本申請要求2014年10月15日提交的美國臨時申請No.62/064,343的權益，所述申請以引用的方式整體并入本文。

序列表的并入

118,364字節(jié)(在MS-WINDOWS中測量)且在2015年9月25日創(chuàng)建的包括于命名為“MONS378WO_ST25”的文件中的序列表通過電子提交方式與此一起提交且以引用的方式并入本文。

發(fā)明背景

發(fā)明領域

本發(fā)明總體上涉及生物技術領域。更具體地，本發(fā)明涉及編碼降解除草劑的酶的重組DNA分子。本發(fā)明還涉及含有重組DNA分子的轉基因植物、部分、種子、細胞和植物部分，以及使用它們的方法。

相關技術描述

農作物生產通常利用使用生物技術方法產生的轉基因性狀。將異源基因(也稱為轉基因)引入植物中以產生轉基因性狀。轉基因在植物中的表達賦予植物以期望的性狀，如除草劑耐受性。轉基因除草劑耐受性性狀的實例包括草甘膦耐受性、草銨膦耐受性和麥草畏耐受性。隨著對最常用的除草劑有抗性的雜草物種的增加，在所述領域中需要新的除草劑耐受性性狀。特別感興趣的除草劑是芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑提供對一系列抗草甘膦雜草的控制，從而產生賦予這些除草劑耐受性的特別用于與其他除草劑耐受性性狀組合的作物系統(tǒng)中的性狀。

從2,4-滴丙酸(dichloroprop)降解土壤樣品分離的食除草劑鞘脂菌(Sphingobium herbicidovorans)菌株MH被鑒定為能夠裂解各種苯氧基烷酸(phyenoxyalkanoic acid)除草劑的醚鍵，從而利用此作為其生長的唯一碳源和能量來源(HPE Kohler,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology(1999)23:336-340)。除草劑的分解代謝通過兩種不同的對映選擇性α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶RdpA(R-2,4-滴丙酸雙加氧酶)和SdpA(S-2,4-滴丙酸雙加氧酶)進行。(A Westendorf,等人,Microbiological Research(2002)157:317-322；Westendorf,等人,Acta Biotechnologica(2003)23(1):3-17)。RdpA已自食除草劑鞘脂菌(GenBank登錄AF516752(DNA)和AAM90965(蛋白質))和食酸代爾夫特菌(Delftia acidovorans)(GenBank登錄NG_036924(DNA)和YP_009083283(蛋白質))(TA Mueller,等人,Applied and Environmental Microbiology(2004)70(10):6066-6075。)RdpA和SdpA基因已經用于植物轉化以賦予作物以除草劑耐受性(TR Wright,等人,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,(2010)107(47):20240-5)。使用蛋白質工程化技術改進RdpA酶的活性以產生用于轉基因植物的蛋白質將允許更高的除草劑施加率，從而改進轉基因作物安全性和雜草控制措施。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供一種多肽，所述多肽與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少約92％序列同一性：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一個實施方案中，所述多肽對至少一種選自由以下組成的組的除草劑具有加氧酶活性：AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。

本發(fā)明提供一種重組DNA分子，所述重組DNA分子包含編碼與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少約92％序列同一性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一個實施方案中，所述重組DNA分子包含選自由以下組成的組的核酸序列：SEQ ID NO:2、3、5、6、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45和53-59。在另一個實施方案中，所述重組DNA分子編碼對至少一種選自由以下組成的組的除草劑具有加氧酶活性的多肽：AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。在另一個實施方案中，所述重組DNA分子可操作地連接至在植物細胞中有功能的異源啟動子。在另一個實施方案中，所述重組DNA分子可操作地連接至編碼葉綠體轉運肽的DNA分子，所述葉綠體轉運肽用于將可操作地連接的多肽定位在細胞內。

本發(fā)明提供一種DNA構建體，所述DNA構建體包含在植物細胞中有功能的異源啟動子，所述異源啟動子可操作地連接至重組DNA分子，所述重組DNA分子包含編碼與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少約92％序列同一性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一個實施方案中，所述重組DNA分子可操作地連接至編碼葉綠體轉運肽的DNA分子，所述葉綠體轉運肽用于將可操作地連接的多肽定位在細胞內。在另一個實施方案中，所述重組DNA分子編碼具有選自由以下組成的組的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52，并且所述多肽在轉基因植物中的表達賦予植物除草劑耐受性。在另一個實施方案中，所述DNA構建體存在于轉基因植物的基因組中。

本發(fā)明提供一種包含重組DNA分子的轉基因植物、種子、細胞或植物部分，所述重組DNA分子包含編碼與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少約92％序列同一性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一個實施方案中，所述轉基因植物、種子、細胞或植物部分包含對至少一種選自由以下組成的組的除草劑的耐受性的轉基因性狀：AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。在另一個實施方案中，所述轉基因植物、種子、細胞或植物部分包含本發(fā)明的DNA構建體。在另一個實施方案中，所述轉基因植物、種子、細胞或植物部分包含本發(fā)明的多肽。

本發(fā)明提供一種用于賦予植物、種子、細胞或植物部分除草劑耐受性的方法，所述方法包括在所述植物、種子、細胞或植物部分中表達本發(fā)明的多肽。在一個實施方案中，所述用于賦予除草劑耐受性的方法與包含含有本發(fā)明的重組DNA分子的轉基因性狀的轉基因植物、種子、細胞或植物部分一起使用。在一個實施方案中，所述用于賦予除草劑耐受性的方法與選自由以下組成的組的除草劑一起使用：AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。

本發(fā)明提供一種植物轉化方法，所述方法包括將本發(fā)明的DNA構建體引入植物細胞中并且從其再生包含所述DNA構建體并且對至少一種選自由以下組成的組的除草劑耐受的植物：AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。在一個實施方案中，所述植物轉化方法包括使所述再生的植物與其本身或與第二植物雜交并且從所述雜交收集種子。

本發(fā)明提供一種用于通過使包含本發(fā)明的轉基因植物或種子的植物生長區(qū)與至少一種選自由以下組成的組的除草劑接觸來控制植物生長區(qū)中的雜草的方法：AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑，其中所述轉基因植物或種子對所述除草劑具有耐受性。

附圖簡述

圖1.精喹禾靈處理后的對照和MON-HT55(SEQ ID NO:11)轉基因玉米植物。圖1A示出未處理或用1X精喹禾靈(0.08lb ai/英畝)處理的對照和轉基因玉米植物。圖1B示出F1雜交對照玉米植物，并且圖1C示出F1雜交MON-HT55轉基因玉米植物。植物在(1)20℃/20℃，(2)28℃/20℃，或(3)38℃/30℃的白天/夜間溫度下生長，然后用2X精喹禾靈噴灑。

圖2.示出工程化蛋白質的溫度依賴性活性的圖。圖2A示出當用精喹禾靈作為底物測試時，MON-HT55(SEQ ID NO:11)和野生型RdpA酶的活性。圖2B示出當用精喹禾靈作為底物測試時，MON-HT1(SEQ ID NO:14)、MON-HT2(SEQ ID NO:18)、MON-HT7(SEQ ID NO:34)、MON-HT8(SEQ ID NO:37)和野生型RdpA的活性。圖2C示出當用2,4-D作為底物測試時，MON-HT1、MON-HT2、MON-HT7、MON-HT8和野生型RdpA的活性。將數據標準化為在25℃下每種蛋白質的活性。

圖3.野生型RdpA(SEQ ID NO:60)的蛋白質序列，其中適用于蛋白質工程化的示例性氨基酸位置加框。

圖4.在2X精喹禾靈(0.16lb ai/英畝)(4A、4B和4C)或4X 2,4-D(4lb ae/英畝)(4D和4E)施加至表達MON-HT55(SEQ ID NO:11)、MON-HT1(SEQ ID NO:14)、MON-HT2(SEQ ID NO:18)、MON-HT3(SEQ ID NO:22)、MON-HT4(SEQ ID NO:25)、MON-HT7(SEQ ID NO:34)的F1雜交玉米植物(表達MON-HT x MON89034近交體的純合R1)或F1雜交體對照(NK603x MON89034)之后的平均損傷評級。在施加2X精喹禾靈(圖4A)或4X 2,4-D(圖4D)之前，來自在設定于20℃的白天和夜間溫度(20℃/20℃)下適應的植物的數據；圖4B示出來自在施加2X精喹禾靈之前在28℃的白天溫度和20℃的夜間溫度(28℃/20℃)下適應的植物的數據；圖4C示出來自在施加2X精喹禾靈(圖4C)或4X 2,4-D(圖4E)之前在38℃的白天溫度和30℃的夜間溫度(38℃/30℃)下適應的植物的數據。

圖5.圖5A和5B：在有CTP或無CTP的情況下包含MON-HT2(SEQ ID NO:20，編碼SEQ ID NO:18)的對照和轉基因玉米植物，其中所述植物以16×速率(1.28lb ai/英畝)接受以V2、隨后V4施加的喹禾靈，并且在精喹禾靈施加后10至14天拍攝照片。

圖6A-圖6E.來自食除草劑鞘脂菌的野生型RdpA(SEQ ID NO:60)和SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52的蛋白質序列的多序列比對，其中在圖6A、6B、6C、6D、6E中每一個的底部提供共有序列(提供為SEQ ID NO:61)。

序列簡述

SEQ ID NO:1-3是MON-HT51的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:4-6是MON-HT52的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:7-8是MON-HT53的氨基酸序列和細菌密碼子多核苷酸序列。

SEQ ID NO:9-10是MON-HT54的氨基酸序列和細菌密碼子多核苷酸序列。

SEQ ID NO:11-13是MON-HT55的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:14-17是MON-HT1的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列、單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列和雙子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:18-21是MON-HT2的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列、單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列和雙子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:22-24是MON-HT3的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:25-27是MON-HT4的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:28-30是MON-HT5的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:31-33是MON-HT6的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:34-36是MON-HT7的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:37-39是MON-HT8的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:40-42是MON-HT9的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:43-45是MON-HT10的氨基酸序列、細菌密碼子多核苷酸序列和單子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:46-52是MON-HT11、MON-HT13、MON-HT14、MON-HT15、MON-HT16、MON-HT17和MON-HT18的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53-59是MON-HT11、MON-HT13、MON-HT14、MON-HT15、MON-HT16、MON-HT17和MON-HT18的雙子葉密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:60是來自食除草劑鞘脂菌的野生型RdpA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:61是圖6A-圖6E的共有序列。

發(fā)明詳述

提供以下定義和方法以更好地限定本發(fā)明并指導本領域的普通技術人員實施本發(fā)明。除非另外說明，否則術語應根據相關領域的普通技術人員的常規(guī)用法來理解。

本發(fā)明通過提供本文稱為MON-HT蛋白的新穎工程化蛋白質和編碼它們的重組DNA分子以及使用這些的組合物和方法來克服現(xiàn)有技術的局限性。MON-HT蛋白是能夠使芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑失活的加氧酶。如本文所用，使除草劑失活意指使除草劑不再具有其針對植物的除草活性。MON-HT蛋白表現(xiàn)出新穎的底物選擇性、有用的酶動力學和在高溫下增加的酶穩(wěn)定性。表達MON-HT蛋白的轉基因植物表現(xiàn)出對AOPP、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑施加的改善的耐受性。

工程化蛋白質和重組DNA分子

本發(fā)明提供新穎的工程化蛋白質和編碼它們的重組DNA分子。如本文所用，術語“工程化的”是指通常不會在自然界中發(fā)現(xiàn)并且通過人為干預產生的非天然DNA、蛋白質或生物體?！肮こ袒鞍踪|”是在實驗室中使用一種或多種蛋白質工程化技術，如使用定點誘變的蛋白質設計和使用隨機誘變和DNA改組的定向進化來設想和創(chuàng)建其多肽序列的蛋白質。例如，工程化蛋白質可相對于野生型蛋白質的編碼序列具有一個或多個缺失、插入或取代，并且每個缺失、插入或取代可由一個或多個氨基酸組成。工程化蛋白質的實例在本文提供為SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。

本發(fā)明提供的工程化蛋白質是具有加氧酶活性的酶。如本文所用，術語“加氧酶活性”意指通過將氧從分子氧轉移至底物、副產物或中間物來氧化底物的能力。本發(fā)明提供的工程化蛋白的加氧酶活性可使AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑中的一種或多種失活。

如本文所用，“野生型”意指天然存在的。如本文所用，“野生型DNA分子”、“野生型多肽”或“野生型蛋白質”是天然存在的DNA分子、多肽或蛋白質，即在自然界中預先存在的DNA分子、多肽或蛋白質。多肽、蛋白質或DNA分子的野生型型式可適用于與工程化蛋白質或基因進行比較。適用于與本發(fā)明提供的工程化蛋白質比較的野生型蛋白質的實例是來自食除草劑鞘脂菌菌株MH的RdpA酶。適用于與本發(fā)明提供的重組DNA分子比較的野生型DNA分子的實例是來自食除草劑鞘脂菌菌株MH的RdpA基因。蛋白質或DNA分子的野生型型式可適用作實驗中的對照。

如本文所用，“對照”意指為比較目的而設計的實驗對照。例如，轉基因植物分析中的對照植物是與實驗植物(即其待測試的植物)相同類型但不含實驗植物的轉基因插入片段、重組DNA分子或DNA構建體的植物。適用于與轉基因玉米植物比較的對照植物的實例是非轉基因LH244玉米(美國專利號6,252,148)并且適用于與轉基因大豆植物比較的對照植物的實例是非轉基因A3555大豆(美國專利No.7,700,846)。

如本文所用，術語“重組”是指為遺傳工程化的結果并且因此通常不會在自然界中發(fā)現(xiàn)并且通過人為干預產生的非天然DNA、多肽或蛋白質?！爸亟MDNA分子”是包含不天然存在的并且因此是人為干預的結果的DNA序列的DNA分子，例如編碼工程化蛋白質的DNA分子。另一個實例是由至少兩個彼此異源的DNA分子(如編碼蛋白質的DNA分子和可操作地連接的異源啟動子)的組合組成的DNA分子。重組DNA分子的實例是包含至少一個選自以下的序列的DNA分子：SEQ ID NO:2、3、5、6、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45和53-59。“重組多肽”或“重組蛋白質”是包含不天然存在的氨基酸序列并且因此是人為干預的結果的多肽或蛋白質，例如工程化蛋白質。

術語“轉基因”是指作為人為干預(如通過植物轉化方法)的結果人工并入生物體基因組中的DNA分子。如本文所用，術語“轉基因的”意指包含轉基因，例如“轉基因植物”是指在其基因組中包含轉基因的植物，“轉基因性狀”是指由并入植物基因組中的轉基因的存在傳遞或賦予的特征或表型。作為這種基因組改變的結果，所述轉基因植物是與相關的野生型植物明顯不同的植物，并且轉基因性狀是未在野生型植物中天然發(fā)現(xiàn)的性狀。本發(fā)明的轉基因植物包含通過本發(fā)明提供的重組DNA分子和工程化蛋白質。

如本文所用，術語“異源”是指源自不同來源且因此在自然界中通常不相關的兩種或更多種物質之間的關系。例如，編碼蛋白質的重組DNA分子相對于可操作地連接的啟動子是異源的，如果這種組合在自然界中通常不存在。此外，當特定重組DNA分子不天然存在于所述特定細胞或生物體中時，其可相對于其所插入的細胞或生物體是異源的。

如本文所用，術語“編碼蛋白質的DNA分子”或“編碼多肽的DNA分子”是指包含編碼蛋白質或多肽的核苷酸序列的DNA分子?！熬幋a蛋白質的序列”或“編碼多肽的序列”意指編碼蛋白質或多肽的DNA序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的順序排列。編碼蛋白質的序列或編碼多肽的序列的邊界通常由5'-末端的翻譯起始密碼子和3'-末端的翻譯終止密碼子決定。編碼蛋白質的分子或編碼多肽的分子可包含編碼蛋白質或多肽序列的DNA序列。如本文所用，“轉基因表達”、“表達轉基因”、“蛋白質表達”、“多肽表達”、“表達蛋白質”和“表達多肽”意指通過將DNA分子轉錄成信使RNA(mRNA)并且將mRNA翻譯成多肽鏈(其可最終折疊成蛋白質)的過程產生蛋白質或多肽。編碼蛋白質的DNA分子或編碼多肽的DNA分子可以可操作地連接至DNA構建體中的異源啟動子，以用于在用重組DNA分子轉化的細胞中表達蛋白質或多肽。如本文所用，“可操作地連接”是指以使得一個DNA分子可影響另一個DNA分子的功能的方式連接的兩個DNA分子。可操作連接的DNA分子可以是單個連續(xù)分子的一部分，并且可以是或可以不是相鄰的。例如，啟動子與DNA構建體中的編碼蛋白質的DNA分子或編碼多肽的DNA分子可操作地連接，其中兩個DNA分子被排列成使得所述啟動子可影響轉基因的表達。

如本文所用，“DNA構建體”是包含兩個或更多個異源DNA序列的重組DNA分子。DNA構建體適用于轉基因表達，并且可包含在載體和質粒中。DNA構建體可出于轉化(即將異源DNA引入宿主細胞中)的目的用于載體中以便產生轉基因植物和細胞，并且因此也可包含在轉基因植物、種子、細胞或植物部分的質粒DNA或基因組DNA中。如本文所用，“載體”意指可用于植物轉化目的的任何重組DNA分子。如序列表中所示的重組DNA分子可例如作為構建體的一部分插入載體中，所述構建體具有可操作地連接至啟動子的重組DNA分子，所述啟動子在植物中起作用以驅動由所述重組DNA分子編碼的工程化蛋白質的表達。用于構建DNA構建體和載體的方法是本領域中熟知的。DNA構建體或包含DNA構建體的載體的組分通常包括但不限于以下中的一種或多種：用于表達可操作地連接的DNA的合適啟動子、可操作地連接的編碼蛋白質非人DNA分子和3'非翻譯區(qū)(3’-UTR)。適用于實踐本發(fā)明的啟動子包括在植物中起作用以表達可操作地連接的多核苷酸的啟動子。此類啟動子是多種多樣的且是本領域中熟知的，并且包括誘導型的、病毒的、合成的、組成型、時間調控型的、空間調控型的和/或時空調控型的。另外的任選組分包括但不限于以下元件中的一個或多個：5'-UTR、增強子、前導序列、順式作用元件、內含子、葉綠體轉運肽(CTP)和一個或多個選擇性標記轉基因。

本發(fā)明的DNA構建體可包含可操作地連接至本發(fā)明提供的編碼蛋白質的DNA分子的CTP分子。適用于實踐本發(fā)明的CTP包括用于促進工程化蛋白分子在細胞內定位的那些。通過促進細胞內的蛋白質定位，CTP可增加工程化蛋白質的積累，保護其免受蛋白水解降解，增強除草劑耐受性水平，并且由此降低除草劑施加后的損傷水平。用于本發(fā)明的CTP分子是本領域中已知的，包括但不限于擬南芥EPSPS CTP(Klee等人,1987)、矮牽牛EPSPS CTP(della-Cioppa等人,1986)、玉米cab-m7信號序列(Becker等人,1992；PCT WO 97/41228)和豌豆谷胱甘肽還原酶信號序列(Creissen等人,1991；PCT WO 97/41228)。

本發(fā)明的重組DNA分子可通過本領域中已知的方法完全或部分地合成和修飾，特別是在期望提供適用于DNA操作的序列(如限制性酶識別位點或重組-基因克隆位點)、植物優(yōu)選序列(如植物密碼子使用或Kozak共有序列)或適用于DNA構建體設計的序列(如間隔區(qū)或接頭序列)的情況下。本發(fā)明包括重組DNA分子和工程化蛋白質，所述重組DNA分子和工程化蛋白質與本文提供的重組DNA分子或工程化蛋白質序列中的任一個，例如與包含選自由以下組成的組的序列的重組DNA分子具有至少約80％(百分比)序列同一性、約85％序列同一性、約90％序列同一性、約91％序列同一性、約92％序列同一性、約93％序列同一性、約94％序列同一性、約95％序列同一性、約96％序列同一性、約97％序列同一性、約98％序列同一性和約99％序列同一性：SEQ ID NO:2、3、5、6、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45和53-59。如本文所用，術語“百分比序列同一性”或“％序列同一性”是指在最佳比對兩個序列時(在比較窗內具有總計少于參考序列的20％的適當核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)，與測試(“主題”)序列(或其互補鏈)相比，參考(“查詢”)序列(或其互補鏈)的線性多核苷酸或多肽序列中的相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比對比較窗口的最佳序列比對是本領域的技術人員所熟知的并且可由以下工具實施：如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比對算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，并且由這些算法的計算機化實現(xiàn)方式來實施，如使用默認參數的作為Wisconsin(Accelrys Inc.,San Diego,CA)、MEGAlign(DNAStar,Inc.,1228S.Park St.,Madison,Wis.53715)和MUSCLE(3.6版)(RC Edgar,Nucleic Acids Research(2004)32(5):1792-1797)的一部分可獲得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。測試序列和參考序列的比對片段的“同一性分數”是由兩個比對序列共享的相同組分的數目除以參考序列片段中組分的總數，即整個參考序列或參考序列的較小限定部分。序列同一性百分比表示為同一性分數乘以100。一個或多個序列的比較可以是針對全長序列或其一部分，或針對更長的序列。

可通過改變(即修飾)野生型蛋白質以產生具有有用蛋白質特征(如改變的Vmax、Km、底物特異性、底物選擇性和蛋白質穩(wěn)定性)的新穎組合的新蛋白質來產生工程化蛋白質。修飾可在蛋白質中的特定氨基酸位置進行，并且可以是在自然界(即在野生型蛋白質中)中在所述位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸被不同的氨基酸取代。相對于適用于蛋白質工程化的野生型蛋白質RdpA(SEQ ID NO:60)的蛋白質序列的示例性氨基酸位置示于圖3中。圖6A、6B、6C、6D、6E提供野生型RdpA蛋白質序列與工程化蛋白質序列SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52的多序列比對?？稍O計工程化蛋白質，所述工程化蛋白質與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少約92％序列同一性：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52，并且包含這些氨基酸突變中的至少一種。因此，本發(fā)明提供的工程化蛋白質提供相對于在自然界中發(fā)現(xiàn)的野生型蛋白質具有一種或多種改變的蛋白質特征的新蛋白質。在本發(fā)明的一個實施方案中，與類似的野生型蛋白質或此類特征的任何組合相比，工程化蛋白質具有改變的蛋白質特征，如針對一種或多種除草劑的改進的或降低的活性或改進的蛋白質穩(wěn)定性。在一個實施方案中，本發(fā)明提供工程化蛋白質和編碼其的重組DNA分子，其與選自由以下組成的組的工程化蛋白質序列具有至少約80％序列同一性、約85％序列同一性、約90％序列同一性、約91％序列同一性、約92％序列同一性、約93％序列同一性、約94％序列同一性、約95％序列同一性、約96％序列同一性、約97％序列同一性、約98％序列同一性和約99％序列同一性：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。氨基酸突變可作為蛋白質中的單個氨基酸取代或與一種或多種其它突變(如一個或多個其它氨基酸取代、缺失或添加)的組合進行?？扇绫疚乃枋龌蛲ㄟ^本領域的技術人員已知的任何其它方法進行突變。

轉基因植物

本發(fā)明的一個方面包括包含本發(fā)明提供的重組DNA分子和工程化蛋白的轉基因植物細胞、轉基因植物組織、轉基因植物和轉基因種子。包含重組DNA分子和工程化蛋白質的這些細胞、組織、植物和種子顯示對芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑中的一種或多種的除草劑耐受性。

用于轉化用于本發(fā)明的宿主植物細胞的合適方法實際上包括可將DNA引入細胞(例如，其中重組DNA構建體穩(wěn)定整合至植物染色體中)的任何方法并且在本領域中是已知的。用于將重組DNA構建體引入植物中的示例性和廣泛使用的方法是土壤桿菌屬轉化系統(tǒng)，其是本領域的技術人員熟知的。轉基因植物可通過植物細胞培養(yǎng)的方法從轉化的植物細胞再生。關于轉基因純合的轉基因植物(即，轉基因的兩個等位基因拷貝)可通過將包含單個轉基因等位基因的轉基因植物與其自身(例如R0植物)自花授粉(自交)以產生R1種子。所產生的R1種子的四分之一對于轉基因將是純合的。通常使用SNP測定、DNA測序或允許雜合子與純合子之間的區(qū)別的熱擴增測定來測試從發(fā)芽的R1種子生長的植物的接合性，稱為接合性測定。

本發(fā)明提供的植物、種子、植物部分、植物組織和細胞顯示對AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑中的一種或多種的除草劑耐受性。AOPP除草劑靶向植物的乙?；o酶A羧化酶(ACCase)，其是脂肪酸生物合成途徑的一部分。草植物對這些除草劑敏感，因為它們在其質體和細胞質中含有除草劑敏感的ACCase。AOPP除草劑是本領域中熟知的且可商購的。AOPP除草劑的實例包括但不限于，炔草酸(clodinafop)、氰氟草酯(cyhalofop)、禾草靈(diclofop)、噁唑禾草靈(fenoxaprop)、精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P)、噻唑禾草靈(fenthiaprop)、吡氟禾草靈(fluazifop)、精吡氟禾草靈(fluazifop-P)、吡氟氯禾靈(haloxyfop)、異噁草醚(isoxapyrifop)、噁唑酰草胺(metamifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾靈、精喹禾靈和三氟禾草肟(trifop)。苯氧基酸和吡啶基氧基酸除草劑是類似于植物生長激素吲哚乙酸(IAA)的合成植物生長素。闊葉植物對這些除草劑敏感，其誘導快速、不受控制的生長，最終殺死植物。苯氧基酸除草劑的實例包括但不限于2,4-D；2,4-DB；稗草胺(clomeprop)；2,4-滴丙酸；涕丙酸；MCPA；MCPB和2-甲-4-氯丙酸(mecoprop)。吡啶基氧基酸除草劑的實例包括但不限于綠草定(triclopyr)；氟草煙(fluroxypyr)；氯氨吡啶酸(aminopyralid)；二氯吡啶酸(clopyralid)和毒莠定(picloram)。

除草劑可施加至包含本發(fā)明提供的植物和種子的植物生長區(qū)域作為控制雜草的方法。本發(fā)明提供的植物和種子包含除草劑耐受性性狀，且因此耐受一種或多種AOPP除草劑或苯氧基酸除草劑或吡啶基氧基酸除草劑的施加。除草劑施加可以是推薦的商業(yè)速率(1X)或其任何分數或倍數，如推薦商業(yè)速率的兩倍(2X)。除草劑速率可表示為每磅每英畝的酸當量(lb ae/英畝)或磅活性成分每英畝(lb ai/英畝)。除草劑施加包含至少一種選自由以下組成的組的除草劑：AOPP除草劑和苯氧基酸除草劑和吡啶基氧基酸除草劑。在施加除草劑時，植物生長區(qū)可包括或可不包括雜草植物。用于在控制雜草的區(qū)域中使用的AOPP除草劑的除草有效劑量在生長季節(jié)中應該由約0.01lb ai/英畝至約16lb ai/英畝的范圍組成。例如，精喹禾靈的1X速率將是0.08lb ai/英畝的速率。用于在控制雜草的區(qū)域中使用的苯氧基酸除草劑的除草有效劑量在生長季節(jié)中應該由約0.01lb ae/英畝至約16lb ae/英畝的范圍組成。例如，2,4-D的1X速率將是約0.75lb ae/英畝至1.0lb ae/英畝的速率。用于在控制雜草的區(qū)域中使用的吡啶基氧基酸除草劑的除草有效劑量在生長季節(jié)中應該由約0.01lb ae/英畝至約16lb ae/英畝的范圍組成。例如，氟草煙的1X速率將是約0.13至0.48lb ae/英畝的速率。

除草劑施加可依次與幾種AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑、吡啶基氧基酸除草劑或任何其它相容性除草劑中的一種、兩種或組合槽混。一種除草劑或兩種或更多種除草劑組合或單獨的多次施加可在生長季節(jié)內用于包含本發(fā)明的轉基因植物的區(qū)域以用于控制廣譜雙子葉雜草、單子葉雜草或兩者，例如，兩次施加(如種植前施加和芽后施加或芽前施加和芽后施加)或三次施加(如種植前施加、芽前施加和芽后施加或芽前施加和兩次芽后施加)。

如本文所用，“耐受性”或“除草劑耐受性”意指植物、種子、植物組織、植物部分或細胞抵抗一種或多種除草劑的毒性作用的能力。植物、種子、植物組織、植物部分或細胞的除草劑耐受性可通過將植物、種子、植物組織、植物部分或細胞與合適的對照進行比較來測量。例如，除草劑耐受性可通過將除草劑施加至包含編碼能夠賦予除草劑耐受性的蛋白質的重組DNA分子的植物(測試植物)和不包含編碼能夠賦予除草劑耐受性的蛋白質的重組DNA分子的植物(對照植物)，且然后比較兩種植物的植物損傷，其中測試植物的除草劑耐受性通過與對照植物的損傷率相比減少的損傷率指示。當與對照植物、種子、植物組織、植物部分或細胞相比時，除草劑耐受性植物、種子、植物組織、植物部分或細胞顯示對除草劑的毒性作用的反應降低。如本文所用，“除草劑耐受性性狀”是與野生型植物或對照植物相比賦予植物改善的除草劑耐受性的轉基因性狀。

本發(fā)明的轉基因植物、子代、種子、植物細胞和植物部分還可含有一種或多種另外的轉基因性狀?？赏ㄟ^使含有包含本發(fā)明提供的重組DNA分子的轉基因的植物與含有另外的轉基因性狀的另一種植物雜交來引入另外的轉基因性狀。如本文所用，“雜交”意指培育兩種單獨的植物以產生子代植物。因此，兩種轉基因植物可雜交以產生含有轉基因性狀的子代。如本文所用，“子代”意指親本植物的任何傳代的后代，并且轉基因子代包含由本發(fā)明提供并且從至少一種親本植物遺傳的DNA構建體?；蛘撸赏ㄟ^用包含本發(fā)明提供的重組DNA分子的DNA構建體共轉化所述另外的轉基因性狀的DNA構建體(例如，其中所有的DNA構建體呈現(xiàn)為用于植物轉化的同一載體的部分)或通過將另外的性狀插入包含本發(fā)明提供的DNA構建體的轉基因植物中或反之亦然(例如，通過使用關于轉基因植物或植物細胞的植物轉化的任何方法)來引入另外的轉基因性狀。此類另外的轉基因性狀包括但不限于增加的昆蟲抗性、增加的水利用效率、增加的產量性能、增加的抗旱性、增加的種子質量、改進的營養(yǎng)品質、雜交種種子生產和除草劑耐受性，其中性狀是相對于野生型植物或對照植物測量的。此類另外的轉基因性狀是本領域的技術人員已知的；例如，美國農業(yè)部(USDA)動物和植物健康檢查局(APHIS)提供了此類性狀的列表，并且可在它們的網站www.aphis.usda.gov上找到。

含有本發(fā)明提供的轉基因性狀的轉基因植物和子代可與本領域中通常已知的任何培育方法一起使用。在包含兩種或更多種轉基因性狀的植物系中，轉基因性狀可在包含三種或更多種轉基因性狀的植物系中獨立地分離、連接或兩者的組合。還考慮與親本植物的回交和與非轉基因植物的異交，以及無性繁殖。通常用于不同性狀和作物的培育方法的描述是本領域的技術人員熟知的。為了證實轉基因在特定植物或種子中的存在，可進行多種測定。此類測定包括例如分子生物學測定，如DNA印跡和RNA印跡、PCR和DNA測序；生物化學測定，如例如通過免疫學方法(ELISA和蛋白質印跡)或通過酶功能檢測蛋白質產物的存在；植物部分測定，如葉或根測定；以及還有通過分析整株植物的表型。

作為回交轉化過程的結果實現(xiàn)轉基因性狀向植物基因型的基因滲入。其中已經基因滲入轉基因性狀的植物基因型可稱為回交轉化的基因型、系、近交植物或雜交種。類似地，缺乏所需轉基因性狀的植物基因型可稱為未轉化的基因型、系、近交植物或雜交種。

如本文所用，術語“包含”是指“包括但不限于”。

實施例

包括以下實施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術人員應理解以下實施例中公開的技術表示由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實踐中發(fā)揮良好作用的技術，并且因此可被認為構成本發(fā)明實踐的優(yōu)選模式。然而，根據本公開，本領域技術人員應理解，在不脫離本發(fā)明的構思、精神和范圍的情況下可在已公開并仍獲得類似或相似結果的特定實施方案中做出許多改變。更具體地，顯而易見的是，化學和生理學相關的某些試劑可用所獲得的相同或相似的結果代替本文所述的試劑。對于本領域技術人員顯而易見的所有此類類似的替代和修改被認為在如由所附權利要求限定的本發(fā)明的精神、范圍和構思內。

實施例1：初始蛋白質工程化和酶分析

使用蛋白質工程化技術在實驗室中構思和創(chuàng)建了新型工程化蛋白質和編碼這些蛋白質的重組DNA分子。工程化蛋白質是具有加氧酶活性的酶，并且被工程化為具有改變的相對于野生型蛋白質使AOPP除草劑、苯氧基酸除草劑或兩者失活的能力。

選擇十六種具有加氧酶活性的已知蛋白質并用于產生共有同源序列比對。這與結構指導的分析組合使用以告知合理的設計策略。從這些分析中，選擇各自長度為13至21個氨基酸的五個區(qū)域(在本文中被稱為“島”)用于誘變。使用本領域的技術人員已知的技術產生這些區(qū)域中的每一個中的突變，如丙氨酸掃描突變；同源性掃描突變；Pro/Gly掃描突變；區(qū)域互換或突變；以及這些各種技術的組合(參見，M Lehmann和M Wyss,Current Opinion in Biotechnology(2001)12(4):371-375；B Van den Burg和VGH Eijsink,Current Opinion in Biotechnology(2002)13(4):333-337；以及Weiss等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2000)97(16):8950–8954)。使用這些方法，產生超過1,200種獨特的工程化蛋白質和編碼它們的重組DNA分子以用于進一步分析和表征。由于大量用于測試所產生的工程化蛋白質以及測試和比較每種蛋白質的酶活性的需要，開發(fā)了高通量細菌蛋白質表達和酶測定系統(tǒng)以用于使用粗細菌提取物進行快速分析。

通過合成編碼每種工程化蛋白質的重組DNA分子并且將其克隆至具有可操作地連接至重組DNA分子的C-末端組氨酸標簽(His-標簽)的細菌表達載體中來實現(xiàn)高通量細菌蛋白質表達。將載體用于轉化大腸埃希氏菌(Escherichia coli)(E.coli)，并且誘導工程化蛋白質的細菌表達。將過夜的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物在96孔板中生長，并且將培養(yǎng)物離心以沉淀細菌。通過將100ul裂解主混合物(10ml細菌蛋白質提取試劑II(Pierce Biotechnology,Rockford,IL；目錄號78260)；10ul溶菌酶(10ug/ml最終；Lysozyme American Bioanalytical,Natick,MA；目錄號AB011780-00005)；和40ul核酸酶(100單位/ml最終，Novagen,Darmstadt,Germany；目錄號71206-3)添加至每孔來裂解細菌團塊。將所述板渦旋，隨后在4℃下孵育30分鐘。向每個孔中添加400ul的MOPS緩沖液(pH 6.57)，并且通過離心使碎片沉淀。小心地除去裂解物上清液并用作粗細菌提取物以用于隨后的酶分析。

設計高通量除草劑降解酶測定以使用粗細菌提取物測定工程化蛋白質對各種除草劑的酶活性。通過終點比色測定利用通過測量來自4-氨基安替比林和鐵氰化鉀在510nm下的吸光度檢測苯酚產物來測量工程化蛋白的加氧酶活性(即，其酶活性)。所述測定基于Fukomori和Hausinger，Journal of Biological Chemistry(1993)268(32):24311-24317中描述的測定。在96孔板中在150ul總體積中測定酶反應，所述總體積含有：20mM MOPS pH 6.75、50-200uM NH4FeSO4、50-200uM抗壞血酸鈉、1mMα-酮戊二酸(aKG)、10ul含有表達的工程化蛋白質的大腸埃希氏菌細胞裂解物和底物(AOPP除草劑或苯氧基酸除草劑)。在與底物反應開始后，將板在各種溫度下孵育不同時間，并且通過添加EDTA至6.25mM的終濃度或通過添加15ul pH 10緩沖液(50mM硼酸、50mM KCl)來猝滅(終止)，隨后添加15ul 0.2％4-氨基安替比林和15ul0.8％鐵氰化鉀。在標準實驗室光譜儀上進行吸光度測量。根據需要縮放測定以增強通量。使用純化的蛋白質或產物標準品來產生標準曲線。

使用這種高通量細菌蛋白質表達和酶測定系統(tǒng)，相對于所選擇的野生型蛋白質RdpA的活性，測量了大約1200種工程化蛋白質的活性。在96孔板測定中，存在3種對照(不含工程化蛋白質的粗細菌提取物)和3種陽性對照(具有野生型蛋白質的粗細菌提取物)。測量孔的吸光度，并且使用下式計算蛋白質活性：

其中，活性_i是樣品的活性，吸光度_i是樣品的吸光度，吸光度_WT是含有來自表達野生型酶的大腸埃希氏菌的提取物的孔的吸光度，并且吸光度_pET是含有來自無工程化蛋白質的大腸埃希氏菌的提取物的孔的吸光度。每種獨特的工程化蛋白質的活性一式兩份進行測量，并且報告為兩次測量的平均值。

基于來自高通量酶測定系統(tǒng)的結果，選擇大約545種獨特的工程化蛋白質以用于使用純化的工程化蛋白質的進一步分析。在純化的工程化蛋白質制備測定中，根據制造商的方案使用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen,Valencia,CA,目錄號30230)來制備粗制細菌表達裂解物。

使用此實施例1中所描述的除草劑降解酶測定以AOPP除草劑喹禾靈作為底物來測定純化的工程化蛋白質。純化的工程化蛋白質測定的結果在很大程度上證實了來自高通量酶測定的結果。大約545種工程化蛋白質中的7種的測定結果顯示在表1中，其中酶活性表示為樣品的活性相對于野生型RdpA酶的活性(如在此實施例1中所描述來計算)。來自這些測定的這些數據產生出人意料的結果，即特異性突變的組合比其它突變的組合顯著更好地進行，并且證明工程化蛋白質的酶活性可顯著改變。

表1

使用從第一測定中獲得的信息，然后如前所述進行蛋白質工程化以產生另外的工程化蛋白質，其如在此實施例1中所描述進行測試。使用精喹禾靈作為這些另外的工程化蛋白質中的5種的底物的高通量酶測定的結果提供在表2中。

表2

使用來自表2的5種工程化蛋白質進行進一步蛋白質表征，如Km、Vmax和晶體結構分析。對于此詳細分析，如下制備純化的蛋白質：將表達編碼給定MON-HT蛋白的轉基因的大腸埃希氏菌的2ml過夜培養(yǎng)物用于接種500ml肉湯，并且在37℃下生長4小時，然后在15℃下培養(yǎng)大約36小時。然后通過離心沉淀250ml的500ml細菌培養(yǎng)物，并且重新懸浮于25ml提取緩沖液(20mM Tris(pH 7.8)、300mM NaCl、5mMβ-巰基乙醇(BME)、20mM咪唑(Fluka/Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、125單位/ml的benzonase和10K單位/ml的溶菌酶(Novagen,Darmstadt,Germany)。將細胞漿液在20000psi下通過細胞破碎器一次，且然后通過在4℃下以35,000x g離心20分鐘來澄清此細胞裂解物。含有可溶性His標記的蛋白質的上清液用于蛋白質純化。對于此純化，按照標準制造商的方案使用AKTaxpress^TM系統(tǒng)(GE Healthcare,Piscataway,NJ)將上清液施加至1ml HisTrap^TM FF柱(Nickel Sepharose)(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。洗滌緩沖液由以下組成：20mM Tris pH 7.8、300mM NaCl、20mM咪唑和5mM BME。洗脫緩沖液的組成與洗滌緩沖液相同，除了使用500mM咪唑。根據制造商的方案，將來自鎳柱的洗脫液在Quick Spin Protein Sephadex G-25細柱(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)上脫鹽。洗脫的蛋白質在由以下組成的緩沖液中：20mM Tris pH 7.8、50mM NaCl和5mM BME。通過SDS-PAGE分析評估蛋白質提取物純度。通過Bradford測定使用Bio-Rad蛋白質測定染料試劑(Biorad,Hercules,CA,目錄號500-0006)來測定蛋白質濃度。

使用此實施例1中所述的酶測定，但使用四種不同的AOPP除草劑作為底物來分析五種工程化蛋白質的純化蛋白質：精喹禾靈、吡氟氯禾靈、噁唑禾草靈和吡氟禾草靈。使用2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)產生標準曲線，其用于產生一般的酚標準曲線?；诖藰藴是€計算在測定中由工程化蛋白質產生的苯酚的量。對照是純化的野生型酶、沒有酶且沒有底物。使用0、20、40、80、160、320、640或1280μM的精喹禾靈、吡氟氯禾靈、噁唑禾草靈或吡氟禾草靈除草劑進行五種工程化蛋白質的酶動力學測量。表3示出對于具有四種AOPP除草劑底物的五種蛋白質測量的Km和Vmax(表示為相對值)。具有四種AOPP除草劑中的每種作為底物的這五種工程化蛋白質的蛋白質特征證明，可通過蛋白質工程化顯著改變工程化蛋白質的酶活性，即Km和Vmax。

表3

實施例2：玉米中工程化蛋白質的表達

構建植物轉化載體，每個載體包含編碼具有針對單子葉植物表達優(yōu)化的蛋白質編碼序列的三種工程化蛋白質(MON-HT51(SEQ ID NO:3)、MON-HT52(SEQ ID NO:6)和MON-HT55(SEQ ID NO:13))中的一種的重組DNA分子。使用啟動子、前導序列、內含子和3'UTR以及有和無可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP的不同組合產生載體。載體中還包含第二DNA盒，所述DNA盒包含待在轉基因植物中用于草甘膦耐受性的cp4-EPSPS編碼序列。使用根癌土壤桿菌和本領域中已知的標準方法用這些載體轉化未成熟玉米(LH244)胚。使再生的R0轉基因小植物在溫室中生長，并且在大約V2-V4生長階段用0.04或0.08lb ai/英畝精喹禾靈(Assure^TMII,E.I.DuPont)噴灑，分別代表0.5X和1X速率。葉片樣品用于鑒定具有單拷貝的轉基因DNA插入片段(即，單事件植物)的轉基因植物。使僅含有單拷貝并通過0.5X或1X精喹禾靈噴灑測試的R0植物自交以產生R1種子。用含有MON-HT52的構建體沒有獲得事件。從含有具有CTP的MON-HT51的構建體和從含有不含CTP的MON-HT51的構建體再生僅一個事件。轉化兩對含有MON-HT55的載體，每對僅在含有CTP或不含有CTP方面不同。

表達有或無可操作地連接的CTP的MON-HT55的R1植物在溫室中生長，并且在V2生長階段以0.08lb ae/英畝(1X)的速率施加精喹禾靈除草劑。處理后11天評價植物的損傷。將R1植物以典型的孟德爾比率(Mendelian ratio)分離性狀，并且觀察到在除草劑處理后不存活的預期數目(約25％)的無效分離子(不含有轉基因性狀的子代植物)。除了代表一個事件的那些之外，表達具有可操作地連接的CTP的MON-HT55的所有R1轉基因植物在施加精喹禾靈后在最嫩的暴露的葉子上僅顯示少量褪綠斑點。在施加除草劑后，對于這些植物沒有記錄超過5％的損傷分數。未噴灑的轉基因植物也不與未噴灑的對照植物在表型上不同。圖1A示出在施加精喹禾靈后18天的對照LH244植物和包含MON-HT55(SEQ ID NO:13)的轉基因植物。

為了評估使用CTP將工程化蛋白質靶向植物細胞葉綠體的作用，比較了包含具有和不具有與蛋白質編碼序列可操作地連接的CTP的轉基因插入物的轉基因植物。包含與蛋白質編碼序列可操作地連接的CTP的植物與沒有CTP的植物相比顯示出對精喹禾靈的更好耐受性。在此實施例2中描述的R1溫室測試中，包含與蛋白質編碼序列可操作地連接的CTP的大多數轉基因植物顯示出完全精喹禾靈耐受性。不包含可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP的植物顯示精喹禾靈耐受性，但具有一些中度損傷表型。這些結果表明，使用CTP將工程化蛋白質靶向植物細胞葉綠體增強了轉基因植物的精喹禾靈耐受性。在使用包含有或無可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP的MON-HT51或者有或無可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP的MON-HT55的R1植物的性狀功效田間試驗中再次測試了這一出人意料的發(fā)現(xiàn)。這些R1植物是單拷貝的，但仍然是分離的。在此田間試驗中，將種子種植在田地中并如下處理：在植物前2X(0.16lb ai/英畝)精喹禾靈、在V4生長階段2X(0.14lb ai/英畝)吡氟氯禾靈、然后在V8生長階段2X精喹禾靈。與不包含可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP的植物相比，更高百分比的包含可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP的植物在精喹禾靈和吡氟氯禾靈施加后存活，并且具有更低的損傷分數。數據提供于表4中。這證實了出人意料的發(fā)現(xiàn)，即可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP賦予用于工程化蛋白質的除草劑施加以更高的植物耐受性。

表4

進行近交性狀功效田間試驗以評估在近交背景下對AOPP除草劑的耐受性和對環(huán)己二酮(CHD)除草劑的敏感性。R2近交植物通過自交純合的轉基因R1植物并收集種子而產生。在兩個田間位置處評價含有有或無CTP的MON-HT55或有CTP的MON-HT51的R2近交植物。除草劑處理是PRE(種植后但出苗前)施加的0.16lb ai/英畝的2X精喹禾靈，然后在V4生長階段施加的0.16lb ai/英畝的精喹禾靈，然后在V8生長階段施加的0.16lb ai/英畝的精喹禾靈。在除草劑施加后7-10天，將地塊以0-100的標度針對作物損傷進行評級，其中零是沒有受傷且100是完全作物死亡。使所有數據進行方差分析，并且在LSD(0.05)分離平均值。大多數近交的R1植物未顯示損傷，從而證實有或無CTP的MON-HT55和MON-HT51兩者賦予對玉米的精喹禾靈耐受性。為了測試對CHD除草劑(其對用于志愿者對照是合乎需要的)的敏感性，在V8生長階段用1X速率的烯草酮(0.25lb ai/英畝)處理植物。使用1X速率的烯草酮的志愿者對照對所有測試的轉基因植物是100％有效的。進行雜交性狀功效田間試驗以評估在雜交背景下對AOPP除草劑的耐受性和對環(huán)己二酮(CHD)除草劑的敏感性。通過使R1近交植物與非轉基因植物雜交并收集種子來產生F1雜交植物。在六個田間位置處評價所得到的含有有或無CTP的MON-HT55(SEQ ID NO:13)或者無CTP的MON-HT51(SEQ ID NO:3)的F1植物。在一系列環(huán)境條件下在六個位置處進行雜交性狀功效田間試驗，包括田間季節(jié)期間的高熱和干旱條件。這允許在高溫和水脅迫條件下在玉米中評價工程化蛋白質。數據提供于表5中。在施加后7-10天，來自精喹禾靈的2X施加的初始損傷高于所需(>10％損傷)。植物最終從大多數損傷中生長，與V4生長階段施加相比，V8生長階段施加通常具有更少的損傷。當精喹禾靈非常早地施加時(例如，在VE-V2生長階段)，也注意到過度損傷。

表5

使用基于植物的測定證實了以下發(fā)現(xiàn)：當在高溫的田間條件下生長時，表達工程化蛋白質MON-HT55或MON-HT51的雜交植物對精喹禾靈施加敏感。設計基于植物的測定以在田間測試之前在生長室中測試對F1雜交種的精喹禾靈的耐受性。使用含有玉米事件NK603(美國專利No.8,273,959)x MON89034(美國專利No.8,581,047)的植物的F1雜交種和含有MON-HT55x MON89034的植物的F1雜交種來開發(fā)測定。F1雜交種子在生長室中發(fā)芽1周，且然后移至三個不同生長室中的一個，以在20℃/20℃、28℃/20℃和38℃/30℃的日/夜溫度下適應兩天，然后施加2X(0.16lb ai/英畝)精喹禾靈。如所預期，在所有溫度方案中通過2X精喹禾靈施加嚴重損傷不含MON-HT55的植物(圖1B)。含有MON-HT55的轉基因植物當適應于20℃/20℃或28℃/20℃的晝/夜溫度時對2X精喹禾靈施加的良好耐受性，但當適應于38℃/30℃的晝/夜溫度時顯示顯著敏感性(圖1C)。這證實了基于植物的測定可用于針對溫度敏感活性篩選生長室中的植物中的蛋白質。

所述數據證明工程化蛋白質可在轉基因植物中表達以賦予除草劑耐受性，并且未噴灑的轉基因植物在表型上并未與未噴灑的對照植物不同。數據還證實植物中工程化蛋白質的表達允許使用CHD除草劑用于志愿者對照。出人意料地，數據表明使用CTP用于工程化蛋白質的葉綠體靶向增強了除草劑耐受性性狀，并且由工程化蛋白質提供的除草劑耐受性是溫度敏感的，從而在高溫條件下降低。

實施例3：優(yōu)化工程化蛋白質

當在高溫田間條件下生長時，表達工程化蛋白質MON-HT55或MON-HT51的雜交事件對精喹禾靈施加是敏感的發(fā)現(xiàn)是出人意料的，并且提供了能夠通過蛋白質工程化改變的另外蛋白質特征。開發(fā)了一系列新的體外酶測定和基于植物的酶活性測定來測試蛋白質對高溫的敏感性。

為了產生針對在更高溫度下的活性而優(yōu)化的工程化蛋白質，將在前兩輪蛋白質工程化中使用的蛋白質基序分析與幾種工程化蛋白質的晶體結構數據組合。這用于通知如前所述進行的另外幾輪的誘變，并且因此產生大約1400種另外的工程化蛋白質。將這些與實施例1中描述的大約1200種工程化蛋白質組合(總計大約2600種工程化蛋白質)以用于篩選新型溫度敏感性測定來鑒定針對在更高溫度下的活性優(yōu)化的蛋白質。

為了分析這些工程化蛋白質在更高溫度下的活性，修改實施例1中的體外酶測定以指定將所有測定組分預熱至所需溫度5分鐘，然后合并組分且隨后將反應維持在所需溫度下持續(xù)反應的持續(xù)時間。為了標準化測定測量，使用精喹禾靈作為反應的底物，并且基于25℃讀數將酶活性標準化。使用這些參數，計算酶活性為最大值的一半時的溫度(T_1/2)。MON-HT55的T_1/2計算為29℃，且野生型RdpA的T_1/2計算為38℃(圖2A)。

由于待測試的大量變體，所以使用五級篩選工藝。表6示出在不同篩選中測試的變體的近似數目。

表6

用大約2600種工程化蛋白質進行第一篩選，并且使用如實施例1中所描述的具有粗細菌裂解物的高通量細菌蛋白質表達和酶測定系統(tǒng)，但修改為在25℃和40℃的所需溫度下進行，在25℃下進行猝滅后顏色顯色。從此篩選，選擇且推進了大約1250種工程化蛋白質。第二篩選是相似的，但包括樣品中的蛋白質標準化。從此篩選，選擇且推進了94種工程化蛋白質。第三篩選使用如實施例1中所述的除草劑降解酶測定的純化蛋白質，但是修改為在25℃和40℃的所需溫度下進行，在25℃下進行猝滅后顏色顯色。從此篩選，選擇且推進了47種工程化蛋白質。使用純化的蛋白質進行第四篩選，將蛋白質濃度標準化，并且篩選包括精喹禾靈和(用于蛋白質變體的子集)2,4-D作為底物，在23℃和40℃下進行終點測定。從此篩選，選擇且推進了13種工程化蛋白質。

對于第五篩選，產生和純化11種工程化蛋白質中的每一種的重組蛋白質用于深入生物化學分析。此生物化學分析包括：(1)動態(tài)分析(Vmax和Km)，(2)在一定溫度范圍內的活性測定，(3)蛋白質熔化分析，(4)對另外的AOPP除草劑底物的活性，和(5)對肽的質譜分析以確認身份。還使用純化的重組野生型蛋白和MON-HT55蛋白進行生物化學分析以用于比較。對于動力學分析，非終點測定在23℃下以精喹禾靈或2,4-D作為底物進行。用于這些測定的重組蛋白在細菌中產生并且使用在蛋白質的C末端融合的6-His標簽進行純化。在表7中給出10種工程化蛋白質、野生型蛋白和MON-HT55蛋白的使用精喹禾靈或2,4-D作為底物的動力學分析的結果(標準誤差顯示在括號中)。Vmax表示為比活性，umol除草劑產物mg酶-1min-1；Km表示為mM除草劑底物。NDB指示在較高濃度的除草劑下酶活性可能是明顯的，但是在所測試的濃度下的活性不足夠穩(wěn)健來提供適當的動力學表征。對于MON-HT55，具有2,4-D作為底物的低活性水平(Vmax)產生報告值的低置信度。MON-HT7具有比野生型酶大大約40％的使用精喹禾靈的Vmax和僅為野生型酶的約一半的使用2,4-D的Vmax。MON-HT1具有為野生型酶的約一半的針對精喹禾靈的Vmax和比野生型酶高9.5倍的針對2,4-D的Vmax。MON-HT1和MON-HT7的蛋白質動力學的區(qū)別出人意料，因為MON-HT1與MON-HT7之間僅存在四個氨基酸差異。具體地說，MON-HT1在指定位置處具有以下氨基酸：I82；F105；T112；和V273，并且MON-HT7在指定位置處具有以下氨基酸：L82；V105；S112；和A273。

表7

對于MON-HT1、MON-HT2、MON-HT7和MON-HT8，深入分析了在一定溫度范圍內的酶活性。這些測定如上所述進行。使用精喹禾靈或2,4-D作為這些反應的底物，并且基于野生型酶在25℃下的活性將活性標準化?！闼@得的活性曲線示于圖2B(以精喹禾靈作為底物)和圖2C(以2,4-D作為底物)。使用精喹禾靈作為底物，MON-HT55是最溫度敏感的，其中T_1/2為29℃。野生型酶具有38℃的T_1/2。MON-HT1和MON-HT8比野生型酶溫度敏感性低，分別具有42℃和41℃的T_1/2，野生型酶在所述溫度下是90％無活性的。MON-HT2和MON-HT7溫度敏感性低得多，分別具有46℃和47℃的T_1/2，野生型酶在所述溫度下是完全無活性。當使用2,4-D作為底物時，野生型酶具有36℃的T_1/2。MON-HT2、MON-HT7和MON-HT8的溫度敏感性都略微更高，具有比野生型酶更低的T_1/2。MON-HT1的溫度敏感性略低，具有比野生型酶高約1℃的T_1/2。

還進行蛋白質熔化分析。對于蛋白質熔化測定，將純化的酶添加至有或無50uM Fe2+和1.0mM aKG的標準儲存緩沖液(30mM Tris pH7.5，150mM NaCl)中的96孔微量滴定板。然后用BioRad CFX96^TM實時PCR機器(BioRad,Hercules,CA)中的橙色蛋白凝膠染色劑(Invitrogen^TM目錄號S6651，Life Technologies,Grand Island,NY)檢測蛋白質解折疊，所取得的讀數在10℃至95℃之間，步幅為0.5℃。T_1/2(在此，50％的蛋白質解折疊的溫度)顯示在表8中。野生型酶顯示用50uM Fe2+和1.0mM aKG穩(wěn)定化。相比之下，50uM Fe2+和1.0mM aKG對任何工程化蛋白質的穩(wěn)定性幾乎沒有影響。MON-HT55、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT6和MON-HT10具有在41℃至48℃范圍內的熔化溫度，其低于野生型酶的熔化溫度。MON-HT1、MON-HT2、MON-HT5、MON-HT7、MON-HT8和MON-HT9的熔化溫度在58℃與67℃之間，其比野生型酶高8℃至17℃。對于MON-HT7和MON-HT1，不含F(xiàn)e2+和aKG的緩沖液中的熔點差為11℃，并且在具有Fe2+和aKG的緩沖液中的熔點差為8℃。這是出人意料的，因為在兩種酶之間僅存在四個氨基酸差異。關于酶熔點的此數據證實了工程化蛋白質已經針對更高溫度下的蛋白質穩(wěn)定性進行了優(yōu)化。此數據還匹配在不同溫度下進行的蛋白質的酶活性測定結果。

表8

使用在23℃下用純化的酶進行的酶活性測定來測定具有吡氟氯禾靈、噁唑禾草靈、吡氟禾草靈和2,4-滴丙酸作為底物的MON-HT蛋白變體的酶活性。將活性記錄為作為野生型酶活性的百分比的最大活性，其設定為100％。數據提供于表9中。MON-HT55、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5和MON-HT9對于低于或等于具有同一底物的野生型酶的最大活性的所有四種底物具有最大活性。以吡氟氯禾靈作為底物，MON-HT1、MON-HT2、MON-HT7和MON-HT10具有大于野生型酶的最大活性的最大活性。以噁唑禾草靈作為底物，MON-HT1、MON-HT2、MON-HT6、MON-HT7、MON-HT8和MON-HT10具有比野生型酶的最大活性更大的最大活性。以吡氟禾草靈作為底物，MON-HT2和MON-HT7具有比野生型酶的最大活性更大的最大活性。以2,4-滴丙酸作為底物，MON-HT1、MON-HT7和MON-HT8具有比野生型酶的最大活性更大的最大活性。

表9

使用質譜確認酶身份。對于此分析，在PAGE凝膠上分離純化的蛋白質并染色。然后切下染色的條帶、脫色并使用標準方案消化胰蛋白酶。在標準條件下，使用Thermo Scientific^TM AQUASIL^TM C-18Javelin^TM Guard柱，在Dionox3000RSLCnano LC系統(tǒng)(Thermo Scientific,Sunnyvale,CA)上分離胰蛋白酶消化的蛋白質制劑，并注射用于使用Thermo Scientific^TM Q Exactive^TM雜合四極軌道阱質譜儀(Thermo Scientific，Sunnyvale，CA)的MS-MS分析。

為了在苯氧基酸除草劑存在下優(yōu)化蛋白質以增加活性，對幾種工程化蛋白質的晶體結構進行計算蛋白質工程化。這用于報告如上所述進行的另外幾輪誘變，但使用編碼蛋白質序列MON-HT1(SEQ ID NO:14)的細菌序列SEQ ID NO:15作為起始序列。產生大約472種另外的工程化蛋白質。將這些與實施例1和表6中描述的大約2600種工程化蛋白質組合以獲得總共大約3072種工程化蛋白質，以鑒定在2,4-D存在下針對活性優(yōu)化的蛋白質。新變體的第一篩選是如實施例1中所述的具有粗細菌裂解物的高通量(HTP)細菌蛋白質表達和酶測定系統(tǒng)，但修改為在25℃和40℃的所需溫度下進行，其中在25℃下進行猝滅后顏色顯色。在此HTP篩選之后，選擇大約34種工程化蛋白質，并且將其推進到所有樣品中進行蛋白質標準化篩選。從此篩選中，選擇12種工程化蛋白質，并且推進至使用用如實施例1所述的除草劑降解酶測定來測定的純化蛋白質的篩選。用有限蛋白質熔化測定來測定酶熱穩(wěn)定性。從此篩選，選擇7種工程化蛋白質且推進用于植物測試。選擇三種酶變體用于使用純化蛋白質的詳細表征，其中將蛋白質濃度標準化，并且篩選包括精喹禾靈和2,4-D作為底物，以及表10和表12中所示的另外除草劑和蛋白質熔化表征。

使用非終點測定的動力學分析在23℃下以精喹禾靈或2,4-D為底物進行，如上文對野生型酶的純化蛋白質MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17所詳述。當用2,4-D作為底物進行測試時，數據表明相對于野生型RdpA酶和MON-HT1酶，MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17的酶活性顯著和出人意料的增強。具體地說，所有三種變體相對于MON-HT1顯示大約2.5至3倍的活性增加(Vmax)。具有喹禾靈作為底物的MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17變體的酶活性與MON-HT1的活性大致相似。參見表10。

表10

如上詳述進行蛋白質熔化分析。MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17的熔化溫度類似于MON-HT1的熔化溫度，其中緩沖液中的T_1/2在55℃-58℃的范圍內，并且在緩沖液加Fe2+和aKG中的T_1/2在60℃-62℃的范圍內。這些數據表明，與MON-HT1相比，MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17變體具有相似的酶熱穩(wěn)定性。關于酶變體熔點的此數據證實了工程化蛋白質已經針對更高溫度下的蛋白質穩(wěn)定性進行了優(yōu)化。參見表11。

表11

使用在23℃下用純化的酶進行的酶活性測定來測定具有綠草定、氟草煙、MCPA、MCPB、2-甲-4-氯丙酸作為底物的MON-HT蛋白變體的酶活性。將活性記錄為作為野生型RdpA酶活性的百分比的最大活性，其設定為100％。數據提供于表12中。對于以除草劑綠草定和氟草煙作為底物測定的每種蛋白質(MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17)，存在可檢測的活性，特別是在工程化變體中，但活性不足夠穩(wěn)健來量化。對于以除草劑MCPB作為底物測定的每種蛋白質(MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17)，不存在可檢測的活性。與野生型RdpA酶相比，用2-甲-4-氯丙酸作為底物的酶活性對于MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17變體中的每一種降低。出人意料的結果是，與野生型RdpA酶相比，用MCPA作為底物的酶活性對于MON-HT1大大約6倍，且對于MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17大大約10倍。參見表12。

表12

實施例4：玉米中優(yōu)化的工程化蛋白質的表達

選擇在較高溫度下針對活性優(yōu)化的十種獨特的工程化蛋白質以用于玉米轉化和植物中的分析。產生DNA構建體以用于使用本領域的技術人員已知的方法表達具有針對單子葉植物表達優(yōu)化的密碼子使用的這些工程化蛋白質。在這些DNA構建體中，在與工程化蛋白質的不同組合中測試了增強子、啟動子、前導序列、內含子、CTP和3'UTR。DNA構建體用于使用根癌土壤桿菌和本領域中已知的標準方法用這些載體轉化未成熟的玉米(LH244)胚。將再生的R0轉基因小植株在溫室中生長。

在移植到塞后7至10天(通常對應于V3-V4生長階段)，通過施加精喹禾靈(2X)加2,4-D(2X)來篩選轉基因R0玉米植物。測試的所有構建體產生含有通過R0篩選的獨特事件的植物。使R0植物自交以產生R1純合種子，并且R0也用作雄性以與含有玉米事件MON89034的近交植物雜交以產生用于功效田間試驗的分離F1雜交種子。

用分離的F1雜交植物進行功效田間試驗，其中50％對于轉基因是半合子的且50％對于轉基因是無效的。使用兩種除草劑施加方案評估對精喹禾靈(2X)加2,4-D(2X)的耐受性：(1)在VE-V2生長階段施加的0.16lb ai/英畝(2X)的精喹禾靈(Assure II)加0.25％v/v非離子型表面活性劑(NIS)，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同，以及(2)在VE-V2生長階段施加的2lb ae/英畝(2X)的2,4-D胺加0.04lb ai//英畝(0.5X)的精喹禾靈加0.25％v/v NIS，接著在V4生長階段施加的2lb ae/英畝(2X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS，接著在V8生長階段相同。在VE-V2生長階段通過第一精喹禾靈施加除去對轉基因來說無效的50％植物。在針對作物損傷施加后10-14天，以0至100的標度對地塊進行視覺評級，其中“0”是無且“100”是完全的作物破壞。表13顯示對于兩種噴灑方案在V4和V8生長階段評級的平均損傷。<10％的損傷評級被認為是非常良好的耐受性，并且<20％的損傷評級被認為良好至中等的耐受性。在V8生長階段用2,4-D的2X施加評級的損傷百分比在高40％至低0的范圍內。類似地，在V8生長階段用精喹禾靈的2X施加評級的損傷百分比在高90％至低0的范圍內。表達相同蛋白質的植物之間損傷評級的變化可能是由于構建體設計或轉基因插入位置的變化所致。此數據證實，表達工程化蛋白質的植物在2X速率下顯示對2,4-D和喹禾靈除草劑的耐受性。

表13

使用用于熱敏感性的基于植物的酶活性測定來確定升高的生長溫度對含有優(yōu)化的工程化蛋白質的轉基因植物的除草劑耐受性的影響。為了在升高的生長溫度下測試精喹禾靈耐受性，F(xiàn)1雜交(通過將表達MON-HT蛋白中的一種的R1純合植物與近交玉米事件MON89034雜交產生)玉米種子在28℃的白日溫度和20℃的夜間溫度與50％濕度在生長室中生長10天。10天后，在三種不同的白日和夜間溫度方案中的一種將植物移動以適應3天：(1)設定在20℃下的白日溫度和夜間溫度；(2)28℃的白日溫度和20℃的夜間溫度；或(3)38℃的白日溫度和30℃的夜間溫度。在適應期結束時，植物通常處于V4生長階段并且用2X精喹禾靈噴灑。處理后10天，將植物以1至5的評級標度針對損傷進行評分，其中‘0’是未觀察到可見的損傷，‘1’是褪綠斑點，‘2’是褪綠條紋，‘3’存在葉隙或裂紋，‘4’是具有生長遲緩和/或扭曲葉子的植物，并且‘5’是死植物或觀察不到生長。結果呈現(xiàn)于圖4中。當晝/夜溫度是20℃/20℃(圖4A)或28℃/20℃(圖4B)時，相對于F1雜交對照植物(玉米事件NK603X MON89034)(損傷評級為5)，表達MON-HT55的F1雜交玉米植物對噴灑處理顯示出良好的耐受性(損傷評級為約2)。當晝/夜溫度是38℃/30℃時，F(xiàn)1雜交對照植物的損傷評級為5，表達MON-HT55的F1雜交植物的平均損傷評級為3，并且表達MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4或MON-HT7的F1雜交植物的損傷評級≤1(圖4C)。當表達這些工程化蛋白質的植物暴露于高溫時，在更高溫度下針對活性優(yōu)化的工程化蛋白質提供AOPP除草劑耐受性。

為了在升高的生長溫度下測試2,4-D耐受性，通過將含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT7或MON-HT55的R1植物與含有玉米事件MON89034的近交植物雜交來產生F1雜交植物。將F1雜交植物在溫室中在20℃的最低溫度和28℃的最大溫度下在50％至80％濕度下生長一周。1周后，將植物移動以在兩種不同的白日溫度和夜間溫度方案中的一種下適應三天：(1)白日溫度和夜間溫度兩者均設定在20℃或(2)38℃的白日溫度和30℃的夜間溫度。在適應期結束時，植物通常處于V4生長階段并且用4X 2,4-D胺噴灑。處理后10天，使用0至100的損傷標度對植物的損傷評分，其中“0”是不損傷且“100”是死植物。在施加4X 2,4-D胺之前，當使植物在20℃/20℃的白日/夜間溫度下適應時，含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT7或MON-HT55的F1植物的損傷評級平均值<10％，并且對照植物的損傷評級平均值<20％(圖4D)。在施加4X 2,4-D胺之前，當使植物在38℃/30℃的白日/夜間溫度下適應時，含有MON-HT4或MON-HT7的F1植物具有<20％的損傷評級平均值，含有MON-HT1、MON-HT2或MON-HT3的F1植物具有<10％的損傷評級平均值(圖4E)，并且對照植物和含有MON-HT55F1植物的植物具有50％的損傷評級平均值(圖4E)。這些結果表明，當表達這些工程化蛋白質的植物暴露于高溫時，針對在較高溫度下的活性優(yōu)化的工程化蛋白質提供2,4-D除草劑耐受性。

在兩個位置處進行精喹禾靈和2,4-D的單獨性狀功效田間試驗，每個位置具有通過將含有玉米事件MON89034的近交植物與含有MON-HT55(具有CTP)、MON-HT1(有或無CTP)、MON-HT2(有或無CTP)、MON-HT3(具有CTP)、MON-HT4(具有CTP)、MON-HT5(具有CTP)、MON-HT6(具有CTP)或MON-HT7(具有CTP)的R1植物雜交產生的F1雜交轉基因植物。將含有玉米事件NK603x MON89034的轉基因F1雜交植物作為對照進行比較。

在精喹禾靈耐受性和烯草酮敏感性的功效田間試驗中，使用四種除草劑處理中的一種：(1)在VE-V2生長階段施加的0.32lb ai/英畝(4X)的精喹禾靈(Assure II)加0.25％v/v非離子型表面活性劑(NIS)，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同；(2)在VE至V2生長階段施加的0.64lb ai/英畝(8X)的精喹禾靈加0.25％v/v NIS，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同；(3)在VE至V2生長階段施加的1.28lb ai/英畝(16X)的精喹禾靈加0.25％v/v NIS，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同；或(4)在V8生長階段施加的0.25lb ai/英畝(1X)的烯草酮加0.25％v/v NIS。在針對作物損傷施加后10-14天，以0至100的標度對地塊進行視覺評級，其中“0”是無且“100”是完全的作物破壞。表14和表15分別顯示在V4或V8生長階段施加除草劑后的平均損傷評級。

含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5、MON-HT6或MON-HT7(全部可操作地連接至CTP)的植物顯示對精喹禾靈的非常良好的耐受性，其中在所有施加速率和在V4生長階段和V8生長階段兩者的損傷評級均小于15％。含有可操作地連接至CTP的MON-HT55的植物顯示中度至較差耐受性，其中損傷評級為0.8％至78.8％。在精喹禾靈施加后對照植物的損傷評級是99.5％。這些結果表明，含有可操作地連接至CTP的MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5、MON-HT6或MON-HT7的植物對精喹禾靈的連續(xù)施加具有非常良好的耐受性。

含有具有可操作連接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物對含有無可操作地連接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物具有更好的對精喹禾靈的耐受性。相較于含有無可操作連接的CTP的MON-HT1的植物的3.3％至18.8％損傷評級，含有具有可操作連接的CTP的MON-HT1的植物在所有精喹禾靈施加中具有0％至5.5％損傷評級。相較于含有無可操作連接的CTP的MON-HT2的植物的16.3％至82.5％損傷評級，含有具有可操作連接的CTP的MON-HT2的植物在所有精喹禾靈施加中具有1.5％至10％損傷評級。圖5示出在VE至V2生長階段施加的1.28lb ai/英畝(16X)精喹禾靈施加(處理3)加0.25％v/v NIS、隨后在V4生長階段相同、隨后在V8生長階段相同之后10至14天，含有可操作地連接至CTP的MONT-HT2的植物(圖5A)和含有無CTP的MON-HT2的植物(圖5B)。對照植物不能存活，含有無CTP的MON-HT2的植物具有中度至較差耐受性，并且含有可操作地連接至CTP的MON-HT2的植物具有對精喹禾靈施加的強耐受性。這些結果證實，使用可操作連接的CTP大大提高了精喹禾靈耐受性。

所有轉基因植物對在V8生長階段施加的1X烯草酮(0.25lb ai/英畝)的施加具有90％以上的損傷評級，從而證明在含有工程化蛋白質的轉基因植物中使用這種除草劑用于志愿者對照。

在2,4-D耐受性的功效田間試驗中，使用四種除草劑處理中的一種：(1)施加至VE至V2、隨后V4、隨后V8的2lb ae/英畝(2X)的2,4-D胺加0.25％v/v非離子型表面活性劑(NIS)；(2)施加至VE至V2、隨后V4、隨后V8的4lb ae/英畝(4X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；(3)施加至VE至V2、隨后V4、隨后V8玉米的8lb ae/英畝(8X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；或(4)施加至VE至V2、隨后V4、隨后V8的16lb ae/英畝(16X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS。如上對地塊目測評級。表14和表15分別顯示在V4或V8生長階段施加除草劑后的平均損傷評級。

含有MON-HT1、MON-HT2或MON-HT6(全部可操作地連接至CTP)的植物顯示對2,4-D的非常良好的耐受性，其中損傷評級分別在V4和V8生長階段的所有施加速率下小于10％和小于17％。含有MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5或MON-HT7(全部可操作地連接至CTP)的植物顯示對2,4-D的良好耐受性，其中損傷評級分別在V4和V8生長階段的所有施加速率下小于20％和小于22％。含有可操作地連接至CTP的MON-HT55的植物顯示中度至較差耐受性，其中損傷評級為7.5％至66％。在2,4-D施加后對照植物的損傷評級在40％至82.2％的范圍。這些結果表明，含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5、MON-HT6或MON-HT7的植物對2,4-D的連續(xù)施加具有良好耐受性。

含有具有可操作連接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物通常不顯示與含有無可操作地連接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物相比對2,4-D的耐受性顯著差異，如在精喹禾靈施加情況下所觀察到。相較于含有無可操作連接的CTP的MON-HT1的植物的0％至13.8％損傷評級，含有具有可操作連接的CTP的MON-HT1的植物在所有2,4-D施加中具有0％至16.3％損傷評級。相較于含有無可操作連接的CTP的MON-HT2的植物的1.3％至21.3％損傷評級，含有具有可操作連接的CTP的MON-HT2的植物在所有2,4-D施加中具有1.3％至15％損傷評級。然而，與無CTP的植物(在8X下13.75％損傷評級并且在16X下21.25％損傷評級)相比，在含有具有可操作地連接的CTP的MON-HT2的植物的V4生長階段的2,4-D施加之后差異是顯著的(在8X下4.5％損傷評級并且在16X下7.5％損傷評級)。

表14

表15

實施例5：評價葉綠體靶向肽對玉米中的優(yōu)化的工程化蛋白質的表達的影響

為了評價不同的葉綠體靶向肽(CTP)，構建了植物轉化載體，每個載體包含針對單子葉植物表達優(yōu)化的重組DNA分子并且編碼MON-HT1(SEQ ID NO:16)、MON-HT2(SEQ ID NO:20)和MON-HT8(SEQ ID NO:39)、MON-HT9(SEQ ID NO:42)或MON-HT10(SEQ ID NO:45)。使用啟動子、前導序列、內含子和3'-UTR的相同組合、但是具有三種獨立的CTP(A、B或C)中的一種或無可操作地連接至蛋白質編碼序列的CTP產生載體。參見表16。DNA構建體用于使用根癌土壤桿菌和本領域中已知的標準方法轉化未成熟的玉米(LH244)胚。將再生的R0轉基因小植株在溫室中生長。使R0植物自交以產生R1純合種子。R0植物還被用作雄株以與含有玉米事件MON89034的近交植物雜交，以產生用于性狀功效田間試驗的分離F1雜交種子。

在兩個位置處進行精喹禾靈和2,4-D的單獨性狀功效田間試驗，每個位置具有純合近交轉基因植物(R2或R4傳代)。在這些田間試驗中，使用了兩種除草劑處理中的一種：(1)在V4生長階段施加0.16lb ai/英畝(2X)的精喹禾靈(Assure II)加0.25％v/v非離子型表面活性劑(NIS)，隨后在V8生長階段相同；或(2)施加至V4、隨后V8的2lb ae/英畝(2X)的2,4-D胺加0.25％v/v非離子型表面活性劑(NIS)。在V4和V8施加10至14天后，取得損傷評級(在V4(CIPV4)或V8(CIPV8)的作物損傷百分比)。使用LSD(0.05)計算誤差。結果表明，在V4和V8施加后，這些植物具有對精喹禾靈或2,4-D的2X連續(xù)施加的耐受性，其中損傷評級低于10％。參見表16。

表16

從含有編碼有或無CTP序列的MON-HT1、MON-HT2和MON-HT8的轉基因盒的植物收集葉樣品，以測定從編碼工程化蛋白質的轉基因盒轉錄的mRNA的表達。對葉樣品提取物進行分析，以確定轉基因盒的mRNA表達。對于這些測定，探針是存在于用于產生轉基因植物的每個表達盒中的共同3'-UTR序列。通過標準化至玉米管家基因來計算相對表達。對于用于制備轉基因植物的每種構建體構型，從八種植物中的每種收集葉樣品，并且所報告的相對mRNA表達數據是具有標準誤差的八種樣品的平均值。

含有編碼MON-HT1(SEQ ID NO:14)或MON-HT2(SEQ ID NO:18)的轉基因構建體的植物對于含有‘A’或‘B’CTP的構建體具有比對無CTP或有‘C’CTP的構建體更高的相對轉基因mRNA表達。含有編碼MON-HT8(SEQ ID NO:37)的轉基因構建體的植物對于含有三種CTP(A、B或C)中任一種的構建體具有類似高的相對轉基因mRNA表達。參見表17。

表17

在一個位置處進行精喹禾靈和2,4-D壓力篩選的單獨性狀功效田間試驗，每個位置具有通過將含有玉米事件MON89034的近交植物與含有有或無可操作連接的CTP序列的MON-HT1、MON-HT2、MON-HT8、MON-HT9和MON-HT10的R1植物雜交而產生的F1雜交轉基因植物。將含有玉米事件NK603x MON89034的轉基因F1雜交植物作為對照進行比較。

在精喹禾靈耐受性的功效田間試驗中，使用三種除草劑處理中的一種：(1)在VE-V2生長階段施加的0.32lb ai/英畝(4X)的精喹禾靈(Assure II)加0.25％v/v非離子型表面活性劑(NIS)，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同；(2)在VE-V2生長階段施加的0.64lb ai/英畝(8X)的精喹禾靈加0.25％v/v NIS，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同；(3)在VE-V2生長階段施加的1.28lb ai/英畝(16X)的精喹禾靈加0.25％v/v NIS，隨后在V4生長階段相同，隨后在V8生長階段相同。如上對地塊目測評級。表18顯示分別在V4(CIPV4)或V8(CIPV8)生長階段施加除草劑后的平均損傷評級。在所有精喹禾靈施加后對照植物的損傷評級是100％。使用LSD(0.05)計算誤差。

表18

含有具有三種可操作連接的CTP(A、B或C)中的任一種的MON-HT1的植物與含有無可操作地連接的CTP的MON-HT1的植物相比，對精喹禾靈具有更好的耐受性。含有具有可操作地連接的‘A’CTP的MON-HT1的植物在所有精喹禾靈施加中具有0％至15％的損傷評級。含有具有可操作地連接的‘B’CTP的MON-HT1的植物在所有精喹禾靈施加中具有2.5％至20％的損傷評級。含有具有可操作地連接的‘C’CTP的MON-HT1的植物與含有無可操作地連接的CTP的MON-HT1的植物(其在所有精喹禾靈施加中具有2.5％至37.5％的損傷評級)相比，在所有精喹禾靈施加中具有0％至20％的損傷評級。

含有具有三種可操作連接的CTP(A、B或C)中的任一種的MON-HT2的植物與含有無可操作地連接的CTP的MON-HT2的植物相比，對精喹禾靈具有更好的耐受性。含有具有可操作地連接的‘A’CTP的MON-HT2的植物在所有精喹禾靈施加中具有0％至15％的損傷評級。含有具有可操作地連接的‘B’CTP的MON-HT2的植物在所有精喹禾靈施加中具有0％至20％的損傷評級。含有具有可操作地連接的‘C’CTP的MON-HT2的植物與含有無可操作地連接的CTP的MON-HT2的植物(其在所有精喹禾靈施加中具有35％至70％的損傷評級)相比，在所有精喹禾靈施加中具有0％至20％的損傷評級。

含有具有可操作連接的‘A’或‘B’CTP的MON-HT8的植物與含有具有可操作地連接的‘C’CTP的MON-HT8的植物相比，對精喹禾靈具有更好的耐受性。含有具有可操作地連接的‘A’CTP的MON-HT8的植物在所有精喹禾靈施加中具有15％至60％的損傷評級。含有具有可操作地連接的‘B’CTP的MON-HT8的植物與含有具有可操作地連接的‘C’CTP的MON-HT8的植物(其在所有精喹禾靈施加中具有45％至85％的損傷評級)相比，在所有精喹禾靈施加中具有5％至35％的損傷評級。

含有具有三種可操作地連接的CTP中的任一種的MON-HT1或MON-HT2的植物和含有具有可操作地連接的‘A’CTP的MON-HT9或MON-HT10的植物與含有具有三種可操作地連接的CTP中的任一種的MON-HT8的植物相比，對精喹禾靈具有更好的耐受性。含有具有可操作地連接的‘A’CTP的MON-HT9或MON-HT10的植物在所有施加中對精喹禾靈具有耐受性，其與含有具有三種可操作地連接的CTP中的任一種的MON-HT1或MON-HT2的植物相當。在喹禾靈施加的最高速率(16X)下，含有具有可操作連接的‘A’CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物與含有具有可操作連接的‘B’或‘C’CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物相比，具有略微更高的耐受性。

在2,4-D耐受性的性狀功效田間試驗中使用了三種除草劑處理：(1)施加至VE-V2、隨后V4、隨后V8的4lb ae/英畝(4X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；(2)施加至VE-V2、隨后V4、隨后V8玉米的8lb ae/英畝(8X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；或(3)施加至VE-V2、隨后V4、隨后V8的16lb ae/英畝(16X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS。如上對地塊目測評級。

表19顯示分別在V4(CIPV4)或V8(CIPV8)生長階段施加2,4-D除草劑后玉米中的平均損傷評級。在所有2,4-D施加后對照植物的損傷評級在80％至96.25％的范圍內。在通過V8施加的最高2,4-D速率(16x)下，與含有未可操作地連接至CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物相比，含有可操作地連接至三種CTP(A、B或C)中的任一種的MON-HT1或MON-HT2的植物具有更好的耐受性。與具有可操作地連接的‘A’CTP的MON-HT9或MON-HT10的植物相比，含有有或無可操作地連接的CTP的MON-HT1、MON-HT2或MON-HT8的植物對在所測試的所有施加下的2,4-D具有更好耐受性。在2,4-D施加范圍內，耐受性的相對排序是：含有MON-HT1的植物具有比含有MON-HT2的植物更好的耐受性，所述含有MON-HT2的植物進而比含有MON-HT8的植物更佳。與來自精喹禾靈壓力測試試驗的數據一致，含有可操作地連接至‘A’CTP的MON-HT1、MON-HT2或MON-HT8的植物顯示相對于‘B’和‘C’轉運肽的稍微數學但不具有統(tǒng)計學意義的優(yōu)勢。使用LSD(0.05)計算誤差。

表19

實施例6：大豆中優(yōu)化的工程化蛋白質的表達

選擇兩種工程化蛋白質用于在轉基因大豆中進行分析。產生DNA構建體以用于使用本領域的技術人員已知的方法表達具有針對雙子葉植物表達優(yōu)化的密碼子使用的MON-HT1(SEQ ID NO:14)和MON-HT2(SEQ ID NO:18)。在這些DNA構建體中，不同組合的增強子、啟動子、前導序列、內含子、CTP和3'UTR可操作地連接至工程化蛋白質。DNA構建體用于使用根癌土壤桿菌和本領域中已知的標準方法轉化大豆。將再生的R0轉基因小植株在溫室中生長。在1-2三葉葉片階段轉化后大約9周，鑒定單拷貝R0事件，并且以0.5X(0.375lb ae/英畝)、2X(1.5lb ae/英畝)或4X(3.0lb ae/英畝)的速率噴灑2,4-D除草劑。在除草劑施加后大約2周，對植物按1至3的標度進行除草劑損傷評級，其中1＝幾乎無至無損傷(<20％)，2＝中度損傷(20％-50％)和3＝嚴重損傷(>50％)。

含有每種構建體的R0大豆植物顯示對2,4-D的耐受性，幾乎無至無損傷(<20％損傷)或中度損傷(20％-50％)。數據提供于表20中。這表明工程化蛋白質MON-HT1和MON-HT2可在大豆植物中賦予對2,4-D的耐受性。

表20

然后選擇針對2,4-D的活性優(yōu)化的另外5種工程化蛋白質以用于在轉基因大豆中的分析。產生DNA構建體以用于表達MON-HT13(SEQ ID NO:47)、MON-HT14(SEQ ID NO:48)、MON-HT15(SEQ ID NO:49)、MON-HT17(SEQ ID NO:51)和MON-HT18(SEQ ID NO:52)，其具有針對雙子葉表達優(yōu)化的密碼子使用。在所有構建體中，可操作地連接的表達元件(啟動子、前導序列、內含子、CTP和3'UTR)是相同的。從R0小植株獲取葉樣品，并且使用基于PCR的測定鑒定單拷貝植物。當單拷貝R0植物具有大約2至3個三葉葉片時，將它們用1.5lb ae/英畝(2X)或3.0lb ae/英畝(4X)的2,4-D處理。在除草劑施加后7天，如上所述，基于顯示損傷的植物的面積百分比針對植物進行除草劑損傷評分。

在2X施用速率下，含有六種MON-HT變體(MON-HT1、MON-HT13、MON-HT14、MON-HT15、MON-HT17和MON-HT18)中的任一種的大豆植物顯示對2,4-D處理的優(yōu)異耐受性，如通過單拷貝植物中除兩種之外全部具有<20％的損傷評級所證明；這兩個事件(一個針對MON-HT13且一個針對MON-HT18)具有20％-30％的損傷評級。在4X施加速率下，在含有MON-HT1的11株單拷貝植物中，5株植物的損傷評分<20％，并且6株植物的損傷評分是20％-50％。在含有MON-HT13的11株單拷貝植物中，10株植物的損傷評分<20％，并且1株植物的損傷評分是20％-50％。在含有MON-HT14的8株單拷貝植物中，6株植物的損傷評分<20％，1株植物的損傷評分是20％-50％，并且1株植物的損傷評分>50％。在含有MON-HT15的7株單拷貝植物中，5株植物的損傷評分<20％，1株植物的損傷評分是20％-50％，并且1株植物的損傷評分>50％。在含有MON-HT17的11株單拷貝植物中，所有11株植物的損傷評分<20％。在含有MON-HT18的12株單拷貝植物中，9株植物的損傷評分<20％，并且3株植物的損傷評分是20％-50％。這些結果表明含有MON-HT1(SEQ ID NO:14)、MON-HT13(SEQ ID NO:47)、MON-HT14(SEQ ID NO:48)、MON-HT15(SEQ ID NO:49)、MON-HT17(SEQ ID NO:51)或MON-HT18(SEQ ID NO:52)的大豆植物在4X施加速率下具有對2,4-D的耐受性。此外，這證明與MON-HT1(SEQ ID NO:14)相比，含有MON-HT13(SEQ ID NO:47)、MON-HT14(SEQ ID NO:48)、MON-HT15(SEQ ID NO:49)、MON-HT17(SEQ ID NO:51)或MON-HT18(SEQ ID NO:52)的大豆植物在4X施加速率下具有改善的2,4-D耐受性?；趽p傷評分<20％的單拷貝植物的百分比，與含有MON-HT1、MON-HT14、MON-HT15或MON-HT18的大豆植物相比，含有MON-HT13或MON-HT17的大豆植物對以4X速率施加的2,4-D具有更好耐受性。參見表21。

表21

實施例7：對合成植物生長素氟草煙、綠草定和MCPA的耐受性

測定含有MON-HT1的玉米和大豆植物對2,4-D、氟草煙、綠草定和MCPA的施加的耐受性。將含有具有‘A’CTP的MON-HT1的三個獨特事件的F1雜交玉米種子和R2大豆種子種植在盆中。使用用于植物轉化的含有NK603x MON89034雜交玉米種子和相同大豆種質作為對照。將植物生長在溫室中，并且四株植物用于每次處理。當植物在6-8英寸(大豆)與10-12英寸(玉米)高之間時，將植物在生長室中噴灑除草劑，然后轉移至編程為維持最佳生長條件的溫室中。

對于大豆，使用以下各項中的每一種的2X除草劑施加速率：(1)2,4-D胺4(1680g ae/ha)；(2)綠草定(840g ae/ha，)；(3)氟草煙(840g ae/ha，)；或(4)MCPA(g ae/ha 1680)。在施加綠草定、氟草煙或MCPA后，大豆上的主要癥狀是嚴重的壞死和偏上性。對所有處理按0％至100％的評級標度進行視覺植物損傷評級，其中0％表示與未處理的對照等效的植物，并且100％表示完全死亡的植物。所有評級均在處理后7天進行。與90％-97％作物損傷的對照相比，所有三種大豆MON-HT1事件的植物顯示對2,4-D胺(2,4-D)的良好耐受性，平均小于7％作物損傷。沒有大豆事件表現(xiàn)出對綠草定或氟草煙的耐受性，與91％作物損傷的對照相比，在所有三個事件中的損傷評級平均為81％-97％作物損傷。與90％損傷的對照相比，三個大豆事件中的一種顯示對MCPA的低水平耐受性，其中平均損傷評級為72％，而另外兩個事件具有90％作物損傷。參見表22。

表22

對于玉米，使用以下各項中的每一種的4X除草劑施加速率：(1)2,4-D胺4(3360g ae/ha)；(2)綠草定(1680g ae/ha，)；(3)氟草煙(1680g ae/ha，)；或(4)MCPA(g ae/ha 3360)。在施加綠草定、氟草煙或MCPA至玉米后，主要癥狀是倒伏。與43％作物損傷的對照相比，所有三個玉米MON-HT1事件的植物耐受2,4-D，平均小于15％損傷。與具有47％作物損傷的對照相比，三個MON-HT1玉米事件似乎顯示對綠草定的一些低水平耐受性，其中作物損傷平均為26％-37％。與具有55％作物損傷的對照相比，三個MON-HT1玉米事件似乎顯示對氟草煙的一些低水平耐受性，其中作物損傷平均為20％-21％。與31％作物損傷的對照相比，MON-HT1玉米事件中的兩個顯示對MCPA的良好耐受性，其中平均作物損傷小于6％。第三玉米MON-HT1事件的平均損傷評級為20％。參見表23。對綠草定和氟草煙的低耐受性和對MCPA的良好耐受性的這些結果與純化的MON-HT1酶的體外酶數據一致。

表23