cah1-gfp25；cah3-1至cah3-25；cah3-gfp-1至cah3-gfp25；lcia-1至lcia-25；lcia-gfp-1至lcia-gfp-25；lcib-1至lcib-25和lcib-gfp-1至lcib-gfp-25)。pcr分析確認(rèn)所有的分析轉(zhuǎn)基因品系中存在轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)錄物和重組蛋白質(zhì)的積聚分別使用rt-pcr和免疫印跡分析展示。對(duì)于免疫印跡分析，將5周齡煙草植物的完全展開(kāi)的上部葉片在液氮下碾磨成細(xì)粉，使用兩體積提取緩沖液(50mmtris-hclph8、100mmnacl、10mm二硫蘇糖醇(dtt)、5mm乙二胺四乙酸(edta)和0.1％(v/v)tween-20)提取可溶性總蛋白(tsp)。在4℃下以8500×g離心提取物20min，并用于免疫印跡分析。使用兔抗tag54單克隆抗體(rab-tag54；200ng/ml)檢測(cè)重組cah1、cah3、lcia和lcib蛋白。此外，還使用兔抗cah3多克隆抗體(在1×pbs中1:2000稀釋)(antibody-online,aachen,germany)檢測(cè)cah3蛋白。重組蛋白質(zhì)的帶強(qiáng)度使用aida軟件(raytest,straubenhardt,germany)定量，標(biāo)準(zhǔn)物為已知濃度的細(xì)菌親和純化的scfv。雖然全部轉(zhuǎn)基因t0品系均生成lcib重組蛋白質(zhì)，但僅25％和75％的再生品系顯示出可檢測(cè)水平的cah1或lcia蛋白，預(yù)期分子大小分別為51.6kda和36.5kda。分析的t0植物中未檢測(cè)到重組cah3蛋白生成，很明顯是由于低積聚水平和/或檢測(cè)抗體的低靈敏度。重組cah1-gfp、cah3-gfp、lcia-gfp和lcib-gfp蛋白在所有分析的轉(zhuǎn)基因t0品系中均生成。選擇在孟德?tīng)?mendelian)分離后具有最高水平重組蛋白質(zhì)積聚的轉(zhuǎn)基因cah1、lcia和lcib品系來(lái)建立t1世代。由于cah3積聚是基于免疫印跡檢測(cè)水平的，我們選擇在孟德?tīng)?mendelian)分離后的三個(gè)pcr陽(yáng)性t0品系來(lái)建立cah3t1世代。通過(guò)pcr確認(rèn)每個(gè)構(gòu)建體的全部二十五個(gè)分析的t1植株中cah1、cah3、lcia和lcib插入序列的存在。此外，75％的cah3轉(zhuǎn)基因t1品系中cah3轉(zhuǎn)錄物的存在也通過(guò)rt-pcr分析確認(rèn)。重組cah1、cah3、lcia和lcib的積聚類(lèi)似于親代t0品系。t2世代中插入序列存在和重組蛋白質(zhì)積聚也通過(guò)rt-pcr(圖3)和免疫印跡(圖4)確認(rèn)。雖然t2世代中cah3的積聚增加至1μg/g鮮重，但重組cah1、lcia和lcib的積聚類(lèi)似于親代品系(cah1：5μg/g鮮重；lcia：100μg/g鮮重；lcib40μg/g鮮重)。實(shí)例4：碳酸酐酶活性的分析為研究cah1和cah3碳酸酐酶在植物中是否有活性，積聚最高水平重組蛋白質(zhì)的6周齡轉(zhuǎn)基因t2植株中的總碳酸酐酶活性根據(jù)wilbur和anderson(1948)描述的電位測(cè)定方法確定。將20μl系列稀釋(50-375個(gè)單位)的牛紅細(xì)胞的碳酸酐酶溶液(sigmaaldrich,germany)或來(lái)自轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照的植物提取物加入1.48ml20nmveronal緩沖液(727mmnacl、9.12mm二乙基巴比妥鈉、15.63mm5,5’-二乙基巴比妥酸)(ph8.3)，在反應(yīng)室內(nèi)維持于4℃。通過(guò)加入0.5ml冰冷的co2飽和水引發(fā)反應(yīng)，并測(cè)定ph從8.3降至8.0所需的時(shí)間。wa活性單位定義如下：wa單位＝tc/t-1，tc和t是分別在不存在和存在酶溶液的情況下ph下降所需的時(shí)間。由于內(nèi)源性碳酸酐酶的活性，野生型煙草植物和非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ?生成人類(lèi)抗體m12的轉(zhuǎn)基因t2煙草植物)在相同條件下的分析顯示出顯著的背景活性(圖6)。從cah1和cah3植物制備的提取物產(chǎn)生的碳酸酐酶活性比野生型植物顯著更高(分別為208％和188％)(圖6)，表明工程化cah1和cah3具有碳酸酐酶活性。此外，在分別生成重組lcia或lcib的轉(zhuǎn)基因植物的葉片提取物中也觀察到碳酸酐酶活性的顯著增加(183％和179％)，表明萊茵衣藻碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組成型表達(dá)使得內(nèi)源性煙草碳酸酐酶的活性增加。因此，我們推斷工程化重組cah1、cah3、lcia和lcib在轉(zhuǎn)基因t1和t2植物中發(fā)揮作用。實(shí)例5：轉(zhuǎn)基因煙草植物的光合活性重組cah1、cah3、lcia和lcib對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植物的光合性能的作用通過(guò)監(jiān)測(cè)氣體交換參數(shù)確定。使用li-6400系統(tǒng)(li-cor,badhomburg,germany)對(duì)7-8周齡t1和t2煙草植物的完全展開(kāi)的上部葉片進(jìn)行氣體交換測(cè)定。使用以下參數(shù)：光子通量密度1,000mmolm–2s–1、反應(yīng)室溫度26℃、流速150mmols–1、相對(duì)濕度60–70％。co2補(bǔ)償點(diǎn)(γ)通過(guò)測(cè)定400、300、200、100、80、60和40ppmco2下的光合速率來(lái)確定。表觀co2補(bǔ)償(γ)從a/ci曲線通過(guò)回歸分析在曲線的線性范圍內(nèi)推導(dǎo)。相同植物的測(cè)定在4h光照后的后續(xù)兩個(gè)不同的天進(jìn)行。如圖13所示，在環(huán)境條件(400ppmco2、21％o2、24℃)下，所選擇的cah1、cah3、lcia和lcib產(chǎn)生品系的表觀光合速率(a)分別提高12.4％、14％、9％和10％，暗示轉(zhuǎn)基因品系中光合速率的提高反映了在ribisco附近c(diǎn)o2的可獲取性更佳。轉(zhuǎn)基因cah3和lcia產(chǎn)生植物的特征也是表觀co2補(bǔ)償點(diǎn)顯著(p<0.01)降低(分別為3％和2％)，表明光合速率更高。cah1和lcib產(chǎn)生t1和t2品系還顯示出co2補(bǔ)償點(diǎn)降低的趨勢(shì)。此外，在cah3和lcia產(chǎn)生品系中氣孔導(dǎo)度分別顯著增加27％和33％，表明進(jìn)入植物細(xì)胞的co2水平很高。在圖13中，示出了轉(zhuǎn)基因植物中的光合作用增強(qiáng)。在植物7-8周齡時(shí)進(jìn)行分析。nwt＝7；ncah1＝8；ncah3＝10；nlcia＝11；nlcib＝3。實(shí)例6：轉(zhuǎn)基因植物中的葉片淀粉分析為確定萊茵衣藻碳酸酐酶和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)初級(jí)碳代謝的作用，我們?cè)u(píng)估了轉(zhuǎn)基因t2品系和野生型植物積聚光合作用終產(chǎn)物的能力。為確定淀粉水平，在兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，即在光照期開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)收集50mg葉片材料。在液氮中碾磨冰凍的葉片材料并重懸于80％(v/v)乙醇中。提取物在80℃下混合10min，并以4000g離心20min。將沉淀物分別重懸于80％(v/v)和50％(v/v)乙醇中，然后在80℃下混合并如上所述離心。用90％(v/v)乙醇洗滌所得的沉淀物，重懸于400μl0.2koh中，在95℃下溫育1h。最后，將樣品與70μl1m乙酸混合，通過(guò)酶學(xué)方法測(cè)定淀粉含量。在清晨，所有品系的葉片包含低水平的淀粉，但在一天結(jié)束時(shí)觀察到與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因品系中淀粉水平顯著增加(在lcia產(chǎn)生t2品系中，增加最多2.67倍，p&lt；0.005)。在所有轉(zhuǎn)基因品系中測(cè)定的淀粉增加較多，反映了co2同化的改善，這不僅足以支持生長(zhǎng)，而且在葉片中積聚儲(chǔ)存化合物，然后固定該儲(chǔ)存化合物以提供夜間生長(zhǎng)所需的碳。實(shí)例7：積聚萊茵衣藻cah1、cah3、lcia或lcib的植物的表型評(píng)估每周通過(guò)測(cè)定葉片數(shù)量、植株高度和葉片面積來(lái)監(jiān)測(cè)葉綠體中積聚cah1、cah3、lcia或lcib的t1和t2世代轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)，所述葉片面積根據(jù)下式計(jì)算：葉片面積(cm2)＝3.73×(長(zhǎng)度×寬度/100)+0.011×(長(zhǎng)度×寬度/100)2。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锖头窍嚓P(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，產(chǎn)生一種重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因煙草t2品系在完全生長(zhǎng)期顯示出葉片面積顯著增加(表2)。此外，轉(zhuǎn)基因植物在發(fā)育早期具有更多的葉片(多于2-6片)，生長(zhǎng)更快(在5周齡，葉片面積：cah1：增加260％、cah3：增加69％、lcia：增加154％和lcib：增加171％)。更快速生長(zhǎng)使得種子的產(chǎn)生更早(與野生型和非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾龋?.5-2周)。表2*：p<0.005；**：p<0.0005；***：p<0.00005；n.s.無(wú)顯著性當(dāng)植物達(dá)到8周齡時(shí)，監(jiān)測(cè)t2世代的干重和鮮重。如表3所示，在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，所有轉(zhuǎn)基因品系顯示出鮮重和干重顯著增加26％至54％的范圍。表3注：1：在營(yíng)養(yǎng)期結(jié)束時(shí)*：p<0.005；**：p<0.0005實(shí)例8：氮饑餓研究使野生型純合lcia和lcib轉(zhuǎn)基因t4品系在包含100％氮的ms培養(yǎng)基上水耕栽培生長(zhǎng)4周，并在低氮下再生長(zhǎng)2周(氮比正常ms培養(yǎng)基少75％)。與野生型植株相比，6周齡lcia和lcib轉(zhuǎn)基因植物(在氮饑餓之后2周)顯示出苗的鮮重和干重顯著增加(圖18；表4)。有趣的是，我們觀察到根的鮮重和干重也顯著增加(lcia分別為：32％、17％；lcib分別為：56％和45％；表4)。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定硝酸還原酶活性，硝酸還原酶是硝酸鹽同化最重要的酶(可用于綠色植物在土壤中生長(zhǎng)的主要氮形式)。與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因lcia和lcib植物顯示出硝酸還原酶活性顯著增加(lcia：48％和lcib：45％)(圖19)。苗或根鮮重和干重，或野生型和非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g的硝酸還原酶活性無(wú)顯著差異，暗示所觀察到的顯著變化僅僅是由于lcia和lcib表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，煙草葉綠體中l(wèi)cia或lcib的組成型表達(dá)可能提高了lcia和lcib轉(zhuǎn)基因植物中氮同化的效率。表4*：p＜0.05圖18.在缺氮(氮含量少75％)的水耕栽培中生長(zhǎng)的t4轉(zhuǎn)基因品系顯示出生長(zhǎng)增強(qiáng)。圖18示出了6周齡lcia和lcib轉(zhuǎn)基因煙草植物的生長(zhǎng)增強(qiáng)?？扇菀椎赜^察到，與野生型(wt)和非相關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)φ?t.c.)相比，lcia和lcib植物的葉片大小更大。圖19.在氮饑餓條件下，水耕栽培生長(zhǎng)的植物的硝酸還原酶活性以微摩爾no2/克鮮重(fw)/分鐘表示。數(shù)據(jù)為平均值±sd(n＝5)。*p<0.05參考文獻(xiàn)所有引述的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，包括文獻(xiàn)、公布的專(zhuān)利和公布的專(zhuān)利發(fā)明，如在整個(gè)本發(fā)明中引述的那樣，據(jù)此明確地以引用的方式并入。dietzeetal.,1995,agrobacterium-mediatedtransformationofpotato(solanumtuberosum).inipotrykus,gspangenberg,eds,genetransfertoplants,springerlaboratorymanual.springer,berlin,pp24-29giordano,m.,j.beardall,andj.a.raven.2005.co2concentratingmechanismsinalgae:mechanisms,environmentalmodulation,andevolution.annu.rev.plantbiol.56:99-131.reinfelder,j.r.,a.m.l.kraiepiel,andf.m.m.morel.2004.theroleofthec4pathwayincarbonaccumulationandfixationinamarinediatom.plantphysiol.135:2106-2111jansonetal,1993,proteinpurificationprincipleshighresolutionmethods,andinventions,wiley-vch,1998,springer-verlag,ny,1993konzetshell,1986thepromoteroftl-dnagene5controlsthetissue-specificexpressionofchimaericgenescarriedbyanoveltypeofagrobacteriumbinaryvector.molgengenet204:383-396mariscal,v.,p.moulin,m.orsel,a.j.miller,e.fernández,anda.galván.2006.differentialregulationofthechlamydomonasnar1genefamilybycarbonandnitrogen.protist157:421-433miura,k.,t.yamano,s.yoshioka,t.kohinata,y.inoue,f.taniguchi,e.asamizu,y.nakamura,s.tabata,k.t.yamato,k.ohyama,andh.fukuzawa.2004.expressionprofiling-basedidentificationofco2-responsivegenesregulatedbyccm1controllingacarbon-concentratingmechanisminchlamydomonasreinhardtii.plantphysiol.135:1595-1607roe,proteinpurificationtechniques,oxforduniversitypress,2nded.,2001scopesetal,proteinpurificationprinciplesandpractice,springer,3rded.van,k.,y.wang,y.nakamura,andm.h.spalding.2001.insertionalmutantsofchlamydomonasreinhardtiithatrequireelevatedco2forsurvival.plantphysiol.127:607-614wilburandanderson(1948)electrometricandcolorimetricdeterminationofcarbonicanhydrase.jbiolchem176147-154序列表<110>弗勞恩霍夫應(yīng)用研究促進(jìn)協(xié)會(huì)<120>光合作用增加的經(jīng)基因修飾的高等植物<130>fra-pa15-ep<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>1254<212>dna<213>chlamydomonasreinhardtii<400>1atggagtcaagcgttaagccaaacccattcctctcattttcttcttttattcatcaccaa60tgtactagattcagtagcgatttgagtgctagaatcgaagatacaaagaggtttgctgag120actcttgcaacaagaaggttttctttgcctactccacctccattcgcttccgtttccatg180gggtgtatctataagttcggtactagcccagattccaaagcaacagtgtctggagatcat240tgggatcacggacttaatggtgaaaactgggagggaaaagatggagctggtaatgcatgg300gtgtgcaagacaggtagaaagcaatcaccaattaatgttccacaatatcaggtgttggat360ggaaagggttcaaaaattgctaatggtcttcaaactcagtggagttaccctgatttgatg420tctaacggaacatcagttcaagttattaataacggacatactatacaagttcagtggaca480tacaactacgctggtcatgcaactattgctatcccagcaatgcacaatcaaacaaacagg540attgttgatgtgcttgaaatgagacctaatgatgctgcagatagggttactgctgtgcca600acacagtttcacttccattcaactagtgaacatcttttggcaggaaagatctatccttta660gagctccatatagttcaccaagtgactgaaaagcttgaggcttgtaaaggaggttgcttt720agtgttacaggaatccttttccagttggataatggt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