本發(fā)明涉及病毒抗性煙草及其制備方法。

背景技術(shù)：

馬鈴薯Y病毒組(Potyvirus)屬是植物病毒中最大的一族，以各種植物作為宿主。馬鈴薯病毒(Potato virus)Y(以下稱為PVY)是馬鈴薯Y病毒組(Potyvirus)屬的病毒，通過(guò)蚜蟲而非持續(xù)性地傳播，感染茄科植物的多個(gè)品種。其中，對(duì)于煙草而言，PVY引起作物生長(zhǎng)高度的減少及葉脈的壞疽癥狀等，其結(jié)果是導(dǎo)致煙葉的品質(zhì)及產(chǎn)量降低，對(duì)世界的煙草生產(chǎn)造成很大損害。而且，在使用感染PVY而品質(zhì)降低的煙葉作為原料使用時(shí)，生產(chǎn)的煙草產(chǎn)品的品質(zhì)也大幅降低。

另一方面，煙草叢頂病毒(Tobacco bushy top virus)(以下稱為TBTV)是屬于傘形植物病毒屬(Umbravirus)的病毒，作為非洲和亞洲發(fā)生的煙草叢頂病(tobacco bushy top disease)的致病病毒而周知。該病毒在自然界中通過(guò)蚜蟲持續(xù)性地傳播，對(duì)煙草引起生長(zhǎng)停滯及葉的斑紋癥狀，導(dǎo)致品質(zhì)及產(chǎn)量降低。煙草叢頂病特別是非洲各國(guó)的重要病害。

對(duì)于煙草(Nicotiana tabacum)而言，已知有對(duì)PVY顯示出抗性的現(xiàn)有遺傳資源Virgin A突變體(以下稱為VAM)，并積極地充分用于煙草育種程序中。但是，最近世界上報(bào)告了打破VAM抗性的PVY新毒株的VAM-Breaking毒株(有時(shí)也標(biāo)記為PVY-Breaking毒株或PVY-B)。目前，強(qiáng)烈地需求對(duì)該VAM-Breaking毒株的抗性煙草。最近，報(bào)告了通過(guò)放射線照射而獲得了對(duì)VAM-Breaking毒株的抗性的煙草(非專利文獻(xiàn)1)，但尚未確定其引起抗性的基因。另外，已知例如非洲煙草(Nicotiana africana)等煙草野生種中存在對(duì)PVY-Breaking毒株顯示抗性的物質(zhì)，但尚未到達(dá)充分地用于育種程序的階段。

另外還報(bào)告了以下內(nèi)容，使用43種煙草品種及煙草屬(Nicotiana)野生種實(shí)施了對(duì)煙草叢頂病抗性源的探索，雖然在煙草品種中沒(méi)有顯示出抗性的品種，但數(shù)種野生種未表現(xiàn)出病毒病的癥狀(非專利文獻(xiàn)2)。但是，該抗性的遺傳形式并不明確，在進(jìn)一步從野生種向栽培種煙草(煙草)導(dǎo)入抗性的情況下，可以預(yù)測(cè)到也會(huì)同時(shí)導(dǎo)入對(duì)品質(zhì)及產(chǎn)量造成不良影響的性狀，距離實(shí)用化尚有很長(zhǎng)的路。

約200種已知植物病毒抗性基因的約半數(shù)為隱性遺傳(非專利文獻(xiàn)3)?？梢哉J(rèn)為這些是病毒繁殖及細(xì)胞間轉(zhuǎn)移等所需要的宿主因子。通過(guò)近10年的研究，這些因子的一部分已經(jīng)明確。例如，翻譯起始因子，如eIF4E及eIF4G、DEAD框RNA螺旋酶樣蛋白(非專利文獻(xiàn)4)、富含半胱氨酸的VPg-相互作用蛋白(非專利文獻(xiàn)5)及翻譯延長(zhǎng)因子(非專利文獻(xiàn)6)等被確定為隱性的病毒抗性遺傳因子。當(dāng)然，可以認(rèn)為這并不是全部，另外還有多個(gè)候選因子(非專利文獻(xiàn)3)，例如作為其它候選因子，可以列舉與植物病毒的篩管運(yùn)輸相關(guān)的各種植物因子(非專利文獻(xiàn)7)。

病毒在從自身的基因組合成蛋白質(zhì)時(shí)利用宿主的翻譯起始機(jī)制。2002年報(bào)告了擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的對(duì)蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus)(TuMV)的隱性抗性遺傳因子是作為翻譯起始因子eIF(iso)4E的變異(非專利文獻(xiàn)8)。自此以來(lái)，開(kāi)始了在數(shù)種植物中對(duì)于eIF4E基因家族與對(duì)已知的馬鈴薯Y病毒組屬病毒的隱性抗性的相關(guān)性進(jìn)行了研究。由此可知，實(shí)際上通過(guò)eIF4E或eIF(iso)4E的變異而獲得了隱性的病毒抗性。

例如，在專利文獻(xiàn)1中記載了一種利用eIF4E基因(不包含eIF(iso)4E)的功能抑制而賦予病毒抗性的方法。另外，在專利文獻(xiàn)2中記載了一種通過(guò)eIF4E基因或eIF(iso)4E基因的剪接變異而具有病毒不發(fā)揮作用的eIF4E或eIF(iso)4E的突變體。變異是在eIF4E或eIF(iso)4E的非編碼區(qū)域或剪接元件(外顯子/內(nèi)含子邊界部位的±10堿基的區(qū)域)的至少1個(gè)堿基發(fā)生了插入、缺失或取代，優(yōu)選內(nèi)含子為對(duì)象，更優(yōu)選第1內(nèi)含子為對(duì)象。另外，專利文獻(xiàn)3中記載了與利用eIF4E及eIF(iso)4E兩者中變異組合的對(duì)辣椒葉脈斑駁病(Pepper veinal mottle virus、PVMV)抗性植物的篩選相關(guān)的方法，具體而言，記載了篩選使eIF4E及eIF(iso)4E完全不表達(dá)且表達(dá)變異eIF4E的植物的方法。

另外，例如報(bào)告了胡椒的引起對(duì)PVY的隱性抗性的基因?yàn)閑IF4E(非專利文獻(xiàn)9)。另外，報(bào)告了三葉草黃葉脈病毒(Clover yellow vein virus)在eIF(iso)4E缺失擬南芥中繁殖，但在eIF4E缺失擬南芥中不繁殖，并且與此相反，TuMV在eIF4E缺失擬南芥中繁殖，但在eIF(iso)4E缺失擬南芥中不繁殖(非專利文獻(xiàn)10)。另外，為了獲得對(duì)PVMV的抗性，必須使eIF4E及eIF(iso)4E兩者同時(shí)喪失功能(非專利文獻(xiàn)11)。作為對(duì)近年的翻譯起始因子及植物病毒抗性的綜述，有例如非專利文獻(xiàn)12及非專利文獻(xiàn)13等。

還指出了馬鈴薯Y病毒組屬病毒以外的有限數(shù)目的病毒與翻譯起始因子的相關(guān)性。例如，黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus)(CMV)是黃瓜花葉病毒組(Cucumovirus)屬病毒，在eIF4E或eIF4G被破壞的擬南芥中，與CMV的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移有關(guān)的3a蛋白的生產(chǎn)受到阻礙。另外，水稻黃斑點(diǎn)病毒(Rice yellow mottle virus)(RYMV)是南方菜豆花葉病毒組(Sobemovirus)屬病毒，eIF(iso)4G突變的稻變得對(duì)該病毒具有抗性(非專利文獻(xiàn)14及非專利文獻(xiàn)15)。

對(duì)于與煙草相同為茄科植物的番茄而言，基于番茄突變體實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合的整體分析，研究了馬鈴薯Y病毒組抗性與翻譯起始因子eIF4E的關(guān)系。其中報(bào)告了，eIF4E基因家族之一的eIF4E1的功能抑制賦予對(duì)PVY及胡椒斑點(diǎn)病毒(Pepper mottle virus)(PepMoV)的抗性，而另一方面不賦予對(duì)煙草蝕刻病毒(Tobacco etch virus)(TEV)的抗性(非專利文獻(xiàn)16)。另外，eIF4E2、eIF(iso)4E、eIF4G及eIF(iso)4G的功能抑制同時(shí)表現(xiàn)出不賦予對(duì)這些馬鈴薯Y病毒組屬病毒的抗性的情況。另外，如果使用RNAi(RNA干擾)對(duì)eIF4E1和eIF4E2同時(shí)進(jìn)行功能抑制，則顯示出對(duì)包含PVY、PepMoV及TEV的7種馬鈴薯Y病毒組屬病毒的抗性。但是另一方面，有趣的是eIF(iso)4E的RNAi表現(xiàn)出對(duì)這些病毒均沒(méi)有抗性(非專利文獻(xiàn)17)。另外，還表現(xiàn)出番茄的eIF(iso)4E與馬鈴薯Y病毒組屬以外的病毒抗性沒(méi)有相關(guān)性(非專利文獻(xiàn)17)。

由此，目前為止在任意植物中被指出與PVY抗性相關(guān)性的均為eIF4E，與eIF(iso)4E的相關(guān)性尚未報(bào)告。eIF(iso)4E雖然被分類為eIF4E家族，但在植物中，通常eIF4E與eIF(iso)4E的DNA序列同源性不滿足60％。而且，eIF(iso)4E形成與eIF4E不同的翻譯復(fù)合體。具體而言，eIF(iso)4E與eIF(iso)4G一起形成被稱為eIF(iso)4F的翻譯復(fù)合體，eIF4E與eIF4G一起形成被稱為eIF4F的翻譯復(fù)合體。

有在煙草(Nicotiana tabacum)中使eIF4E1或eIF(iso)4E的表達(dá)量降低的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)18)。在該報(bào)告中記載了使用反義技術(shù)抑制了煙草的eIF4E1或eIF(iso)4E的轉(zhuǎn)錄。并且，雖然記載了制備了eIF4E1轉(zhuǎn)錄物的量被抑制為對(duì)照的30～40％的煙草和eIF(iso)4E轉(zhuǎn)錄物的量被抑制為對(duì)照的60％的煙草，以及在兩者交配而得到的后代中eIF4E1轉(zhuǎn)錄物的量降低至對(duì)照的26％、eIF(iso)4E轉(zhuǎn)錄物的量降低至對(duì)照的31％，但完全沒(méi)有記載與病毒抗性的相關(guān)性。另外，雖然根據(jù)使用了本生煙草(Nicotiana benthamiana)的檢測(cè)體系暗示了PVY的HC-Pro蛋白質(zhì)與煙草的eIF(iso)4E發(fā)生相互作用的可能性(非專利文獻(xiàn)19)，但并未指出與抗性的相關(guān)性。

另外，對(duì)于煙草而言，根據(jù)PVY抗性的VAM煙草及PVY敏感性的煙草的轉(zhuǎn)錄物的整體分析，發(fā)現(xiàn)了在VAM煙草中特異性地在轉(zhuǎn)錄量低的基因中存在eIF4E，該基因發(fā)生變異的煙草表現(xiàn)出PVY抗性(非專利文獻(xiàn)20)。

但是另一方面，也有煙草的馬鈴薯Y病毒組抗性與翻譯起始因子的eIF4E及eIF(iso)4E的變異不相關(guān)的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)21)。在該報(bào)告中，關(guān)于作為感染煙草的馬鈴薯Y病毒組屬病毒的PVY及PepMoV，研究了在對(duì)這些病毒的抗性品種及敏感性品種中eIF4E及eIF(iso)4E基因的堿基序列。其結(jié)果表明，未觀察到兩基因發(fā)生的變異與對(duì)這些病毒的抗性/敏感性的相關(guān)性。例如，某PVY抗性品種的eIF4E及eIF(iso)4E基因中未檢測(cè)出變異，而另一方面在PVY敏感性品種的eIF4E及eIF(iso)4E基因中發(fā)現(xiàn)了變異。至此為止，對(duì)于其它植物而言，在相同的實(shí)驗(yàn)中在PVY抗性品種的eIF4E及eIF(iso)4E基因中檢測(cè)出變異，可以認(rèn)為該變異是抗性的原因，由此在非專利文獻(xiàn)21中給出了以下結(jié)論，對(duì)于煙草而言，與其它茄科植物不同，PVY抗性與翻譯起始因子eIF4E及eIF(iso)4E沒(méi)有相關(guān)性。如上所述，關(guān)于煙草，與其它植物不同，馬鈴薯Y病毒組抗性與翻譯起始因子的相關(guān)性仍然處于混沌不清的情況。

另外，在包括煙草的所有植物品種中，翻譯起始因子與對(duì)傘形植物病毒屬病毒的抗性的相關(guān)性完全未知。

煙草(Nicotiana tabacum)是雙二倍體，與通常的二倍體植物相比，基因數(shù)量多，源自林煙草(Nicotiana sylvestris)的基因和源自絨毛狀煙草(Nicotiana tomentosiformis)的基因基本上通常各存在1對(duì)。即，在煙草中至少存在2組同源基因。因此，與其它的二倍體植物相比，遺傳形式復(fù)雜?？梢哉J(rèn)為，在擬南芥中，存在3種eIF4E，且存在1種eIF(iso)4E(非專利文獻(xiàn)12)，在煙草中，擬南芥中可觀察到的翻譯起始因子均成對(duì)存在。可知，如果包含與eIF4E在功能上類似的cap結(jié)合蛋白時(shí)，則煙草的eIF4E家族至少存在12個(gè)(非專利文獻(xiàn)20)。進(jìn)而，如果包含eIF4G及eIF(iso)4G，則其數(shù)量更多。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：美國(guó)專利第7772462號(hào)說(shuō)明書

專利文獻(xiàn)2：美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2013/117879號(hào)說(shuō)明書

專利文獻(xiàn)3：國(guó)際公開(kāi)第2005/118850號(hào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Pulcinelli et al.(2009)Reporting a source of PVYntn resistance in Nicotiana tabacum L.CORESTA Joint Study Groups Meeting,Rovinj,Croatia.

非專利文獻(xiàn)2：De Bruin.(1990)Sources of resistance in the genus Nicotiana to the virus causing bushy top disease in tobacco.Phytophylactica.22:263-264.

非專利文獻(xiàn)3：Truniger V,Aranda MA.(2009)Recessive resistance to plant viruses.Adv Virus Res.75:119-159.

非專利文獻(xiàn)4：Huang et al.(2010)A host RNA helicase-like protein,AtRH8,interacts with the potyviral genome-linked protein,VPg,associates with the virus accumulation complex,and is essential for infection.Plant Physiol.152:255-266.

非專利文獻(xiàn)5：Dunoyer et al.(2004)A Cysteine-Rich Plant Protein Potentiates Potyvirus Movement through an Interaction with the Virus Genome-Linked Protein VPg.J.Virol.78:2301-2309.

非專利文獻(xiàn)6：Hwang et al.(2013)Translation elongation factor 1B(eEF1B)is an essential host factor for Tobacco mosaic virus infection in plants.Virology439:105-114.

非專利文獻(xiàn)7：Hipper et al.(2013)Viral and cellular factors involved in Phloem transport of plant viruses.Front Plant Sci.4:article154.

非專利文獻(xiàn)8：Lellis et al.(2002)Loss-of-susceptibility mutants of Arabidopsis thaliana reveal an essential role for eIF(iso)4E during potyvirus infection.Curr Biol.12:1046-1051.

非專利文獻(xiàn)9：Ruffel et al.(2002)A natural recessive resistance gene against potato virus Y in pepper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E).Plant J.32,1067-1075.

非專利文獻(xiàn)10：Sato et al.(2005)Selective involvement of members of theeukaryotic initiation factor 4E family in the infection of Arabidopsis thalianaby potyviruses.FEBS Lett.579:1167-1171.

非專利文獻(xiàn)11：Ruffel et al.(2006)Simultaneous mutations in translationinitiation factors eIF4E and eIF(iso)4E are required to prevent pepper veinal mottle virus infection of pepper.J Gen Virol.87,2089-2098.

非專利文獻(xiàn)12：Robaglia and Caranta.(2006)Trends in Plant Science 11:40-45.

非專利文獻(xiàn)13：Fritsche-Neto and Borem.(2012)Plant breeding for biotic stress resistance.Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

非專利文獻(xiàn)14：Yoshii et al.(2004)The Arabidopsis Cucumovirus Multiplication 1and 2Loci Encode Translation Initiation Factors 4E and 4G.J Virol.78:6102-6111.

非專利文獻(xiàn)15：Albar et al.(2006)Mutations in the eIF(iso)4G translation initiation factor confer high resistance of rice to Rice yellow mottle virus.Plant J.47:417-426.

非專利文獻(xiàn)16：Piron et al.(2010)PLOS ONE 5:e11313.

非專利文獻(xiàn)17：Mazier et al.(2011)PLOS ONE 6:e29595.

非專利文獻(xiàn)18：Combe et al.(2005)Translation initiation factors eIF4E and eIFiso4E are required for polysome formation and regulate plant growth in tobacco.Plant Molecular Biology 57:749-760.

非專利文獻(xiàn)19：Ala-Poikela et al.(2011)Helper Component Proteinase of the Genus Potyvirus Is an Interaction Partner of Translation Initiation Factors eIF(iso)4E and eIF4E and Contains a 4E Binding Motif.J Virol.85:6784-6794.

非專利文獻(xiàn)20：Julio et al.(2013)Characterisation of PVY(Potato Virus Y)resistance in tobacco:potential role of an eIF4E gene identified by high throughput sequencing technologies.CORESTA Meeting Agro-Phyto Groups abstr.AP 29.

非專利文獻(xiàn)21：Jung and Yeam.(2013)Exploring Natural Variations in eIF4E and Screening for Potyviral Resistance in Diverse Nicotiana Species.Hort.Environ.Biotechnol.54:430-440.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

雖然已知對(duì)PVY-Breaking毒株具有抗性的煙草，但如上所述，僅有一例，其抗性的持續(xù)性也尚不明確。因此，為了避免潛在的基因易損性(genetic vulnerability)，當(dāng)務(wù)之急是開(kāi)發(fā)其它新型對(duì)包含PVY-Breaking毒株的病毒的抗性煙草。另外，抗性的基因尚未確定是精密的標(biāo)記育種的阻礙。

另外，關(guān)于TBTV，雖然以栽培品種為中心進(jìn)行了抗性品種的探索，但未發(fā)現(xiàn)顯示出對(duì)該病毒抗性的品種，其后也未進(jìn)行抗性品種的開(kāi)發(fā)。

本發(fā)明是鑒于上述課題而完成的，其主要目的在于提供一種對(duì)病毒具有抗性的煙草及其制備方法。

解決課題的方法

本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式的特征在于，在翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中具有變異，由此，生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)、或者抑制了翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)。

本發(fā)明的病毒抗性煙草的另一個(gè)方式的特征在于，翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)量與野生型相比為20％以下。

本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式的特征在于，通過(guò)將變異導(dǎo)入翻譯起始因子eIF(iso)4E基因來(lái)制備對(duì)病毒具有抗性的煙草，所述變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。

本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的另一個(gè)方式的特征在于，通過(guò)導(dǎo)入因子來(lái)制備對(duì)病毒具有抗性的煙草，所述因子使翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)量抑制至與野生型相比為20％以下。

本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式的特征在于，其是用于檢測(cè)煙草的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中的變異的多核苷酸，該變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。

本發(fā)明的煙草對(duì)病毒抗性的判定用DNA標(biāo)記物的一個(gè)方式的特征在于，其包含由翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中含有變異的連續(xù)堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成的多核苷酸，該變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或是抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，可以提供對(duì)病毒具有抗性的煙草。

附圖說(shuō)明

圖1是示出本發(fā)明的實(shí)施例中利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行的eIF(iso)4E的基因表達(dá)分析的結(jié)果(將作為非重組體的WT的值設(shè)為1的相對(duì)值)的圖。各柱狀圖上的直線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

圖2是示出煙草(Nicotiana tabacum)的S型(源自林煙草)eIF(iso)4E的基因結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖3是示出煙草(Nicotiana tabacum)的T型(源自絨毛狀煙草)eIF(iso)4E的基因結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖4是示出本發(fā)明的實(shí)施例中利用ASP標(biāo)記物進(jìn)行的突變體檢測(cè)的結(jié)果的圖。

圖5是示出本發(fā)明的實(shí)施例中利用dCAPS標(biāo)記物進(jìn)行的突變體檢測(cè)的結(jié)果的圖。

圖6是示出本發(fā)明的實(shí)施例中利用定量PCR進(jìn)行的eIF(iso)4E的基因表達(dá)分析的結(jié)果(將SSTT系的轉(zhuǎn)錄物的量的平均值設(shè)為1時(shí)的相對(duì)表達(dá)量)的圖。各柱狀圖上的直線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

具體實(shí)施方式

〔1.病毒抗性煙草及其制備方法〕

本發(fā)明的一個(gè)方式涉及對(duì)病毒具有抗性的煙草(病毒抗性煙草)，更具體而言，涉及在細(xì)胞內(nèi)對(duì)病毒有功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)量(例如，轉(zhuǎn)錄物的量)減少的病毒抗性煙草。另外，本發(fā)明的另一個(gè)方式涉及制備對(duì)病毒具有抗性的煙草的方法(病毒抗性煙草制備方法)，更具體而言，涉及通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)對(duì)病毒有功能的eIF(iso)4E基因的表達(dá)量(例如，轉(zhuǎn)錄物的量)減少來(lái)制備病毒抗性煙草的方法。

煙草為雙二倍體，具有源自作為原種的林煙草的基因組(S型基因組)及源自絨毛狀煙草的基因組(T型基因組)兩者。因此，煙草具有堿基序列不同的2組eIF(iso)4E基因(等位基因)。另外，煙草的S型及T型的eIF(iso)4E基因均分別示于圖2及3，具有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。需要說(shuō)明的是，在圖2及圖3中，下部記載的數(shù)字表示無(wú)義變異的候選部位的數(shù)量，箭頭表示實(shí)施例中的引物的位置。將S型的野生型eIF(iso)4E基因的cDNA序列的一個(gè)例子示于序列號(hào)1(GenBank收錄號(hào)：AY699609)。在序列號(hào)1中，可讀框?yàn)榈?0號(hào)～第672號(hào)的堿基。將T型的野生型eIF(iso)4E基因的cDNA序列的一個(gè)例子示于序列號(hào)2(GenBank收錄號(hào)：EB683576)。在序列號(hào)2中，可讀框?yàn)榈?7號(hào)～第624號(hào)的堿基。另外，將S型的野生型eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一個(gè)例子示于序列號(hào)3。將T型的野生型eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一個(gè)例子示于序列號(hào)4。另外，將S型的野生型eIF(iso)4E基因的mRNA序列(將cDNA序列中的t變更為u后的序列)的一個(gè)例子示于序列號(hào)5。將T型的野生型eIF(iso)4E基因的mRNA序列(將cDNA序列中的t變更為u后的序列)的一個(gè)例子示于序列號(hào)6。另外，將S型的野生型eIF(iso)4E基因的基因組的堿基序列的一個(gè)例子示于序列號(hào)7。將T型的野生型eIF(iso)4E基因的基因組的堿基序列的一個(gè)例子示于序列號(hào)8。在序列號(hào)7中，外顯子為第132號(hào)～第397號(hào)的堿基(第1外顯子)、第1730號(hào)～第1898號(hào)的堿基(第2外顯子)、第2029號(hào)～第2154號(hào)的堿基(第3外顯子)、第4723號(hào)～第4785號(hào)的堿基(第4外顯子)及第4893號(hào)～第5096號(hào)的堿基(第5外顯子)。在序列號(hào)8中，外顯子為第164號(hào)～第382號(hào)的堿基(第1外顯子)、第1620號(hào)～第1788號(hào)的堿基(第2外顯子)、第1919號(hào)～第2044號(hào)的堿基(第3外顯子)、第3205號(hào)～第3267號(hào)的堿基(第4外顯子)及第3373號(hào)～第3593號(hào)的堿基(第5外顯子)。

具有相同功能的植物基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的堿基序列根據(jù)基因可以在栽培品種之間有1％～數(shù)％左右的差異，可以在栽培品種與親緣野生種之間有數(shù)％～10％左右的差異。在本說(shuō)明書中，發(fā)生變異前的野生型eIF(iso)4E基因中包含生成由序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的基因、以及編碼由序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的基因。另外，在本說(shuō)明書中，發(fā)生變異前的野生型eIF(iso)4E基因中包含下述基因，所述基因生成與序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上、優(yōu)選95％以上、更優(yōu)選97％以上、進(jìn)一步優(yōu)選99％以上的序列同源性的mRNA，且編碼功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。另外，在本說(shuō)明書中，野生型eIF(iso)4E基因中包含下述基因，所述基因編碼與序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上、優(yōu)選95％以上、更優(yōu)選97％以上、進(jìn)一步優(yōu)選99％以上的序列同源性的功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。另外，在本說(shuō)明書中，野生型eIF(iso)4E基因包含下述基因，所述基因生成具有在序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列中取代、缺失、插入和/或添加了1～50個(gè)、1～40個(gè)、1～30個(gè)、1～20個(gè)、1～15個(gè)、1～12個(gè)、1～10個(gè)、1～8個(gè)、1～5個(gè)、1～3個(gè)、1～2個(gè)或1個(gè)堿基后的堿基序列的mRNA，且編碼功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。另外，在本說(shuō)明書中，野生型eIF(iso)4E基因包含下述基因，所述基因編碼具有在序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1～20個(gè)、1～15個(gè)、1～12個(gè)、1～10個(gè)、1～8個(gè)、1～5個(gè)、1～4個(gè)、1～3個(gè)、1～2個(gè)或1個(gè)氨基酸后的氨基酸序列的功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，只要沒(méi)有特別說(shuō)明，表示數(shù)值范圍的“A～B”表示“A以上、B以下”的意思。

例如，在本說(shuō)明書中，發(fā)生變異前的野生型的T型eIF(iso)4E基因中包含cDNA序列為GenBank收錄號(hào)FN666434的序列的基因的。該序列是來(lái)自于源自煙草品種Samsun NN的T型eIF(iso)4E基因的序列，與源自煙草品種K326的T型eIF(iso)4E的cDNA序列EB683576(序列號(hào)2)的序列同源性為97％。這2個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性(identity)為97％、相似性(similarity)為99％。

需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，“堿基序列的同源性”是指在多個(gè)堿基序列中完全相同的堿基的排列以多大程度的比率存在?！鞍被嵝蛄械耐葱浴笔侵冈诙鄠€(gè)氨基酸序列中完全相同的氨基酸的排列以多大程度的比率存在?！鞍被嵝蛄械南嗨菩浴笔侵冈诙鄠€(gè)氨基酸序列中完全相同的氨基酸或性質(zhì)相似的氨基酸的排列以多大程度的比率存在。性質(zhì)相似的氨基酸的例子可以列舉例如：具有帶正電荷的殘基的賴氨酸、精氨酸及組氨酸；具有帶負(fù)電荷的殘基的天冬氨酸及谷氨酸；具有非極性即疏水性的殘基的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及脯氨酸；有極性但無(wú)電荷的甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。關(guān)于“堿基序列的同源性”、“氨基酸序列的同源性”或“氨基酸序列的相似性”，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的序列分析(相同性檢索)程序BLAST(文獻(xiàn)：Altschul et al.(1990)Basic local alignment search tool.J Mol Biol.215:403-410.)等或市售的核酸/氨基酸分析軟件來(lái)進(jìn)行計(jì)算。BLAST檢索可以在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)或日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DNA Data Bank of Japan)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html)等網(wǎng)站進(jìn)行。此時(shí)，可以更改各種檢索參數(shù)，但通常使用默認(rèn)值。

需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，“煙草”不僅指煙草，也包括相同煙草屬的其它種。作為煙草屬的其它種，可以列舉例如：N.paniculata、N.knightiana、N.solanifolia、N.benavidesii、N.cordifolia、N.raimondii、N.cutleri、N.rustica、N.tomentosa、絨毛狀煙草、N.otophora、N.kawakamii、N.setchellii、N.undulata、N.arentsii、N.wigandioides、N.glutinosa、N.thyrsiflora、N.obtusifolia、N.palmeri、N.langsdorffii、N.alata、N.forgetiana、N.bonariensis、N.longiflora、N.plumbaginifolia、N.azambujae、N.mutabilis、林煙草、N.repanda、N.stocktonii、N.nesophila、N.nudicaulis、N.noctiflora、N.petunioides、N.acaulis、N.ameghinoi、N.glauca、N.paa、N.acuminata、N.pauciflora、N.attenuata、N.longibracteata、N.miersii、N.corymbosa、N.linearis、N.spegazzinii、N.quadrivalvis、N.clevelandii、N.benthamiana、N.umbratica、N.cavicola、N.debneyi、N.gossei、N.amplexicaulis、N.maritima、N.velutina、N.hesperis、N.occidentalis、N.simulans、N.megalosiphon、N.rotundifolia、N.excelsior、N.suaveolens、N.ingulba、N.exigua、N.goodspeedii、N.rosulata、N.fragrans、N.africana、N.burbidgeae、N.heterantha、N.stenocarpa、N.Truncata及N.wuttkei。另外，“煙草”可以包含煙草的植物整體、植物組織(例如，葉、莖、花、根、生殖器官、胚及它們的一部分等)、苗及種子、以及干燥的葉、莖、花、根及種子等。

可以認(rèn)為這些煙草屬植物的eIF(iso)4E基因的cDNA序列與序列號(hào)1所示的堿基序列具有90％以上的序列同源性。實(shí)際上，序列號(hào)1所示的堿基序列與林煙草的eIF(iso)4E基因的cDNA序列顯示出100％的序列同源性(內(nèi)含子除外)。序列號(hào)2所示的堿基序列與絨毛狀煙草的eIF(iso)4E的cDNA序列顯示出99％的序列同源性(內(nèi)含子除外)。序列號(hào)1所示的堿基序列及序列號(hào)2所示的堿基序列分別與N.Otophora的eIF(iso)4E的cDNA序列顯示出98％和99％的序列同源性(內(nèi)含子除外)。另外，林煙草、絨毛狀煙草及N.Otophora的eIF(iso)4E基因的結(jié)構(gòu)均具有與煙草的基因相同數(shù)量的外顯子(5個(gè))、相同數(shù)量的內(nèi)含子(4個(gè))。

上述野生種eIF(iso)4E基因的堿基序列可以使用序列號(hào)1所示的堿基序列，利用BLAST程序等對(duì)GenBank中收錄的林煙草、絨毛狀煙草或N.Otophora的基因組(全基因組鳥槍法重疊群(Whole genome shotgun contigs))進(jìn)行相同性檢索而得到?；蛘撸醋詿煵輰僦参锏闹参锓N的eIF(iso)4E基因的堿基序列可以使用例如序列號(hào)25～36所示的引物序列，利用PCR法從該植物種的基因組DNA擴(kuò)增eIF(iso)4E基因并確定堿基序列來(lái)得到。作為相同性檢索，可以使用BLAST程序，也可以使用市售的核酸/氨基酸序列分析軟件。

另外，使用序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的堿基序列作為探針，根據(jù)煙草野生種的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)在嚴(yán)格條件進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，由此能夠獲得煙草野生種的eIF(iso)4E基因的堿基序列。

病毒抗性煙草顯示出抗性的病毒沒(méi)有特別限定，可以列舉例如：感染煙草的苜?；ㄈ~病毒(Alfamovirus)屬病毒(例如苜?；ㄈ~病毒)、植物昆蟲病毒(Curtovirus)屬病毒(例如昆蟲曲頂病毒(Beet curly top virus))、菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)屬病毒(例如煙草曲葉病毒(Tobacco leaf curl virus))、黃瓜花葉病毒組(Cucumovirus)屬病毒(例如黃瓜花葉病毒和花生矮化病毒)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組(Ilarvirus)屬病毒(例如煙草條紋病毒(Tobacco streak virus))、馬鈴薯Y病毒組屬病毒(例如馬鈴薯病毒Y(PVY)、煙草蝕紋病毒、煙草葉脈斑點(diǎn)病毒(Tobacco vein mottling virus)及煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus))、煙草花葉病毒組(Tobamovirus)屬病毒(例如煙草花葉病毒)、煙草脆裂病毒組(Tobravirus)屬病毒(例如煙草脆裂病毒)、壞死病毒(Necrovirus)屬病毒(例如煙草壞死病毒(Tobacco necrosis virus))、巨脈病毒屬(Varicosavirus)屬病毒(例如Tobacco stunt virus)、Nepovirus屬病毒(例如Tobacco ringspot virus)、傘形植物病毒屬屬病毒(例如煙草叢頂病毒和煙草矮化病毒(Tobacco mottle virus))、馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)屬病毒(例如煙草脈曲黃病毒(Tobacco vein distorting virus))、玉米線條病毒屬(Mastrevirus)屬病毒(例如煙草黃矮病毒(Tobacco yellow dwarf virus))、以及蕃茄斑萎病毒屬(Tospovirus)屬病毒(例如蕃茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus))等病毒。本發(fā)明的病毒抗性煙草可以對(duì)1種病毒具有抗性，也可以對(duì)多種病毒具有抗性。本發(fā)明的病毒抗性煙草可以對(duì)馬鈴薯Y病毒組屬病毒具有明顯的抗性，其中，能夠具有對(duì)馬鈴薯病毒Y(PVY)的PVY-O毒株、PVY-C毒株、PVY-Z毒株、PVY-N(包含NTN和NW)毒株、特別是對(duì)打破煙草的Virgin A突變體的病毒抗性的PVY毒株(VAM-Breaking毒株)的抗性。另外，本發(fā)明的病毒抗性煙草可以對(duì)傘形植物病毒屬屬病毒具有明顯的抗性，其中，能夠具有對(duì)煙草叢頂病毒(TBTV)的抗性。

在本說(shuō)明書中，“病毒抗性”是指與易感性煙草品種相比，由于病毒感染而發(fā)生于煙草上的癥狀延遲或不發(fā)生的情況。作為發(fā)生于煙草上的癥狀，可以列舉：生長(zhǎng)停滯、葉脈壞疽、莖壞疽、明脈及斑紋等。或者，“病毒抗性”是指與易感性煙草品種相比，病毒的繁殖受到抑制或病毒的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移受到抑制的情況。

(病毒抗性煙草及其制備方法的方式1)

本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式是病毒抗性煙草，其在eIF(iso)4E基因具有變異，由此，生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)，或者抑制了翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)。

在本說(shuō)明書中，“變異”是指DNA中的點(diǎn)變異、缺失、插入、重復(fù)、易位及倒位，在沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下是指相對(duì)于野生型的堿基序列的差異。

另外，在本說(shuō)明書中，“eIF(iso)4E基因”是指在基因組中，不僅包括編碼eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，還包括內(nèi)含子、調(diào)節(jié)區(qū)域及其他非翻譯序列等eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的表達(dá)所需要的非編碼區(qū)域的概念。

“對(duì)病毒無(wú)功能的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)”是指病毒自身繁殖或細(xì)胞間轉(zhuǎn)移時(shí)無(wú)法利用(利用至少受到部分阻礙)的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)，包括在煙草中不發(fā)揮正常的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的功能(作為翻譯起始因子的功能)的情況、以及在煙草中雖然發(fā)揮正常的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的功能但病毒無(wú)法利用的情況兩者。需要說(shuō)明的是，如下面敘述的實(shí)施例所示，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在煙草中野生型(未導(dǎo)入變異的植物)的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)用于病毒的自身繁殖或細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的可能性。

“eIF(iso)4E基因的表達(dá)量”可以是eIF(iso)4E轉(zhuǎn)錄為mRNA的量(轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄物的量)和翻譯為eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的量(翻譯水平或翻譯產(chǎn)物的量)中的任一者，也可以是兩者。因此，“eIF(iso)4E的表達(dá)受到抑制”包括與野生型相比轉(zhuǎn)錄受到抑制的情況、與野生型相比翻譯受到抑制的情況、與野生型相比轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者受到抑制的情況。需要說(shuō)明的是，“轉(zhuǎn)錄受到抑制”包括轉(zhuǎn)錄物被分解的情況。

如上所述，可以認(rèn)為煙草具有S型和T型2組、總計(jì)4個(gè)(S型2個(gè)、T型2個(gè))eIF(iso)4E基因。在一個(gè)例子中，病毒抗性煙草優(yōu)選至少在S型的eIF(iso)4E基因中具有變異。在該情況下，病毒抗性煙草至少可以具有對(duì)傘形植物病毒屬屬病毒(例如，TBTV)的抗性。在另外一例中，病毒抗性煙草優(yōu)選至少在T型的eIF(iso)4E基因中具有變異。在該情況下，病毒抗性煙草至少可以具有對(duì)馬鈴薯Y病毒組屬的病毒(例如，PVY-B毒株)的抗性。另外，在另一例中，病毒抗性煙草更優(yōu)選在S型和T型兩者的eIF(iso)4E基因中具有變異。在該情況下，病毒抗性煙草至少具有對(duì)傘形植物病毒屬屬病毒和馬鈴薯Y病毒組屬病毒兩者的抗性。另外，1個(gè)類型的變異可以是純合(例如，在S型的2個(gè)eIF(iso)4E基因兩者中導(dǎo)入了變異)，也可以是雜合，優(yōu)選為純合。

因此，病毒抗性煙草的一個(gè)例子在野生型eIF(iso)4E基因中具有1個(gè)以上變異，具有對(duì)傘形植物病毒屬屬病毒的抗性，所述野生型eIF(iso)4E基因是(a)編碼由序列號(hào)3所示的氨基酸序列構(gòu)成的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型eIF(iso)4E基因、(b)編碼與序列號(hào)3所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型eIF(iso)4E基因、(c)生成由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型eIF(iso)4E基因、或者(d)生成與序列號(hào)5所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型eIF(iso)4E基因，而且編碼功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。另外，病毒抗性煙草的另外一例在野生型eIF(iso)4E基因中具有1個(gè)以上變異，具有對(duì)馬鈴薯Y病毒組屬病毒的抗性，所述野生型eIF(iso)4E基因是(a)編碼由序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型eIF(iso)4E基因、(b)編碼與序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型eIF(iso)4E基因、(c)生成由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型eIF(iso)4E基因、或者(d)生成與序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型eIF(iso)4E基因，而且編碼功能性eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

另外，1個(gè)eIF(iso)4E基因可以有多個(gè)變異。另外，多個(gè)eIF(iso)4E基因中的變異可以相同，也可以相互不同。

需要說(shuō)明的是，在2組中的1組喪失了原本功能(因自然變異)的情況下，只要在未喪失功能的1組中具有變異即可。另外，在2組中的1組完全喪失功能但剩余1組中一個(gè)喪失功能、一個(gè)未喪失功能的情況下，即，在4個(gè)中的3個(gè)喪失了功能的情況下，只要eIF(iso)4E的表達(dá)量足夠低，就可得到病毒抗性。另外，在煙草野生種(煙草屬)的情況下，在原本僅具有1組eIF(iso)4E的情況下，只要在1組eIF(iso)4E中發(fā)生變異即可。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草在編碼區(qū)域具有變異的情況下，eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的氨基酸序列中存在變異。作為變異，可以列舉：取代、缺失及插入等。在變異為氨基酸的取代的情況下，取代的氨基酸及取代后的氨基酸只要是使eIF(iso)4E蛋白質(zhì)為對(duì)病毒無(wú)功能的蛋白質(zhì)即可，沒(méi)有特別限定，例如，優(yōu)選為非保守取代(non-conservative substitutions)。作為非保守取代，可以列舉：將氨基酸取代為電荷或疏水性不同的其它氨基酸(從堿性氨基酸取代為酸性氨基酸或從極性氨基酸取代為非極性氨基酸等)、以及將某氨基酸取代為支鏈大小不同的其它氨基酸。另外，在編碼區(qū)域具有變異的情況下，可以是移碼變異或無(wú)義變異。在無(wú)義變異(變成終止密碼子的變異)的情況下，發(fā)生無(wú)義介導(dǎo)的mRNA衰變(文獻(xiàn)：Brogna and Wen 2009,Nat.Structural Mol.Biol.16:107-113)，有時(shí)轉(zhuǎn)錄物被分解。在該情況下，無(wú)義變異的位置優(yōu)選位于第1外顯子、第2外顯子和/或第3外顯子，更優(yōu)選位于第1外顯子和/或第2外顯子。在移碼變異或無(wú)義變異的情況下，對(duì)于該變異的位置而言，與基因的5’末端側(cè)的一半左右相比，優(yōu)選為5’末端側(cè)。具體而言，優(yōu)選在第1外顯子、第2外顯子和/或第3外顯子存在變異。越接近5’末端，蛋白質(zhì)中的正常部分越短，因此對(duì)病毒無(wú)功能的可能性增高。在煙草所具有的全部(例如煙草中全部4個(gè))eIF(iso)4E基因的編碼區(qū)域存在變異的情況下，完全不能生成對(duì)病毒有功能的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草在非編碼區(qū)域具有變異的情況下，雖然對(duì)編碼的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的氨基酸序列不造成影響，但可以使DNA或mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變、使用于轉(zhuǎn)錄或翻譯機(jī)制的結(jié)合部位改變、或者使tRNA結(jié)合效率降低。由此，可以使轉(zhuǎn)錄水平降低、使翻譯水平降低。

或者，在5’末端側(cè)的非編碼區(qū)域具有變異的情況下，因該變異而在與正確的可讀框不同的可讀框中產(chǎn)生ATG(起始密碼子)時(shí)，有可能從該錯(cuò)誤的可讀框開(kāi)始翻譯。即使在這樣的情況下也不能生產(chǎn)正常的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。例如，在變異原為下面敘述的甲磺酸乙酯(EMS)的情況下，GTG的G變異為A時(shí)或ACG的C變異為T時(shí)，產(chǎn)生新的ATG。在該情況下可讀框錯(cuò)位時(shí)，無(wú)法翻譯正確的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

在eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制的情況下，eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物的量與野生型相比優(yōu)選為20％以下，更優(yōu)選為15％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10％以下。另外，在eIF(iso)4E基因的翻譯受到抑制的情況下，eIF(iso)4E基因的翻譯產(chǎn)物的量與野生型相比優(yōu)選為20％以下，更優(yōu)選為15％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為10％以下。

另外，由于eIF(iso)4E基因的變異，RNA的剪接也可能無(wú)法正常地進(jìn)行。例如，在內(nèi)含子的5’末端側(cè)的包含GT的前后10堿基、優(yōu)選為5堿基、更優(yōu)選為1堿基發(fā)生變異的情況下、或者在內(nèi)含子的3’末端側(cè)的包含AG的前后10堿基、優(yōu)選為5堿基、更優(yōu)選為1堿基發(fā)生變異的情況下，無(wú)法良好地進(jìn)行內(nèi)含子的切除，產(chǎn)生異常的mRNA，可以生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)、或者抑制eIF(iso)4E基因的翻譯。

使eIF(iso)4E基因產(chǎn)生變異的方法沒(méi)有特別限定，可以使用公知的方法。

作為變異原，可以使用例如：甲磺酸乙酯(EMS)、疊氮化納、溴化乙啶及亞硝酸等化學(xué)試劑，但使煙草的基因組DNA發(fā)生變異的化學(xué)試劑并不限定于此。另外，作為變異原，可以列舉例如：γ射線、重離子束、X射線、中子射線或UV等，但使煙草的基因組DNA發(fā)生變異的放射線等并不限定于此。作為變異原，優(yōu)選EMS。

作為變異原處理的煙草的組織或器官，可以列舉：種子、根、葉及花等，只要能使植物體再生即可，對(duì)其種類沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為種子。關(guān)于誘變?nèi)后w，對(duì)各種類型的植物組織經(jīng)驗(yàn)性地確定誘變性的化學(xué)試劑或放射線的用量，使得能夠得到低于達(dá)到致死性或生殖不育性的閾值水平的變異頻率。

另外，作為變異原，也可以使用轉(zhuǎn)座子(可移動(dòng)遺傳因子)。轉(zhuǎn)座子在煙草基因組上轉(zhuǎn)移，可以抑制eIF(iso)4E基因的功能。作為這樣的轉(zhuǎn)座子的優(yōu)選例子，可以舉出煙草的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子tnt1?；蛘咭部梢詫⑵渌参锏霓D(zhuǎn)座子導(dǎo)入煙草來(lái)使用。作為這樣的轉(zhuǎn)座子，可以列舉例如：玉米的轉(zhuǎn)座子Ac/Ds、Spm/dSpm及Mu、稻的轉(zhuǎn)座子nDart、以及金魚草的轉(zhuǎn)座子tam等，但并不限定于此。

另外，將存在于土壤桿菌的Ti質(zhì)粒中的T-DNA隨機(jī)地(at random)插入煙草，也可以抑制eIF(iso)4E基因的功能。因此，可以制備插入了T-DNA的煙草突變體群體(實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合)，并以eIF(iso)4E的堿基序列為指標(biāo)從其中篩選功能受到抑制的個(gè)體。

在2組(4個(gè))eIF(iso)4E基因中具有變異的病毒抗性煙草的制備方法的一例中，如上所述用變異原對(duì)煙草進(jìn)行處理，制備使煙草基因組全體發(fā)生變異的煙草突變體群體(實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合)，提取基因組DNA。利用基因特異性引物，由實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合的各個(gè)基因組DNA或它們混合而成的DNA對(duì)eIF(iso)4E基因進(jìn)行擴(kuò)增，確定其產(chǎn)物的堿基序列，篩選導(dǎo)入了純合接合變異的品系。首先，分別獲得在S型基因組導(dǎo)入了純合變異的品系及在T型基因組導(dǎo)入了純合變異的品系，制備使它們交配而得到的F1。進(jìn)而培養(yǎng)其自交的后代(F2)，從其中獲得在S型基因組和T型基因組兩者中導(dǎo)入了純合變異的品系(由于雙因子隱性，可以以1/16的概率得到)。對(duì)由此得到的eIF(iso)4E基因是在S型基因組和T型基因組兩者中變異的品系進(jìn)行病毒檢測(cè)，確認(rèn)抗性。此時(shí)，可以使用定量PCR等進(jìn)行eIF(iso)4E基因的表達(dá)分析，確認(rèn)降低了轉(zhuǎn)錄量。

因此，在病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式中，可以包括以下至少1個(gè)工序：制備使煙草基因組全體發(fā)生變異的煙草突變體群體(實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合)的工序、提取基因組DNA的工序、確定eIF(iso)4E基因的堿基序列的工序、篩選導(dǎo)入了純合變異的品系的工序、以及進(jìn)行病毒檢測(cè)確認(rèn)抗性的工序。

另外，為了去除eIF(iso)4E基因以外的DNA部位中導(dǎo)入的變異，可以使變異處理后的品系與未進(jìn)行變異處理的品系在任意時(shí)機(jī)進(jìn)行雜交。

從煙草突變體中提取基因組DNA只要基于公知的方法來(lái)進(jìn)行即可，也可以使用市售的提取試劑盒。另外，基因組DNA可以是粗純化物，也可以是經(jīng)過(guò)若干純化工序后的純化品。

多核苷酸的擴(kuò)增可以通過(guò)例如PCR法來(lái)進(jìn)行，也可以通過(guò)其它公知的基因擴(kuò)增方法、例如LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，ligase chain reaction)法或LAMP(環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)法等來(lái)進(jìn)行。

用于擴(kuò)增各多核苷酸的引物序列例如可以根據(jù)序列號(hào)7的堿基序列或者根據(jù)序列號(hào)8的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)。根據(jù)序列號(hào)7(S型eIF(iso)4E基因)的堿基序列和序列號(hào)8(T型eIF(iso)4E基因)的堿基序列的同源性分析結(jié)果，首先找到S型特異性區(qū)域及T型特異性區(qū)域。通過(guò)對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)引物，可以從S型與T型混在一起的煙草基因組中分別特異性地對(duì)S型及T型基因進(jìn)行擴(kuò)增。作為設(shè)計(jì)的部位，可以從S型或T型特異性區(qū)域選擇，優(yōu)選為內(nèi)含子、5’非翻譯區(qū)域或3’非翻譯區(qū)域。引物的長(zhǎng)度優(yōu)選為15堿基～30堿基，特別優(yōu)選為17堿基～25堿基。引物序列可以基于對(duì)序列號(hào)7的堿基序列特異性的區(qū)域、或?qū)π蛄刑?hào)8的堿基序列特異性的區(qū)域、或與兩堿基序列共同的區(qū)域的序列來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，只要能夠作為對(duì)包含變異部位的給定堿基數(shù)的序列進(jìn)行擴(kuò)增的引物而發(fā)揮作用即可，該序列中可以包含1個(gè)或1個(gè)以上的取代、缺失和/或添加。另外，引物可以根據(jù)需要用熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)記。

擴(kuò)增的各多核苷酸的長(zhǎng)度只要是能夠利用下面敘述的各種檢測(cè)方法的長(zhǎng)度即可，沒(méi)有特別限定，例如為20堿基～5000堿基，更優(yōu)選為50堿基～2000堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為100堿基～700堿基，更進(jìn)一步優(yōu)選為100堿基～500堿基。

以下，作為檢測(cè)變異的方法，舉出代表性的方法，但并不限定于此。

(1)通過(guò)利用市售的測(cè)序儀等直接讀取各多核苷酸的堿基序列來(lái)檢測(cè)有無(wú)變異的方法。

(2)使用SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性，Single Strand Conformation Polymorphism：?jiǎn)捂湗?gòu)型多態(tài)性)法檢測(cè)有無(wú)變異的方法。

從利用上述方法檢測(cè)出變異的煙草突變體中，利用eIF(iso)4E基因特異性引物確認(rèn)擴(kuò)增后的(PCR)產(chǎn)物的堿基序列，由此可以弄清楚變異是純合變異還是雜合變異，或者是S型基因組發(fā)生的變異還是T型基因組發(fā)生的變異。

在EMS處理的情況下，多數(shù)DNA的變異為C→T和G→A。因此，通過(guò)EMS處理進(jìn)行變異時(shí)，成為終止密碼子(即，成為無(wú)義變異的候選)的密碼子為CAA(最初的C取代為T)、CGA(最初的C取代為T)、TGG(第2個(gè)G或第3個(gè)G取代為A)及CAG(最初的C取代為T)這4種。

例如，在序列號(hào)7的情況下，如果(1)第270號(hào)的C取代為T、(2)第295號(hào)的G取代為A、(3)第296號(hào)的G取代為A、(4)第304號(hào)的G取代為A、(5)第305號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第330號(hào)的C取代為T、(8)第343號(hào)的G取代為A、(9)第344號(hào)的G取代為A、(10)第357號(hào)的C取代為T、(11)第394號(hào)的G取代為A、(12)第395號(hào)的G取代為A、(13)第1740號(hào)的C取代為T、(14)第1813號(hào)的G取代為A、(15)第1814號(hào)的G取代為A、(16)第1846號(hào)的G取代為A、(17)第1847號(hào)的G取代為A、(18)第1888號(hào)的G取代為A、(19)第1889號(hào)的G取代為A、(20)第2050號(hào)的C取代為T、(21)第2104號(hào)的C取代為T、(22)第2123號(hào)的G取代為A、(23)第2124號(hào)的G取代為A、(24)第2152號(hào)的C取代為T、(25)第4742號(hào)的G取代為A、(26)第4743號(hào)的G取代為A、或者(27)第4926號(hào)的C取代為T，則成為終止密碼子(TAA、TAG或TGA)。因此，在病毒抗性煙草的一個(gè)優(yōu)選例中，變異是基因組DNA中由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的eIF(iso)4E基因的上述(1)～(27)所示的1個(gè)以上的變異。其中，優(yōu)選發(fā)生(1)～(26)中任意變異的情況，更優(yōu)選發(fā)生(1)～(24)中任意變異的情況。

例如，在序列號(hào)8的情況下，如果(1)第264號(hào)的C取代為T、(2)第289號(hào)的G取代為A、(3)第290號(hào)的G取代為A、(4)第298號(hào)的G取代為A、(5)第299號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第328號(hào)的G取代為A、(8)第329號(hào)的G取代為A、(9)第342號(hào)的C取代為T、(10)第379號(hào)的G取代為A、(11)第380號(hào)的G取代為A、(12)第1630號(hào)的C取代為T、(13)第1703號(hào)的G取代為A、(14)第1704號(hào)的G取代為A、(15)第1736號(hào)的G取代為A、(16)第1737號(hào)的G取代為A、(17)第1778號(hào)的G取代為A、(18)第1779號(hào)的G取代為A、(19)第1940號(hào)的C取代為T、(20)第1994號(hào)的C取代為T、(21)第2013號(hào)的G取代為A、(22)第2014號(hào)的G取代為A、(23)第2042號(hào)的C取代為T、(24)第3224號(hào)的G取代為A、(25)第3225號(hào)的G取代為A、或者(26)第3406號(hào)的C取代為T，則成為終止密碼子(TAA、TAG或TGA)。因此，在病毒抗性煙草的一個(gè)優(yōu)選例中，變異是基因組DNA中由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的eIF(iso)4E基因的上述(1)～(26)所示的1個(gè)以上的變異。其中，優(yōu)選發(fā)生(1)～(25)中任意變異的情況，更優(yōu)選發(fā)生(1)～(23)中任意變異的情況。

或者，變異可以是野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子中下述(1)～(4)所示的1個(gè)以上的變異：(1)密碼子CAA的C取代為T、(2)密碼子CGA的C取代為T、(3)密碼子CAG的C取代為T、(4)密碼子TGG的G(2個(gè)G中的任一個(gè)或兩個(gè))取代為A，所述野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子是(a)編碼與序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、或者(b)生成與序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子，而且編碼功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

作為使eIF(iso)4E基因發(fā)生變異的其它方法，也可以使用基因編輯技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)是指向基因組的任意區(qū)域?qū)胱儺惖募夹g(shù)。作為這樣的技術(shù)，可以列舉例如：TALEN(轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物，Transcription activator-like effector)、CRISPR(聚簇規(guī)則散布短回文重復(fù)，Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CAS、ODM(寡核苷酸指導(dǎo)的誘變，Oligonucleotide Directed Mutagenesis)及ZFN(鋅指核酸酶，Zinc Finger Nuclease)等。

ODM和ZFN的定義記載于文獻(xiàn)：Lusser et al.(2012)Nature Biotechnology 30:231-239。另外，對(duì)于ODM，例如在文獻(xiàn)：Zhu et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:8768-8773、以及文獻(xiàn)：Oh and May(2001)Current Opinion in Biotechnology 12:169-172.中記載了對(duì)植物的應(yīng)用。對(duì)于ZFN，在文獻(xiàn)：Durai et al.(2005)Nucleic Acids Res 33:5978-5990中記載了對(duì)植物的應(yīng)用。按照上述記載的方法可以向eIF(iso)4E基因中導(dǎo)入變異。

對(duì)于TALEN，如下所述。源自植物病原菌的DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)效應(yīng)物具有34個(gè)氨基酸重復(fù)的結(jié)構(gòu)部分，該重復(fù)結(jié)構(gòu)逐個(gè)堿基識(shí)別DNA的堿基。DNA中有4種堿基(A、T、G、C)，但由TAL效應(yīng)物的重復(fù)結(jié)構(gòu)的第13號(hào)和第14號(hào)2個(gè)氨基酸決定DNA序列的結(jié)合特異性。即，通過(guò)選擇各重復(fù)結(jié)構(gòu)的第13～14號(hào)氨基酸，能夠人為地使TAL效應(yīng)物與希望的DNA區(qū)域結(jié)合。將使該TAL效應(yīng)物與在二聚體時(shí)顯示出DNA切斷活性的酶FokI融合而成的酶稱為TAL效應(yīng)物核酸酶(TALEN)。當(dāng)設(shè)計(jì)為使2個(gè)該TALEN在彼此附近結(jié)合時(shí)，F(xiàn)ok I形成二聚體，切斷2個(gè)TALEN之間的DNA。發(fā)生切斷后，可以進(jìn)行DNA的修復(fù)，但此時(shí)，有時(shí)切斷部位稍被切除或?qū)肓诵碌奶砑印Ｒ阎猅ALEN對(duì)植物也起作用(文獻(xiàn)：Zhang et al.(2013)Plant Physiology 161:20-27)。

例如，序列號(hào)1或2中，優(yōu)選在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域中，對(duì)eIF(iso)4E特異性的優(yōu)選15堿基～25堿基、更優(yōu)選18堿基～22堿基的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，在距其優(yōu)選9堿基～15堿基的部位同樣地設(shè)計(jì)核苷酸序列。上述2個(gè)核苷酸所包夾的部分隨后被切斷。

為了判斷設(shè)計(jì)的核苷酸序列是否為eIF(iso)4E基因特異性，可以通過(guò)對(duì)例如煙草(Nicotiana tabacum)或林煙草或絨毛狀煙草的公知的序列數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)設(shè)計(jì)的核苷酸序列進(jìn)行同源性檢索，來(lái)研究序列本身以外是否具有包含該序列的同源性高的區(qū)域。作為序列數(shù)據(jù)庫(kù)，可以利用例如：GenBank、EMBL(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，The European Molecular Biology Loboratory)或DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，DNA Data Bank of Japan)等。作為序列分析算法，可以利用例如BLAST等。另外，作為數(shù)據(jù)庫(kù)的序列的種類，有核苷酸集合(Nucleotide Collection)(nr/nt)、表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags)(EST)、基因組測(cè)量序列(Genomic survey sequences)(GSS)、以及全基因組鳥槍法重疊群(Whole genome shotgun contigs)(WGS)等，但并不限定于此。

基于設(shè)計(jì)的特異性核苷酸序列，對(duì)TALE的基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)的結(jié)合可以使用例如GoldenGateTALEN Kit(Addgene公司)，但并不限定于此。在使TALE與FokI融合時(shí)，例如可以設(shè)置適當(dāng)?shù)慕宇^序列。需要說(shuō)明的是，F(xiàn)okI序列收錄于公知數(shù)據(jù)庫(kù)。用于使TALE/FokI融合基因在煙草中表達(dá)的啟動(dòng)子優(yōu)選為高表達(dá)的啟動(dòng)子，可以列舉：花椰菜花葉病毒35S RNA基因的啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子及泛素基因的啟動(dòng)子等的組成性表達(dá)啟動(dòng)子；Rubisco小亞基基因的啟動(dòng)子、PPDK基因啟動(dòng)子等綠色組織特異性啟動(dòng)子；以及其它的器官或時(shí)期特異性啟動(dòng)子，但并不限定于此。為了提高表達(dá)量，可以在啟動(dòng)子與TALE/FokI之間設(shè)置希望的內(nèi)含子。進(jìn)而，為了提高表達(dá)量，還可以將TALE/FokI的密碼子最優(yōu)化為植物(煙草)的密碼子。植物密碼子記載于例如密碼子選擇數(shù)據(jù)庫(kù)(Codon Usage Database)(http://www.kazusa.or.jp/codon/)等公知的數(shù)據(jù)庫(kù)中。

在用于將TALEN表達(dá)盒(expression cassette)導(dǎo)入植物的載體中，除了上述以外，還可以加入用于篩選導(dǎo)入了表達(dá)盒的植物細(xì)胞的耐藥性基因(篩選標(biāo)記物)的表達(dá)盒。作為耐藥性基因，可以是能夠篩選煙草細(xì)胞的藥劑的耐受性基因，可以列舉例如：卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：NPT-II)及潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：HPT)等，但并不限定于此。另外，只要啟動(dòng)子是組成性表達(dá)即可，沒(méi)有特別限定。

另外，在將TALEN表達(dá)盒穩(wěn)定地導(dǎo)入植物時(shí)利用土壤桿菌的情況下，TALEN表達(dá)盒和篩選標(biāo)記物表達(dá)盒需要存在于T-DNA中。在該情況下，作為T-DNA的邊界序列，右邊界(RB)序列和左邊界(LB)序列設(shè)置于T-DNA的兩端。

作為能夠?qū)⒒驅(qū)霟煵莸妮d體，所述載體是用于將TALEN表達(dá)盒導(dǎo)入植物的載體，可以列舉例如：pBI系、pSB系(文獻(xiàn)：Komari et al.2006Methods in Mol.Biol.343:15-41.)、pLC系(文獻(xiàn)：美國(guó)專利第8298819號(hào)說(shuō)明書)、以及pGreen(文獻(xiàn)：Hellens et al.2000Plant Mol.Biol.42:819-832.)等，但不限定于此。

將TALEN表達(dá)盒導(dǎo)入植物的方法沒(méi)有特別限定，可以使用上述使用土壤桿菌的方法、基因槍法、PEG法、電穿孔法或農(nóng)桿菌滲入法(Agroinfiltration)等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法。另外，作為導(dǎo)入的煙草的組織或器官，只要能使植物體再生即可，對(duì)其種類沒(méi)有特別限定，可以列舉例如：種子、根、葉及花等。

對(duì)于轉(zhuǎn)化植物的篩選及培育而言，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就能夠容易地實(shí)施。作為用于篩選的藥劑，并不限定于此，可以列舉：卡那霉素和潮霉素等。藥劑的濃度可以設(shè)為例如20mg/mL～200mg/mL，優(yōu)選為50mg/mL～100mg/mL。植物培養(yǎng)物的培育用的培養(yǎng)基可以是通常使用的培養(yǎng)基，作為無(wú)機(jī)鹽的種類，可以列舉MS和LS等，向其中添加例如：蔗糖、瓊脂或植物激素等。它們的使用濃度可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的技術(shù)方案作為基準(zhǔn)。

作為進(jìn)行基因?qū)氲慕M織或器官，除了上述以外，還可以使用原生質(zhì)體。原生質(zhì)體可以使用細(xì)胞壁分解酶按照通常方法制備。另外，作為基因?qū)敕?，除了上述的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法，還可以使用瞬時(shí)法(transient method)。瞬時(shí)試驗(yàn)(transient assay)可以使用電穿孔法或PEG法等通常方法來(lái)實(shí)施。另外，作為其它瞬時(shí)試驗(yàn)法，可以列舉：農(nóng)桿菌滲入法和病毒載體等。作為病毒載體，可以使用ALSV(蘋果潛在球形病毒，Apple latent spherical virus)或TRV(煙草脆裂病毒)等，但并不限定于此。

在從導(dǎo)入了基因的細(xì)胞再生得到的個(gè)體或組織或器官中，eIF(iso)4E基因中是否產(chǎn)生了變異可以通過(guò)以下方式來(lái)確認(rèn)：以包夾作為目標(biāo)的區(qū)域的方式設(shè)計(jì)引物，從希望的植物組織中提取DNA，通過(guò)PCR等對(duì)該區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并弄清楚其產(chǎn)物的堿基序列。

分析基因表達(dá)的方法沒(méi)有特別限定，可以用RNA印跡雜交(northern雜交)法或定量PCR法等公知的方法來(lái)進(jìn)行。用于雜交的探針可以是序列號(hào)1的堿基序列或其一部分(例如序列號(hào)9)、或者序列號(hào)2的堿基序列或其一部分、或者上述序列中存在1個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失或插入的堿基序列，探針長(zhǎng)度可以為例如20堿基～序列全長(zhǎng)。

用于進(jìn)行上述表達(dá)分析的RNA提取可以通過(guò)鹽酸胍法或SDS-苯酚法等公知的方法來(lái)進(jìn)行，也可以使用市售的試劑盒。另外，可以從總RNA中進(jìn)一步對(duì)mRNA(polyA+RNA)進(jìn)行純化。

用于實(shí)施定量PCR的cDNA的合成可以通過(guò)使用了逆轉(zhuǎn)錄酶和低聚dT引物或基因特異性引物的公知方法來(lái)進(jìn)行，也可以使用市售的試劑盒。

另外，用于定量PCR的引物可以基于序列號(hào)1或序列號(hào)2來(lái)設(shè)計(jì)。作為引物的長(zhǎng)度，優(yōu)選為15堿基～30堿基，特別優(yōu)選為17堿基～25堿基。通過(guò)一組引物組擴(kuò)增的靶序列的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，例如可以為40堿基～序列全長(zhǎng)，優(yōu)選為50堿基～500堿基。

在實(shí)施使用了熒光PCR裝置的定量PCR時(shí)，除了上述引物，還可以在靶序列中設(shè)定探針序列。靶序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為40堿基～200堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為50堿基～150堿基。作為標(biāo)記引物和探針的報(bào)告染料(reporter dye)，可以列舉：FAM、HEX、TET及Cyanine5，并且淬滅染色，可以列舉：TAMRA和BHQ1等，但并不限定于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇并組合。用作定量PCR的內(nèi)標(biāo)物的基因，只要是組成性表達(dá)基因即可，沒(méi)有特別限定，作為優(yōu)選的基因，可以列舉：延長(zhǎng)因子基因及肌動(dòng)蛋白基因等。

對(duì)于CRISPR/CAS，如下所述。CRISPR/CAS系統(tǒng)是使用識(shí)別DNA序列的指導(dǎo)RNA和CAS核酸酶的基因編輯技術(shù)，已知在植物中也發(fā)揮作用(文獻(xiàn)：Belhaj et al.(2013)Plant Methods 9:39)。該技術(shù)是切斷基因組上具有希望的序列的DNA的技術(shù)，關(guān)于靶基因組序列的缺失、添加及插入，與TALEN一樣，依賴于宿主的DNA修復(fù)系統(tǒng)的錯(cuò)誤。

作為用于在植物中使CAS9表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選高表達(dá)的啟動(dòng)子，可以列舉例如：上述的35S RNA基因的啟動(dòng)子、泛素基因的啟動(dòng)子及PPDK基因啟動(dòng)子等，但并不限定于此。為了提高表達(dá)量，也可以將希望的內(nèi)含子設(shè)置于啟動(dòng)子與CAS9之間。需要說(shuō)明的是，CAS9的堿基序列是公知的。另外，為了提高表達(dá)量，還可以將CAS9的密碼子最優(yōu)化為植物(煙草)的密碼子。另外，還可以在CAS9中添加核定位信號(hào)NLS(Nuclear localize Signal)。

設(shè)計(jì)希望的基因組序列和互補(bǔ)的指導(dǎo)RNA。例如，在序列號(hào)1或2中，優(yōu)選在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域確定eIF(iso)4E特異性的優(yōu)選19堿基～22堿基的核苷酸序列。此時(shí)，在該序列的3’末端側(cè)需要存在被稱為原間隔物相鄰基序(protospacer-adjacent motif)(PAM)的NGG序列。另外，在下面敘述的啟動(dòng)子的種類為U6的情況下，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(指導(dǎo)RNA的5’末端)需要為G，在U3啟動(dòng)子的情況下需要為A。

為了判斷指導(dǎo)RNA的序列是否具有eIF(iso)4E基因特異性，可以對(duì)例如煙草(Nicotiana tabacum)或林煙草或絨毛狀煙草的序列數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行同源性檢索，來(lái)研究序列本身以外是否具有包含該序列的同源性高的區(qū)域。關(guān)于序列數(shù)據(jù)庫(kù)及分析算法，與上述相同。

設(shè)計(jì)指導(dǎo)RNA之后，在其3’末端側(cè)融合sgRNA支架(scaffold)序列，形成sgRNA(指導(dǎo)(g)RNA+gRNA支架)，制備用于表達(dá)該sgRNA的構(gòu)建物(construct)。此時(shí)，作為啟動(dòng)子，可以使用RNA聚合酶III的U6或U3等的啟動(dòng)子。使用適當(dāng)?shù)妮d體將完成的構(gòu)建物導(dǎo)入煙草，對(duì)重組體進(jìn)行篩選、再生。需要說(shuō)明的是，為了更可靠地產(chǎn)生變異，可以在eIF(iso)4E內(nèi)部設(shè)計(jì)多個(gè)指導(dǎo)RNA，并將表達(dá)它們的構(gòu)建物同時(shí)導(dǎo)入煙草。在該情況下，可以在1個(gè)T-DNA上同時(shí)設(shè)置多個(gè)指導(dǎo)RNA表達(dá)盒和CAS9表達(dá)盒。

需要說(shuō)明的是，用于將使指導(dǎo)RNA和CAS9表達(dá)的盒導(dǎo)入植物的載體、以及煙草轉(zhuǎn)化的方法與上述TALEN中的說(shuō)明相同。

作為進(jìn)行基因?qū)氲慕M織或器官，除了上述以外，還可以使用原生質(zhì)體。原生質(zhì)體可以按照通常方法使用細(xì)胞壁分解酶來(lái)制備。另外，作為基因?qū)敕?，除了上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法，可以使用瞬時(shí)法。對(duì)于瞬時(shí)試驗(yàn)，與上述TALEN中的說(shuō)明相同。

在從導(dǎo)入了基因的細(xì)胞再生而成的個(gè)體或組織或器官中是否使eIF(iso)4E基因產(chǎn)生變異，可以按照與上述TALEN中的說(shuō)明相同的方法來(lái)確認(rèn)。

作為病毒檢測(cè)方法，可以列舉：病毒溶液與碳化硅等固體粉末組合的機(jī)械接種法、以及使用感染病毒的蚜蟲的接種法等，但并不限定于此。另外，使用的病毒沒(méi)有特別限定，作為病毒抗性煙草顯示出抗性的病毒，可以使用上述列舉的病毒。

(病毒抗性煙草及其制備方法的方式2)

本發(fā)明的病毒抗性煙草的另外一個(gè)方式是eIF(iso)4E基因的表達(dá)量與野生型相比為20％以下的病毒抗性煙草。表達(dá)受到抑制的煙草的eIF(iso)4E基因的表達(dá)量在將野生型的表達(dá)量設(shè)為100％時(shí)優(yōu)選為15％以下，更優(yōu)選為10％以下。這里，“野生型”是指未導(dǎo)入使eIF(iso)4E基因的表達(dá)受到抑制的因子、且eIF(iso)4E基因中不具有變異的煙草。

這樣的病毒抗性煙草的制備可以使用現(xiàn)有公知的方法，可以列舉例如利用反義、共抑制、RNA干擾(RNAi)、microRNA、VIGS、核酶、同源重組、以及顯性負(fù)性基因產(chǎn)物的表達(dá)等的方法。具體而言，可以通過(guò)將使eIF(iso)4E基因表達(dá)量抑制至與野生型相比為20％以下、優(yōu)選為15％以下、更優(yōu)選為10％以下的因子導(dǎo)入煙草中來(lái)制備。

作為抑制eIF(iso)4E的表達(dá)的方法，優(yōu)選RNAi。具體而言，制備RNAi構(gòu)建物，并與植物中表達(dá)的啟動(dòng)子融合，使用載體將其導(dǎo)入煙草中，所述RNAi構(gòu)建物使用eIF(iso)4E基因的堿基序列(例如序列號(hào)1)或其一部分(例如序列號(hào)9)、或者例如序列號(hào)2的堿基序列或其一部分作為觸發(fā)器(trigger)。然后，使RNAi構(gòu)建物表達(dá)，得到使eIF(iso)4E基因的表達(dá)受到抑制的病毒抗性煙草。因此，一個(gè)方式中的病毒抗性煙草可以保持用于抑制eIF(iso)4E基因的表達(dá)的RNAi構(gòu)建物。

觸發(fā)器的長(zhǎng)度可以為例如21堿基～序列全長(zhǎng)，優(yōu)選為50堿基以上，更優(yōu)選為100堿基以上。觸發(fā)器序列中可以有1個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失或插入。

在RNAi中，將觸發(fā)器序列功能性連接，使得其1個(gè)為正義方向另1個(gè)為反義方向，制備觸發(fā)器序列反向重復(fù)的RNAi構(gòu)建物。此時(shí)，兩觸發(fā)器之間優(yōu)選加入間隔序列。作為這樣的間隔序列，優(yōu)選為煙草的基因組中不含有的序列、或者內(nèi)含子序列等成熟mRNA中不含有的區(qū)域。作為這樣的序列，可以列舉例如：β葡萄糖醛酸酶(GUS)基因、丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase)(pdk)及過(guò)氧化氫酶(cat)基因等的內(nèi)含子序列，但并不限定于此。

作為用于使RNAi構(gòu)建物在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，可以列舉例如：花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus)35S RNA基因的啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子、以及泛素基因的啟動(dòng)子等組成性表達(dá)啟動(dòng)子；Rubisco小亞基基因的啟動(dòng)子及PPDK基因啟動(dòng)子等綠色組織特異性啟動(dòng)子；以及其它器官或時(shí)期特異性啟動(dòng)子，但并不限定于此。作為上述啟動(dòng)子，優(yōu)選為在病毒感染的組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。

另外，作為終止子，可以列舉：花椰菜花葉病毒35S RNA或19S RNA基因的終止子、以及胭脂堿合成酶基因的終止子等，只要在植物中發(fā)揮作用即可，但并不限定于此。

在用于將RNAi表達(dá)盒導(dǎo)入植物的載體中，除了上述以外，還可以加入耐藥性基因的表達(dá)盒，所述耐藥性基因的表達(dá)盒用于篩選導(dǎo)入了上述RNAi表達(dá)盒的植物細(xì)胞。作為耐藥性基因，只要是能夠篩選煙草細(xì)胞的耐藥性基因即可，可以列舉例如：卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：NPT-II)及潮霉素抗性基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：HPT)等，但并不限定于此。另外，只要啟動(dòng)子也是進(jìn)行組成性表達(dá)的啟動(dòng)子即可，沒(méi)有特別限定。

另外，在穩(wěn)定地向植物中導(dǎo)入RNAi表達(dá)盒時(shí)利用土壤桿菌的情況下，RNAi表達(dá)盒和篩選標(biāo)記物表達(dá)盒需要存在于T-DNA中。在該情況下，作為T-DNA的邊界序列，右邊界(RB)序列及左邊界(LB)序列可以分別設(shè)置于T-DNA的兩端。

另外，為了從視覺(jué)上預(yù)測(cè)基因表達(dá)，可以在T-DNA中設(shè)置熒光蛋白質(zhì)的表達(dá)盒。作為熒光蛋白質(zhì)，可以列舉例如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)及黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)等，但并不限定于此。作為熒光蛋白質(zhì)，優(yōu)選為GFP。熒光可以用圖像分析儀進(jìn)行觀察。

作為能夠?qū)⒒驅(qū)霟煵葜械妮d體，其用于將RNAi表達(dá)盒導(dǎo)入植物，可以列舉例如：pBI系、pSB系(文獻(xiàn)：Komari et al.2006Methods in Mol.Biol.343:15-41.)、pLC系(文獻(xiàn)：美國(guó)專利第8298819號(hào)說(shuō)明書)、pGreen(文獻(xiàn)：Hellens et al.2000Plant Mol.Biol.42:819-832.)、pHellsgate(文獻(xiàn)：Wesley et al.2001Plant J 27:581-590.)、以及pSP231(文獻(xiàn)：國(guó)際公開(kāi)第2011/102394號(hào)公報(bào))等，但并不限定于此。

將RNAi表達(dá)盒導(dǎo)入植物的方法沒(méi)有特別限定，可以利用使用上述土壤桿菌的方法、基因槍法、PEG法、電穿孔法或農(nóng)桿菌滲入法等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法。另外，作為導(dǎo)入的煙草組織或器官，只要能夠使植物體再生即可，對(duì)其種類沒(méi)有特別限定，可以列舉例如：種子、根、葉及花等。

對(duì)于轉(zhuǎn)化植物的篩選和培育而言，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就能夠容易地實(shí)施。作為用于篩選的藥劑，可以列舉：卡那霉素和潮霉素等，但并不限定于此。藥劑的濃度可以為例如20mg/mL～200mg/mL，優(yōu)選為50mg/mL～100mg/mL。植物培養(yǎng)物的培育用培養(yǎng)基可以使用通常所用的培養(yǎng)基，作為無(wú)機(jī)鹽的種類，可以舉出MS和LS等，可以向其中添加例如：蔗糖、瓊脂或植物激素等。這些的使用濃度只要按照本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的實(shí)驗(yàn)方案即可。

對(duì)于分析基因表達(dá)的方法和病毒檢測(cè)方法，如上所述。

〔2.對(duì)煙草賦予病毒抗性的方法〕

另外，本發(fā)明提供對(duì)煙草賦予病毒抗性的方法。

在該方法的一個(gè)方式中，通過(guò)向翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中導(dǎo)入變異來(lái)對(duì)煙草賦予病毒抗性，所述變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。對(duì)于導(dǎo)入這樣的變異的方法，如〔1.病毒抗性煙草及其制備方法〕項(xiàng)中記載所述。

另外，在該方法的另一個(gè)方式中，通過(guò)導(dǎo)入使翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)量抑制至與野生型相比為20％以下、優(yōu)選為15％以下、更優(yōu)選為10％以下的因子，對(duì)煙草賦予病毒抗性。對(duì)于導(dǎo)入這樣的因子的方法，如〔1.病毒抗性煙草及其制備方法〕項(xiàng)中記載所述。

〔3.DNA標(biāo)記物及其利用〕

在本發(fā)明中，可以利用煙草eIF(iso)4E基因上發(fā)生的變異來(lái)開(kāi)發(fā)DNA標(biāo)記物，可以將其充分應(yīng)用于標(biāo)記物育種?！癉NA標(biāo)記物”是指品種之間或個(gè)體之間的DNA堿基序列的差異(變異或多態(tài)性)、或者用于檢測(cè)該差異的工具，是指成為用于識(shí)別品種或個(gè)體的標(biāo)記物的堿基序列的差異(變異或多態(tài)性)、或者用于檢測(cè)該差異的工具。在eIF(iso)4E基因中的變異確定，并確認(rèn)了由該變異引起對(duì)病毒的抗性的情況下，可以將產(chǎn)生了該變異的煙草突變體用作該病毒抗性的育種親本。此時(shí)，由于已知與抗性相關(guān)的引起抗性的變異，因此，可以在eIF(iso)4E基因上設(shè)計(jì)能夠用于識(shí)別引起抗性的變異的標(biāo)記物。由于該變異與病毒抗性的關(guān)系不因遺傳分離而切斷，因此能夠進(jìn)行精密的標(biāo)記物育種。如果檢測(cè)出有無(wú)該變異，則在反復(fù)進(jìn)行交配等時(shí)不需要每次確認(rèn)病毒抗性。

可以基于通常方法進(jìn)行從煙草提取基因組DNA，可以使用市售的提取試劑盒，但沒(méi)有特別限定。另外，基因組DNA可以是粗純化物，也可以是經(jīng)過(guò)若干純化工序后的純化品。作為檢測(cè)有無(wú)變異的技術(shù)，有例如：應(yīng)用了RFLP或?qū)捂淒NA用于探針的核酸(也稱為“多核苷酸”)的雜交的技術(shù)、以及PCR等這樣的伴隨多核苷酸擴(kuò)增的技術(shù)等，只要可以檢測(cè)變異即可，沒(méi)有特別限定。

在對(duì)多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，可以通過(guò)例如PCR法進(jìn)行，也可以通過(guò)其它公知的基因擴(kuò)增方法、例如、LCR法、SDA(鏈置換擴(kuò)增，Strand Displacement Amplification)法或LAMP法等來(lái)進(jìn)行。擴(kuò)增的各多核苷酸的長(zhǎng)度只要是能夠用下面敘述的各種檢測(cè)方法的長(zhǎng)度即可，沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為例如40堿基～5000堿基，更優(yōu)選為100堿基～1000堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為100堿基～700堿基，更進(jìn)一步優(yōu)選為100堿基～500堿基。

用于擴(kuò)增各多核苷酸的引物序列優(yōu)選設(shè)計(jì)為包夾變異部位或者包含變異部位，但設(shè)計(jì)引物序列的位置沒(méi)有特別限定。引物的長(zhǎng)度優(yōu)選為15堿基～30堿基，特別優(yōu)選為17堿基～25堿基。另外，作為用于對(duì)包含變異部位的給定堿基數(shù)的序列進(jìn)行擴(kuò)增的引物，只要能夠發(fā)揮作用即可，可以在該序列中包含1個(gè)或1個(gè)以上的取代、缺失和/或添加。另外，引物可以根據(jù)需要用熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)記。

檢測(cè)的變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。其具體例子如〔1.病毒抗性煙草及其制備方法〕項(xiàng)所述。

以下，作為檢測(cè)變異的方法，可以舉出代表性的方法，但并不限定于此。

(1)通過(guò)利用市售的測(cè)序儀等直接讀取擴(kuò)增的多核苷酸的堿基序列來(lái)檢測(cè)有無(wú)變異的方法。

(2)使用SSCP(單鏈置換多態(tài)性，Single Strand Conformation Polymorphism)法檢測(cè)擴(kuò)增的多核苷酸上有無(wú)變異的方法。

(3)對(duì)于擴(kuò)增的多核苷酸，利用特異性識(shí)別變異部位序列(變異前的序列或變異后的序列)的限制酶進(jìn)行處理，然后通過(guò)是否切斷來(lái)進(jìn)行判斷的方法(CAPS(切割擴(kuò)增多態(tài)性方法，Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)法)。另外，可以使用通過(guò)包含有意設(shè)計(jì)的錯(cuò)配引物的引物組來(lái)制備限制酶識(shí)別部位的dCAPS(衍生CAPS，derived CAPS)法。作為這樣的引物組，例如，作為用于檢測(cè)序列號(hào)7所示的S型eIF(iso)4E基因的堿基序列第330號(hào)堿基的C→T變異的引物，可以列舉：由序列號(hào)45所示的堿基序列構(gòu)成的核酸及由序列號(hào)46所示的堿基序列構(gòu)成的核酸的組，但并不限定于此。另外，在如序列號(hào)46所示的堿基序列一樣使用錯(cuò)配引物的情況下，有時(shí)擴(kuò)增效率不好，在這樣的情況下，可以在靶序列的外側(cè)部位設(shè)計(jì)無(wú)錯(cuò)配的引物(在上述情況下，例如由序列號(hào)25和26所示的堿基序列構(gòu)成的核酸引物的組)，預(yù)先進(jìn)行一次PCR，以該P(yáng)CR產(chǎn)物的一部分為模板，用錯(cuò)配引物進(jìn)行再擴(kuò)增，并將得到的PCR產(chǎn)物用限制酶進(jìn)行處理，由此檢測(cè)變異。

另外，作為包含上述錯(cuò)配引物的引物組，例如，作為用于檢測(cè)序列號(hào)8所示的T型eIF(iso)4E基因的堿基序列第299號(hào)堿基的G→A變異的引物，可以列舉：由序列號(hào)47所示的堿基序列構(gòu)成的核酸及由序列號(hào)48所示的堿基序列構(gòu)成的核酸的組，但并不限定于此。另外，在如序列號(hào)48所示的堿基序列一樣使用錯(cuò)配引物的情況下，有時(shí)擴(kuò)增效率不好，在這樣的情況下，可以在靶序列的外側(cè)部位設(shè)計(jì)無(wú)錯(cuò)配的引物(在上述情況下，例如由序列號(hào)31和32所示的堿基序列構(gòu)成的核酸引物的組)，預(yù)先進(jìn)行一次PCR，以該P(yáng)CR產(chǎn)物的一部分為模板，用錯(cuò)配引物進(jìn)行再擴(kuò)增，并將得到的PCR產(chǎn)物用限制酶進(jìn)行處理，由此檢測(cè)變異。

需要說(shuō)明的是，在檢測(cè)上述例示的變異以外的變異時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不需要花費(fèi)很多的勞動(dòng)設(shè)計(jì)引物序列，進(jìn)行PCR，檢測(cè)希望的變異。例如，可以通過(guò)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行引物序列的設(shè)計(jì)(文獻(xiàn)：Neff et al.(2002)Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis.TRENDS in Genetics18:613-615)。

需要說(shuō)明的是，在引物之一的3’末端附近導(dǎo)入錯(cuò)配的情況下，在使用具有校對(duì)活性的DNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，錯(cuò)配被修正，有可能無(wú)法被限制酶切斷。因此，在dCAPS法中，在使用錯(cuò)配引物時(shí)，優(yōu)選不具有校對(duì)活性的DNA聚合酶。作為這樣的DNA聚合酶，可以舉出TaKaRa Taq^TM(TAKARA BIO公司)，但并不限定于此。另外，在引物的3’末端附近導(dǎo)入限制酶切斷部位的情況下，可以以引物長(zhǎng)度的差異的形式來(lái)檢測(cè)是否切斷。

(4)通過(guò)設(shè)計(jì)在變異部分特異性地雜交的探針并使其雜交來(lái)確認(rèn)有無(wú)變異的方法。

分析方法沒(méi)有特別限定，可以使用例如：使用TaqMan(注冊(cè)商標(biāo))探針?lè)ǖ腜CR、或者作為利用TOF-MS的測(cè)定技術(shù)的MassARRAY(注冊(cè)商標(biāo))分析等。

(5)設(shè)計(jì)引物序列使一部分含有變異部位的序列(變異前的序列和/或變異后的序列)，并通過(guò)PCR法等使其擴(kuò)增，由此通過(guò)有無(wú)擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)有無(wú)變異的方法(等位基因特異性PCR法)。作為這樣的引物，例如，作為用于檢測(cè)序列號(hào)7所示的S型eIF(iso)4E基因的堿基序列第330號(hào)堿基的C→T變異的引物，可以列舉由序列號(hào)37所示的堿基序列構(gòu)成的核酸及由序列號(hào)39所示的堿基序列構(gòu)成的核酸的組，但并不限定于此。在該情況下，作為對(duì)照，例如可以使用由對(duì)變異前的堿基序列特異性的序列號(hào)38所示的堿基序列構(gòu)成的核酸引物。

另外，例如，作為用于檢測(cè)序列號(hào)8所示的T型eIF(iso)4E基因的堿基序列第299號(hào)堿基的G→A變異的引物，可以列舉：由序列號(hào)40所示的堿基序列構(gòu)成的核酸及由序列號(hào)42所示的堿基序列構(gòu)成的核酸的組，但并不限定于此。在該情況下，作為對(duì)照，例如可以使用由對(duì)變異前的堿基序列特異性的序列號(hào)41所示的堿基序列構(gòu)成的核酸引物。

需要說(shuō)明的是，在引物的3’末端附近導(dǎo)入目的變異的堿基時(shí)，其位置優(yōu)選為末端或者從末端至數(shù)個(gè)堿基之間。另外，在引物的3’末端附近導(dǎo)入目的變異時(shí)，除了變異型的序列，有時(shí)也一起對(duì)未變異的野生型序列進(jìn)行擴(kuò)增。在這樣的情況下，可以將目標(biāo)錯(cuò)配以外的錯(cuò)配用變異型檢測(cè)用引物和野生型檢測(cè)用引物導(dǎo)入相同位置(例如序列號(hào)38、39、41及42的小字所示的堿基)進(jìn)行PCR，得到對(duì)變異型或野生型特異性的擴(kuò)增。

另外，根據(jù)需要，除了作為目標(biāo)的基因用引物，還可以在PCR反應(yīng)液中加入作為PCR內(nèi)標(biāo)物的基因用引物(例如由序列號(hào)43和44所示的堿基序列構(gòu)成)。

需要說(shuō)明的是，在檢測(cè)上述例示的變異以外的變異時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不需要花費(fèi)很多的勞動(dòng)設(shè)計(jì)引物序列，進(jìn)行PCR，檢測(cè)希望的變異。

需要說(shuō)明的是，基因變異的檢測(cè)技術(shù)詳細(xì)地記載于以下文獻(xiàn)：日本專利廳的網(wǎng)站<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0025.html>。另外，基因變異的檢測(cè)和分析方法詳細(xì)地記載于以下文獻(xiàn)：日本專利廳的網(wǎng)站<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0028.html>。或者可以參考文獻(xiàn)：Agarwal et al.(2008)Advances in molecula r marker techniques and their applications in plant sciences.Plant Cell Rep.27:617-631.、Neff et al.(1998)dCAPS,a simple technique for the genet ic analysis of single nucleotide polymorphisms:experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.Plant J.14:387-392.。

因此，本發(fā)明提供用于檢測(cè)eIF(iso)4E基因中的變異的多核苷酸。該變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。其具體例子如〔1.病毒抗性煙草及其制備方法〕項(xiàng)所述。

另外，上述檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式為核酸引物或核酸引物的組。核酸引物的組可以是包夾上述變異的核酸引物的組，也可以是其中之一或兩者包含多核苷酸的核酸引物的組，所述多核苷酸由包含上述變異的連續(xù)的堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。上述檢測(cè)用多核苷酸的另一個(gè)方式是與包含上述變異的連續(xù)的堿基序列或其互補(bǔ)序列雜交的核酸探針。

另外，本發(fā)明提供煙草對(duì)病毒的抗性的判定方法，該方法的特征在于，在煙草的基因組DNA中，將eIF(iso)4E基因中發(fā)生了上述變異作為病毒抗性的指標(biāo)。

另外，本發(fā)明提供煙草對(duì)病毒的抗性的判定試劑盒，其特征在于具備用于檢測(cè)eIF(iso)4E基因中的上述變異的核酸引物的組。

另外，本發(fā)明提供本發(fā)明提供煙草對(duì)病毒的抗性的判定試劑盒，其特征在于具備與eIF(iso)4E基因中包含上述變異的連續(xù)的堿基序列或其互補(bǔ)序列雜交的探針。

另外，本發(fā)明提供病毒抗性煙草的育種方法，該方法的特征在于包括使用上述判定方法篩選對(duì)病毒的抗性的煙草的篩選工序。

另外，本發(fā)明提供病毒抗性煙草篩選方法，該方法的特征在于包括以下工序：在煙草中利用上述檢測(cè)用多核苷酸檢查基因組DNA中有無(wú)上述變異的檢查工序、將該檢查工序中檢測(cè)出上述變異的煙草作為病毒抗性煙草進(jìn)行篩選的篩選工序。利用檢測(cè)用多核苷酸的檢查方法的詳細(xì)情況如上所述。

另外，本發(fā)明提供煙草對(duì)病毒抗性的判定用DNA標(biāo)記物，其特征在于包含由eIF(iso)4E基因中的含有上述變異的連續(xù)的堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成的多核苷酸。

〔4.煙葉及煙草產(chǎn)品〕

栽培本發(fā)明的病毒抗性煙草而生產(chǎn)的煙葉不感染該病毒(例如，打破Virgin A突變體的病毒抗性的PVY毒株或TBTV)所引起的病。因此，特別是在發(fā)生該病的環(huán)境中進(jìn)行栽培的情況下，與栽培沒(méi)有病毒抗性的煙草而生產(chǎn)的煙葉相比，品質(zhì)降低減輕，具有高品質(zhì)。其結(jié)果是能夠生產(chǎn)更高品質(zhì)的煙草產(chǎn)品。

“煙葉”是收獲煙草植物的原葉后使其干燥而得到的，是指成為用于制造煙草產(chǎn)品的原料的葉。“煙草產(chǎn)品”是指紙煙(帶過(guò)濾嘴、無(wú)過(guò)濾嘴)(CIGARETTE)、雪茄(CIGAR)、小雪茄(CIGARILLO)、瑞典口含煙(SNUS)、鼻煙(SNUFF)、嚼煙及電子煙等。

因此，本發(fā)明提供由上述病毒抗性煙草生產(chǎn)的煙葉。

另外，本發(fā)明提供含有上述煙葉作為原料的煙草產(chǎn)品。

〔5.總結(jié)〕

如上所述，為了解決課題，本申請(qǐng)發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，其結(jié)果是首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)在煙草中抑制eIF(iso)4E的功能可以使該煙草對(duì)PVY-breaking毒株和TBTV具有抗性。另外，弄清楚了存在于煙草基因組中的2組eIF(iso)4E基因中的一組與對(duì)PVY-breaking毒株的抗性相關(guān)，另一組與對(duì)TBTV的抗性相關(guān)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制上述單組基因的功能能夠賦予對(duì)各病毒的抗性。另外，確認(rèn)了eIF(iso)4E功能抑制煙草不導(dǎo)致繁殖障礙，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式在翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中具有變異，由此，其特征在于生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)、或者抑制了翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述變異優(yōu)選為無(wú)義變異。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述變異可以是野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子中下述(1)～(4)所示的1個(gè)以上的變異：(1)密碼子CAA的C取代為T、(2)密碼子CGA的C取代為T、(3)密碼子CAG的C取代為T、(4)密碼子TGG的G(2個(gè)G中的任一個(gè)或兩個(gè))取代為A，所述野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子是(a)編碼由序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、(b)編碼與序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、(c)生成由序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、或者(d)生成與序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子，而且編碼功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述變異可以是基因組DNA中由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的下述(1)～(27)所示的1個(gè)以上的變異：(1)第270號(hào)的C取代為T、(2)第295號(hào)的G取代為A、(3)第296號(hào)的G取代為A、(4)第304號(hào)的G取代為A、(5)第305號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第330號(hào)的C取代為T、(8)第343號(hào)的G取代為A、(9)第344號(hào)的G取代為A、(10)第357號(hào)的C取代為T、(11)第394號(hào)的G取代為A、(12)第395號(hào)的G取代為A、(13)第1740號(hào)的C取代為T、(14)第1813號(hào)的G取代為A、(15)第1814號(hào)的G取代為A、(16)第1846號(hào)的G取代為A、(17)第1847號(hào)的G取代為A、(18)第1888號(hào)的G取代為A、(19)第1889號(hào)的G取代為A、(20)第2050號(hào)的C取代為T、(21)第2104號(hào)的C取代為T、(22)第2123號(hào)的G取代為A、(23)第2124號(hào)的G取代為A、(24)第2152號(hào)的C取代為T、(25)第4742號(hào)的G取代為A、(26)第4743號(hào)的G取代為A、(27)第4926號(hào)的C取代為T。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述變異可以是基因組DNA中由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的下述(1)～(26)所示的1個(gè)以上的變異：(1)第264號(hào)的C取代為T、(2)第289號(hào)的G取代為A、(3)第290號(hào)的G取代為A、(4)第298號(hào)的G取代為A、(5)第299號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第328號(hào)的G取代為A、(8)第329號(hào)的G取代為A、(9)第342號(hào)的C取代為T、(10)第379號(hào)的G取代為A、(11)第380號(hào)的G取代為A、(12)第1630號(hào)的C取代為T、(13)第1703號(hào)的G取代為A、(14)第1704號(hào)的G取代為A、(15)第1736號(hào)的G取代為A、(16)第1737號(hào)的G取代為A、(17)第1778號(hào)的G取代為A、(18)第1779號(hào)的G取代為A、(19)第1940號(hào)的C取代為T、(20)第1994號(hào)的C取代為T、(21)第2013號(hào)的G取代為A、(22)第2014號(hào)的G取代為A、(23)第2042號(hào)的C取代為T、(24)第3224號(hào)的G取代為A、(25)第3225號(hào)的G取代為A、(26)第3406號(hào)的C取代為T。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述變異是野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中的1個(gè)以上變異，上述病毒為傘形植物病毒屬屬病毒，所述野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因是(a)編碼由序列號(hào)3所示的氨基酸序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因、(b)編碼與序列號(hào)3所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因、(c)生成由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因、或者(d)生成與序列號(hào)5所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因，而且編碼功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述傘形植物病毒屬屬病毒優(yōu)選為煙草叢頂病毒。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的一個(gè)方式中，上述變異是野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中的1個(gè)以上變異，上述病毒為馬鈴薯Y病毒組屬病毒，所述野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因是(a)編碼由序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因、(b)編碼與序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因、(c)生成由序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因、或者(d)生成與序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因，而且編碼功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

上述馬鈴薯Y病毒組屬病毒優(yōu)選為打破煙草的Virgin A突變體的病毒抗性的毒株，所述毒株是馬鈴薯病毒Y的毒株。

本發(fā)明的病毒抗性煙草的另一個(gè)方式的特征在于翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)量與野生型相比為20％以下。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的另一個(gè)方式中，更優(yōu)選上述表達(dá)量與野生型相比為10％以下。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草的另一個(gè)方式中，可以保持用于抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因表達(dá)的RNAi構(gòu)建物。

本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式的特征在于，通過(guò)將變異導(dǎo)入翻譯起始因子eIF(iso)4E基因來(lái)制備對(duì)病毒具有抗性的煙草，所述變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式中，上述變異優(yōu)選為無(wú)義變異。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式中，優(yōu)選通過(guò)甲磺酸乙酯產(chǎn)生上述變異。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式中，上述變異可以是野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子中下述(1)～(4)所示的1個(gè)以上的變異：(1)密碼子CAA的C取代為T、(2)密碼子CGA的C取代為T、(3)密碼子CAG的C取代為T、(4)密碼子TGG的G(2個(gè)G中的任一個(gè)或兩個(gè))取代為A，所述野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子是(a)編碼由序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、(b)編碼與序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、(c)生成由序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、或者(d)生成與序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子，而且編碼功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式中，上述變異可以是基因組DNA中由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的下述(1)～(27)所示的1個(gè)以上的變異：(1)第270號(hào)的C取代為T、(2)第295號(hào)的G取代為A、(3)第296號(hào)的G取代為A、(4)第304號(hào)的G取代為A、(5)第305號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第330號(hào)的C取代為T、(8)第343號(hào)的G取代為A、(9)第344號(hào)的G取代為A、(10)第357號(hào)的C取代為T、(11)第394號(hào)的G取代為A、(12)第395號(hào)的G取代為A、(13)第1740號(hào)的C取代為T、(14)第1813號(hào)的G取代為A、(15)第1814號(hào)的G取代為A、(16)第1846號(hào)的G取代為A、(17)第1847號(hào)的G取代為A、(18)第1888號(hào)的G取代為A、(19)第1889號(hào)的G取代為A、(20)第2050號(hào)的C取代為T、(21)第2104號(hào)的C取代為T、(22)第2123號(hào)的G取代為A、(23)第2124號(hào)的G取代為A、(24)第2152號(hào)的C取代為T、(25)第4742號(hào)的G取代為A、(26)第4743號(hào)的G取代為A、(27)第4926號(hào)的C取代為T。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的一個(gè)方式中，上述變異可以是基因組DNA中由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的下述(1)～(26)所示的1個(gè)以上的變異：(1)第264號(hào)的C取代為T、(2)第289號(hào)的G取代為A、(3)第290號(hào)的G取代為A、(4)第298號(hào)的G取代為A、(5)第299號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第328號(hào)的G取代為A、(8)第329號(hào)的G取代為A、(9)第342號(hào)的C取代為T、(10)第379號(hào)的G取代為A、(11)第380號(hào)的G取代為A、(12)第1630號(hào)的C取代為T、(13)第1703號(hào)的G取代為A、(14)第1704號(hào)的G取代為A、(15)第1736號(hào)的G取代為A、(16)第1737號(hào)的G取代為A、(17)第1778號(hào)的G取代為A、(18)第1779號(hào)的G取代為A、(19)第1940號(hào)的C取代為T、(20)第1994號(hào)的C取代為T、(21)第2013號(hào)的G取代為A、(22)第2014號(hào)的G取代為A、(23)第2042號(hào)的C取代為T、(24)第3224號(hào)的G取代為A、(25)第3225號(hào)的G取代為A、(26)第3406號(hào)的C取代為T。

本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的另一個(gè)方式的特征在于通過(guò)導(dǎo)入因子來(lái)制備對(duì)病毒具有抗性的煙草，所述因子將翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)量抑制至與野生型相比為20％以下。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的另一個(gè)方式中，更優(yōu)選向煙草中導(dǎo)入使上述表達(dá)量抑制至與野生型相比為10％以下的因子。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法的另一個(gè)方式中，上述因子優(yōu)選為RNAi構(gòu)建物。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法中，上述病毒優(yōu)選為馬鈴薯Y病毒組屬病毒。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法中，上述馬鈴薯Y病毒組屬病毒更優(yōu)選為馬鈴薯病毒Y。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法中，上述馬鈴薯Y病毒組屬病毒更優(yōu)選為打破煙草的Virgin A突變體(VAM煙草)的病毒抗性的毒株，所述毒株是馬鈴薯病毒Y的毒株。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法中，上述病毒優(yōu)選為傘形植物病毒屬屬病毒。

在本發(fā)明的病毒抗性煙草制備方法中，上述傘形植物病毒屬屬病毒更優(yōu)選為煙草叢頂病毒。

本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式是用于檢測(cè)煙草的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中的變異的多核苷酸，其特征在于，該變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。

在本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式中，上述變異優(yōu)選為無(wú)義變異。

在本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式中，上述變異可以是野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子中下述(1)～(4)所示的1個(gè)以上的變異：(1)密碼子CAA的C取代為T、(2)密碼子CGA的C取代為T、(3)密碼子CAG的C取代為T、(4)密碼子TGG的G(2個(gè)G中的任一個(gè)或兩個(gè))取代為A，所述野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子是(a)編碼由序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、(b)編碼與序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有92％以上序列同源性的功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、(c)生成由序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列構(gòu)成的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子、或者(d)生成與序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的堿基序列具有92％以上序列同源性的mRNA的野生型翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的外顯子，而且編碼功能性翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式中，上述變異可以是基因組DNA中由序列號(hào)7所示的堿基序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的下述(1)～(27)所示的1個(gè)以上的變異：(1)第270號(hào)的C取代為T、(2)第295號(hào)的G取代為A、(3)第296號(hào)的G取代為A、(4)第304號(hào)的G取代為A、(5)第305號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第330號(hào)的C取代為T、(8)第343號(hào)的G取代為A、(9)第344號(hào)的G取代為A、(10)第357號(hào)的C取代為T、(11)第394號(hào)的G取代為A、(12)第395號(hào)的G取代為A、(13)第1740號(hào)的C取代為T、(14)第1813號(hào)的G取代為A、(15)第1814號(hào)的G取代為A、(16)第1846號(hào)的G取代為A、(17)第1847號(hào)的G取代為A、(18)第1888號(hào)的G取代為A、(19)第1889號(hào)的G取代為A、(20)第2050號(hào)的C取代為T、(21)第2104號(hào)的C取代為T、(22)第2123號(hào)的G取代為A、(23)第2124號(hào)的G取代為A、(24)第2152號(hào)的C取代為T、(25)第4742號(hào)的G取代為A、(26)第4743號(hào)的G取代為A、(27)第4926號(hào)的C取代為T。

在本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式中，上述變異可以是基因組DNA中由序列號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的下述(1)～(26)所示的1個(gè)以上的變異：(1)第264號(hào)的C取代為T、(2)第289號(hào)的G取代為A、(3)第290號(hào)的G取代為A、(4)第298號(hào)的G取代為A、(5)第299號(hào)的G取代為A、(6)第315號(hào)的C取代為T、(7)第328號(hào)的G取代為A、(8)第329號(hào)的G取代為A、(9)第342號(hào)的C取代為T、(10)第379號(hào)的G取代為A、(11)第380號(hào)的G取代為A、(12)第1630號(hào)的C取代為T、(13)第1703號(hào)的G取代為A、(14)第1704號(hào)的G取代為A、(15)第1736號(hào)的G取代為A、(16)第1737號(hào)的G取代為A、(17)第1778號(hào)的G取代為A、(18)第1779號(hào)的G取代為A、(19)第1940號(hào)的C取代為T、(20)第1994號(hào)的C取代為T、(21)第2013號(hào)的G取代為A、(22)第2014號(hào)的G取代為A、(23)第2042號(hào)的C取代為T、(24)第3224號(hào)的G取代為A、(25)第3225號(hào)的G取代為A、(26)第3406號(hào)的C取代為T。

本發(fā)明的檢測(cè)用多核苷酸的一個(gè)方式是包夾上述變異的核酸引物的組、或者其中之一或兩者包含多核苷酸的核酸引物的組，所述多核苷酸由包夾上述變異的連續(xù)的堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。

本發(fā)明的病毒抗性煙草篩選方法的一個(gè)方式的特征在于包括以下工序：利用權(quán)利要求27～32中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)用多核苷酸檢查在煙草中有無(wú)基因組DNA中的上述變異的檢查工序、以及將在上述檢查工序中檢測(cè)出上述變異的煙草篩選為病毒抗性煙草的篩選工序。

本發(fā)明的煙草對(duì)病毒的抗性的判定用DNA標(biāo)記物的一個(gè)方式的特征在于：包含由翻譯起始因子eIF(iso)4E基因中的含有變異的連續(xù)的堿基序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成的多核苷酸，該變異是生產(chǎn)對(duì)病毒無(wú)功能的翻譯起始因子eIF(iso)4E蛋白質(zhì)的變異、或者是抑制翻譯起始因子eIF(iso)4E基因的表達(dá)的變異。

需要說(shuō)明的是，目前為止，在任意植物中被指出與PVY抗性具有相關(guān)性的是eIF4E，并未公開(kāi)與eIF(iso)4E相關(guān)的信息。雖然有使eIF(iso)4E的表達(dá)量一定程度降低的煙草的報(bào)告，但完全沒(méi)有提及與病毒抗性的相關(guān)性。另外，在煙草中，雖然指出了PVY抗性與eIF4E的相關(guān)性，但另一方面也有馬鈴薯Y病毒組抗性與eIF4E或eIF(iso)4E的變異無(wú)關(guān)的報(bào)告，狀況尚處于混沌狀態(tài)。另外，關(guān)于傘形植物病毒屬屬的病毒，對(duì)其的抗性與翻譯起始因子的相關(guān)性沒(méi)有任何報(bào)告。而且，對(duì)于病毒繁殖所需要的宿主因子而言，由于除了翻譯起始因子以外，如上所述還有DEAD框RNA螺旋酶樣蛋白、VPg相互作用蛋白及翻譯延長(zhǎng)因子等其它多個(gè)候選，而且由于煙草的eIF4E家族中存在多個(gè)基因，因此從其中發(fā)現(xiàn)有效的基因需要很多的勞動(dòng)和時(shí)間，因此處于無(wú)法容易地推測(cè)出與對(duì)PVY-Breaking毒株或TBTV的抗性相關(guān)的煙草基因的狀況。

以下示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。當(dāng)然，本發(fā)明并不限定于以下實(shí)施例，不言而喻，細(xì)節(jié)部分可以是各種方式。另外，本發(fā)明并不限定于上述實(shí)施方式，在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種變更，將各個(gè)公開(kāi)的技術(shù)方法適當(dāng)組合而得到的實(shí)施方式包含于本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。另外，參考并引用本說(shuō)明書中記載的文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容。

實(shí)施例

〔實(shí)施例1〕

(基因的獲得)

進(jìn)行公知數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得煙草(Nicotiana tabacum)的翻譯起始因子eIF4E1(GenBank收錄號(hào)：AY702653)的cDNA堿基序列(序列號(hào)10)及eIF(iso)4E(GenBank收錄號(hào)：AY699609)的cDNA堿基序列(序列號(hào)1)。

根據(jù)使用了GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的WGS(全基因組鳥槍法重疊群)的BLAST分析表明，收錄號(hào)為AY699609的eIF(iso)4E源自于林煙草。另外，作為源自于絨毛狀煙草的煙草(Nicotiana tabacum)eIF(iso)4E，確定了GenBank收錄號(hào)為EB683576(序列號(hào)2)及FN666434兩者。將這些基因或其序列信息供于以下實(shí)驗(yàn)。FN666434是來(lái)自于源自煙草品種Samsun NN的T型eIF(iso)4E基因的序列，與上述的源自煙草品種K326的T型eIF(iso)4E序列(EB683576)的序列同源性為97％。這2個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性(identity)為97％、相似性(similarity)為99％?？梢哉J(rèn)為這些序列的差別是由來(lái)源的品種之間的差異所導(dǎo)致的。另外，S型eIF(iso)4E(AY699609)與T型eIF(iso)4E(EB683576)的DNA的序列同源性為91％。另外，S型eIF(iso)4E的氨基酸序列(序列號(hào)3)與T型eIF(iso)4E的氨基酸序列(序列號(hào)4)的同源性為91％、相似性為96％。需要說(shuō)明的是，序列同源性等的分析使用了核酸/氨基酸序列分析軟件GENETYX(注冊(cè)商標(biāo))(ver.12)(GENETYX公司)。

(RNAi構(gòu)建物的構(gòu)建)

為了制備eIF4E1表達(dá)抑制煙草及eIF(iso)4E表達(dá)抑制煙草，構(gòu)建了以這些基因的內(nèi)部序列作為觸發(fā)器的RNAi構(gòu)建物。

首先，制備了對(duì)eIF4E1的觸發(fā)器序列(序列號(hào)11)及eIF(iso)4E的觸發(fā)器序列(序列號(hào)9)進(jìn)行特異性擴(kuò)增的引物(表1)。在各個(gè)基因的FW引物的5’末端添加用于在后面敘述的克隆中使用的CACC序列。

【表1】

表1：用于克隆翻譯起始因子的RNAi觸發(fā)器序列的引物

使用MagDEA(注冊(cè)商標(biāo))RNA100(GC)(Precision System Science公司)，從煙草幼苗提取RNA并純化。接著。使用PrimeScript^TM RT試劑試劑盒(TAKARA BIO公司)由純化后的RNA合成了cDNA。以該cDNA為模板，使用表1所示的基因特異性引物，對(duì)eIF4E1和eIF(iso)4E的基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增。具體而言，20μL反應(yīng)液中含有模板DNA 10ng、引物各5pmoles，酶使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TAKARA BIO公司)，進(jìn)行了35次1循環(huán)：98℃10秒鐘、55℃15秒鐘、72℃15秒鐘的反應(yīng)。使用MiniElute PCR純化試劑盒(Qiagen公司)對(duì)PCR產(chǎn)物(eIF4E1約320bp、eIF(iso)4E約310bp)進(jìn)行純化，然后克隆至載體pENTR^TM/D-TOPO(注冊(cè)商標(biāo))(Life Technologies公司)。確認(rèn)了插入序列的堿基序列之后，使用GateWay(注冊(cè)商標(biāo))LR Clonase(注冊(cè)商標(biāo))II酶混合物(Life Technologies公司)，將插入序列克隆至RNAi載體pSP231(文獻(xiàn)：參考國(guó)際公開(kāi)第2011/102394號(hào)公報(bào))。pSP231是在pHellsgate 12(文獻(xiàn)：Wesley et al.,2001,Plant J.,27,581-590參照)的SacI部位插入了GFP(綠色熒光蛋白基因)表達(dá)盒的載體，是用花椰菜花葉病毒35SRNA基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)觸發(fā)器序列的反向重復(fù)序列包夾pdk/cat內(nèi)含子的類型的RNAi序列的形式的雙元載體。在克隆于pSP231之后，確認(rèn)RNAi觸發(fā)器序列及其朝向，制成最終的RNAi構(gòu)建物。

通過(guò)電穿孔法將制備的RNAi構(gòu)建物導(dǎo)入土壤桿菌LBA4404株。

(煙草轉(zhuǎn)化)

煙草的轉(zhuǎn)化用通常方法(葉盤法)進(jìn)行。煙草品種使用了Petit Havana SR1。

剪切煙草子葉的四角，使切下的葉在土壤桿菌溶液中浸漬10分鐘。擦拭多余的液體，然后將葉置于LS固體培養(yǎng)基(含有3％蔗糖、0.8％瓊脂)上。在25℃、3天、黑暗下進(jìn)行培養(yǎng)，由此使重組土壤桿菌感染煙草，將各翻譯起始因子的RNAi構(gòu)建物導(dǎo)入SR1。在含有250mg/L的頭孢噻肟和作為植物激素的2-異戊烯腺嘌呤(2iP)(10mg/L)及IAA(0.3mg/L)的LS固體培養(yǎng)基上將葉切片放置4天，對(duì)土壤桿菌進(jìn)行除菌。重組體的篩選在以上述濃度含有頭孢噻肟和植物激素的LS培養(yǎng)基中進(jìn)一步含有50mg/L卡那霉素而得到的培養(yǎng)基上進(jìn)行。將從篩選的重組體再分化而得到苗置于生根培養(yǎng)基(含有1.5％蔗糖、0.3％結(jié)冷膠、以及上述濃度的頭孢噻肟和卡那霉素的LS固體培養(yǎng)基)中使其生根。在溫室培育得到的重組煙草。

(轉(zhuǎn)化初代重組煙草中的翻譯起始因子的轉(zhuǎn)錄分析)

對(duì)于重組煙草，為了研究eIF4E1或eIF(iso)4E基因的表達(dá)，基于各基因的堿基序列設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)PCR用的引物組/探針(表2)。另外，使用Rneasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)從各重組煙草的葉提取了總RNA。使用Prime Script reagent Kit(TAKARA BIO公司)從得到的RNA合成cDNA，作為實(shí)時(shí)PCR的模板。在實(shí)時(shí)PCR中，使用TaqMan Fast Advanced Master mix(Life technologies公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為在50℃2分鐘、95℃20秒鐘之后進(jìn)行40次95℃1秒鐘、60℃20秒鐘的循環(huán)。表達(dá)分析使用StepOne Software v2.2(Life technologies公司)。使用延長(zhǎng)因子(EF1-α)基因作為PCR的內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)與該基因的表達(dá)量相比計(jì)算出靶基因的相對(duì)基因表達(dá)量。使用了非重組煙草(SR1)作為對(duì)照。

【表2】

表2：用于定量PCR的引物和探針

*Y＝C/T

其結(jié)果是，與對(duì)照的表達(dá)量相比，導(dǎo)入了eIF4E1的RNAi構(gòu)建物的煙草eIF4E1基因的轉(zhuǎn)錄物的量、以及導(dǎo)入了eIF(iso)4E的RNAi構(gòu)建物的煙草eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物的量明顯降低。作為在轉(zhuǎn)化初代中轉(zhuǎn)錄抑制程度高的品系，在eIF4E1中選擇#1、#2、#3、#7、#8(各對(duì)照品種SR1的1％、1％、1％、36％、1％的表達(dá)量)這5個(gè)品系，在eIF(iso)4E中選擇、#1、#7、#15(對(duì)照品種SR1的4％、6％、5％的表達(dá)量)這3個(gè)品系。

(轉(zhuǎn)化次代的重組煙草的分離)

將轉(zhuǎn)化初代中轉(zhuǎn)錄抑制程度高的eIF4E1的5個(gè)品系及eIF(iso)4E的3個(gè)品系的種子無(wú)菌地播種于LS固體培養(yǎng)基(含有3％蔗糖、0.8％瓊脂)上。使用Fluor Imager 595(Molecular Dynamics公司)測(cè)定了發(fā)芽、生長(zhǎng)的幼植物體的GFP熒光。如上所述，用于構(gòu)建物導(dǎo)入的pSP231在T-DNA區(qū)域上的RNAi表達(dá)盒相鄰處設(shè)置有35S啟動(dòng)子-GFP表達(dá)盒。在幼植物體中，將發(fā)強(qiáng)GFP熒光的植物判斷為對(duì)RNAi構(gòu)建物的純合品系、將完全沒(méi)有熒光的植物判斷為對(duì)RNAi構(gòu)建物的無(wú)效分離(null segregant)品系(不存在RNAi構(gòu)建物)、將發(fā)弱熒光的植物判斷為對(duì)RNAi構(gòu)建物的半合子品系。將播種后3周的植物轉(zhuǎn)移至溫室，移植至培養(yǎng)土壤中進(jìn)行培育。

(轉(zhuǎn)化次代的重組煙草中的翻譯起始因子的轉(zhuǎn)錄分析)

為了研究各重組煙草品系的次代中的eIF(iso)4E基因的表達(dá)，如上所述從重組煙草的葉提取RNA，合成cDNA，作為實(shí)時(shí)PCR的模板。如上所述進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，使用EF1-α基因作為內(nèi)標(biāo)物，使用非重組煙草(SR1)作為對(duì)照植物。

根據(jù)利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行的eIF(iso)4E的基因表達(dá)分析的結(jié)果(圖1)可以確認(rèn)，eIF(iso)4E表達(dá)抑制品系#1、#7及#15的純合品系的表達(dá)分別被抑制至非重組系統(tǒng)(SR1)的8％、6％、6％左右。另外，在eIF(iso)4E的無(wú)效分離品系的3個(gè)品系中確認(rèn)了未發(fā)生表達(dá)抑制。

(翻譯起始因子的轉(zhuǎn)錄受到抑制的重組煙草植物的病毒接種試驗(yàn))

將PVY(PVY-N)、PVY-B或TBTV(煙草叢頂病毒)接種于移植于培養(yǎng)土壤后10天的個(gè)體。PVY-B是用在日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社煙葉研究所分離的病毒毒株，使PVY抗性的煙草現(xiàn)有品種Virgin A突變體發(fā)生壞疽癥狀的VAM breaking毒株。TBTV是傘形植物病毒屬屬病毒，對(duì)煙草的葉引起斑紋癥狀。接種源使用感染各病毒而發(fā)病的黃色種TSUKUBA(つくば)1號(hào)的患病葉。品種TSUKUBA 1號(hào)是對(duì)PVY、PVY-B及TBTV易感性的品種，通過(guò)接種顯示出明確的病狀。將采集的患病葉在乳缽中與0.01N磷酸鹽緩沖液一起磨碎。使用碳化硅將該磨碎液涂抹接種于移植1周后的煙草苗的最大葉(從下起第4或5片)的半個(gè)葉片。然后，在溫室內(nèi)進(jìn)行栽培，觀察適時(shí)病狀。

其結(jié)果是，關(guān)于eIF4E1功能抑制煙草品系(eIF4E1的#1、#2、#3、#7、#8)，基本上全部個(gè)體中觀察到了PVY及PVY-B兩者的病毒、以及由TBTV引起的發(fā)病，具有與對(duì)照品種和無(wú)效分離品系沒(méi)有差別的敏感性。

將eIF(iso)4E功能抑制煙草的病毒接種試驗(yàn)結(jié)果示于表3。

在PVY-B接種后第7天的病狀評(píng)價(jià)中，對(duì)于eIF(iso)4E功能抑制煙草(eIF(iso)4E的#1、#7、#15)的純合品系而言，3個(gè)品系(共計(jì)9個(gè)個(gè)體)均沒(méi)有觀察到發(fā)病的個(gè)體。確認(rèn)了不具有eIF(iso)4E的RNAi構(gòu)建物的無(wú)效分離品系及對(duì)照品種的SR1的全部個(gè)體發(fā)病。由此可知，eIF(iso)4E功能抑制煙草具有對(duì)PVY-B的抗性?？梢哉J(rèn)為，在eIF(iso)4E功能抑制煙草(eIF(iso)4E的轉(zhuǎn)錄物的量降低的煙草)中病毒的繁殖或細(xì)胞間轉(zhuǎn)移受到阻礙。另一方面，關(guān)于PVY，eIF(iso)4E功能抑制煙草的純合品系雖然在3個(gè)品系9個(gè)個(gè)體中的5個(gè)個(gè)體中觀察到了發(fā)病，但4個(gè)個(gè)體未觀察到發(fā)病。需要說(shuō)明的是，沒(méi)有觀察到任何對(duì)eIF(iso)4E功能抑制煙草的生長(zhǎng)抑制。

在TBTV接種后第9天的病狀評(píng)價(jià)中，對(duì)于eIF(iso)4E功能抑制煙草系(eIF(iso)4E的#1、#7、#15)的純合系統(tǒng)而言，3個(gè)系統(tǒng)(共計(jì)9個(gè)個(gè)體)均沒(méi)有觀察到發(fā)病的個(gè)體。另一方面，確認(rèn)了不具有eIF(iso)4E的RNAi構(gòu)建物的無(wú)效分離品系及對(duì)照品種的SR1的全部個(gè)體發(fā)病。由此可知，eIF(iso)4E功能抑制煙草具有對(duì)TBTV的抗性。

以上結(jié)果表明，通過(guò)抑制煙草的翻譯起始因子eIF(iso)4E的功能，能夠賦予對(duì)PVY-B及TBTV的抗性。

[表3]

表3：對(duì)翻譯起始因子的轉(zhuǎn)錄受到抑制的重組煙草的病毒接種試驗(yàn)結(jié)果

〔實(shí)施例2〕

(eIF(iso)4E煙草突變體的篩選)

使用S型eIF(iso)4E(AY699609)和T型eIF(iso)4E(EB683576)的mRNA序列檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的煙草的全基因組鳥槍法重疊群，結(jié)果可以獲得在內(nèi)含子區(qū)域以外的蛋白編碼區(qū)域中顯示出100％序列同源性的基因組序列(S型的收錄號(hào)為AWOJ01412288、T型的收錄號(hào)為AWOJ01054542)。在這些序列中，將eIF(iso)4E基因部分的序列示于序列號(hào)7(S型eIF(iso)4E基因的基因組序列)和序列號(hào)8(T型eIF(iso)4E基因的基因組序列)。兩個(gè)序列是源自煙草品種K326的基因組序列。

另外，弄清楚了eIF(iso)4E基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。圖2示出了S型eIF(iso)4E基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的示意圖。圖3示出了T型eIF(iso)4E基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的示意圖。需要說(shuō)明的是，在圖2及圖3中，記載于下部的數(shù)字表示可以通過(guò)利用EMS處理產(chǎn)生的由G至A的變異或由C至T的變異而發(fā)生的無(wú)義變異的候選部位的數(shù)量，箭頭表示實(shí)施例中的引物的位置。對(duì)于通過(guò)利用EMS處理產(chǎn)生的由G至A的變異或由C至T的變異能夠形成終止密碼子的堿基而言，在S型eIF(iso)4E的情況下，第1外顯子中為12個(gè)(序列號(hào)7的第270號(hào)的C、第295號(hào)的G、第296號(hào)的G、第304號(hào)的G、第305號(hào)的G、第315號(hào)的C、第330號(hào)的C、第343號(hào)的G、第344號(hào)的G、第357號(hào)的C、第394號(hào)的G、第395號(hào)的G)，第2外顯子中為7個(gè)(第1740號(hào)的C、第1813號(hào)的G、第1814號(hào)的G、第1846號(hào)的G、第1847號(hào)的G、第1888號(hào)的G、第1889號(hào)的G)，第3外顯子中為5個(gè)(第2050號(hào)的C、第2104號(hào)的C、第2123號(hào)的G、第2124號(hào)的G、第2152號(hào)的C)，第4外顯子中為2個(gè)(第4742號(hào)的G、第4743號(hào)的G)，第5外顯子中為1個(gè)(第4926號(hào)的C)。

另一方面，在T型eIF(iso)4E的情況下，第1外顯子中為11個(gè)(序列號(hào)8的第264號(hào)的C、第289號(hào)的G、第290號(hào)的G、第298號(hào)的G、第299號(hào)的G、第315號(hào)的C、第328號(hào)的G、第329號(hào)的G、第342號(hào)的C、第379號(hào)的G、第380號(hào)的G)，第2外顯子中為7個(gè)(第1630號(hào)的C、第1703號(hào)的G、第1704號(hào)的G、第1736號(hào)的G、第1737號(hào)的G、第1778號(hào)的G、第1779號(hào)的G)，第3外顯子中為5個(gè)(第1940號(hào)的C、第1994號(hào)的C、第2013號(hào)的G、第2014號(hào)的G、第2042號(hào)的C)，第4外顯子中為2個(gè)(第3224號(hào)的G、第3225號(hào)的G)，第5外顯子中為1個(gè)(第3406號(hào)的C)。

對(duì)第1外顯子、第2外顯子及第3外顯子設(shè)計(jì)了對(duì)包含外顯子和外顯子/內(nèi)含子邊界部位的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的引物(表4)。需要說(shuō)明的是，表中“S型eIF(iso)4E”是指源自林煙草的eIF(iso)4E(煙草序列)，“T型eIF(iso)4E”是指源自絨毛狀煙草的eIF(iso)4E(煙草序列)。

【表4】

表4：用于煙草突變體篩選的引物

實(shí)施PCR，確認(rèn)了產(chǎn)物的堿基序列。使用煙草(品種TSUKUBA 1號(hào))基因組5ng，在20μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行了PCR。酶使用Tks Gflex^TM DNA聚合酶(TAKARA BIO公司)。反應(yīng)在94℃2分鐘之后進(jìn)行40次94℃30秒鐘、60℃30秒鐘、72℃1分30秒的循環(huán)。其結(jié)果是可以僅得到希望長(zhǎng)度的產(chǎn)物，能夠確認(rèn)堿基序列。即，使用上述引物從煙草基因組成功地進(jìn)行了S型特異性和T型特異性的eIF(iso)4E基因區(qū)域的擴(kuò)增。

從具有利用EMS處理的變異的個(gè)體提取基因組DNA，通過(guò)使用了上述引物的PCR對(duì)S型特異性和T型特異性的eIF(iso)4E基因區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，對(duì)在第1外顯子、第2外顯子或第3外顯子內(nèi)生成了終止密碼子的eIF(iso)4E煙草突變體進(jìn)行篩選。

具體而言，按照田島等(文獻(xiàn)：平成23年度日本植物病理學(xué)會(huì)大會(huì)、P234、"Production of panel of tobacco mutants"(煙草突變體實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合的制備))對(duì)制備的煙草突變體實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行了篩選。該實(shí)驗(yàn)對(duì)象集合由以下的組構(gòu)成：對(duì)煙草品種TSUKUBA 1號(hào)的種子(數(shù)千個(gè))以變異原處理的形式進(jìn)行EMS處理，由每個(gè)培育而成的個(gè)體(M1代)得到的突變體自身繁殖后代種子(M2混合種子)的組、播種這些M2種子并從培育而成的各品系8個(gè)個(gè)體的幼苗提取出的混合DNA的組。

(eIF(iso)4E基因的S型突變體的篩選)

以上述DNA樣品(1974品系的DNA樣品)作為模板，使用表4的引物中S型eIF(iso)4E-Exon 1組合1(序列號(hào)25和26)及S型eIF(iso)4E-Exon 2&3組合1(序列號(hào)28和29)進(jìn)行了PCR。確定了得到的PCR產(chǎn)物的堿基序列，結(jié)果是在外顯子1中58個(gè)樣品(50個(gè)部位)中檢測(cè)出變異，在外顯子2和外顯子3中共計(jì)58個(gè)樣品(45個(gè)部位)中檢測(cè)出變異。變異均為雜合的。檢測(cè)出無(wú)義變異(產(chǎn)生終止密碼子的變異)的樣品在外顯子1中為4個(gè)樣品(序列號(hào)7的第295、394或395號(hào)的G變異為A、第330號(hào)的C變異為T)，在外顯子2和外顯子3中為1個(gè)樣品(序列號(hào)7的第1814號(hào)的G變異為A)。其中，播種第330號(hào)的C變異為T的品系(M2)，從24個(gè)個(gè)體提取DNA，確定了堿基序列，結(jié)果是得到了11個(gè)個(gè)體的以純合方式具有目標(biāo)變異的個(gè)體(eIF(iso)4E＿S型變異純合個(gè)體)。

(eIF(iso)4E基因的T型突變體的篩選)

以上述DNA樣品(1974品系的DNA樣品)為模板，使用表4的引物中T型eIF(iso)4E-Exon 1組合1(序列號(hào)31和32)及T型eIF(iso)4E-Exon 2&3組合2(序列號(hào)34和36)進(jìn)行了PCR。與上述同樣地確定了得到的PCR產(chǎn)物的堿基序列，結(jié)果是在外顯子1中43樣品(38個(gè)部位)中檢測(cè)出變異，在外顯子2和外顯子3中共計(jì)66樣品(55個(gè)部位)中檢測(cè)出變異。變異均為雜合的。檢測(cè)出無(wú)義變異的樣品在外顯子1中為5個(gè)樣品(序列號(hào)8的第289、299、328、329或380號(hào)的G變異為A)、在外顯子2和外顯子3中為4個(gè)樣品(序列號(hào)8的第1704號(hào)的G變異為A的有3個(gè)、第1737的G變異為A的有1個(gè))。其中，對(duì)于第299號(hào)的G變異為A的品系(M2)，從24個(gè)個(gè)體提取DNA，確定了堿基序列，結(jié)果是得到了8個(gè)個(gè)體的以純合方式具有目標(biāo)變異的個(gè)體(eIF(iso)4E＿T型變異純合個(gè)體)。

(eIF(iso)4E＿ST雙純合突變體的培育和篩選)

使上述eIF(iso)4E＿S型變異純合個(gè)體與eIF(iso)4E＿T型變異純合個(gè)體交配。通過(guò)該交配，制備了在S型eIF(iso)4E的基因座和T型eIF(iso)4E的基因座兩者中以雜合接合方式保持有野生型(無(wú)變異)與變異型的F1系統(tǒng)。使F1系自身受粉(自身繁殖)，得到了F2系統(tǒng)。在該F2系中，對(duì)于S型和T型兩者，以純合方式具有變異的個(gè)體的比例的理論值為1/16。播種F2系統(tǒng)，從700個(gè)個(gè)體提取了DNA。

DNA提取如下所述進(jìn)行。將煙草葉樣品(1cm×1cm)放入2mL管中，加入400μL提取液(組成為200mM Tris-HCl(pH7.5)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)和200μL的蛋白質(zhì)沉淀溶液(QIAGEN公司制)，然后加入金屬錐進(jìn)行破碎，以13000rpm離心分離10分鐘。將上清液300μL轉(zhuǎn)移至新的1.5mL管中，加入800μL的100％乙醇翻轉(zhuǎn)混和。以15000rpm離心分離10分鐘，然后完全除去上清液。確認(rèn)了顆粒干燥之后，加入TE(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA)50μL。

設(shè)計(jì)了ASP(等位基因特異性引物)標(biāo)記物作為PCR用標(biāo)記物。ASP標(biāo)記物是利用了下述性質(zhì)的標(biāo)記物，即，設(shè)計(jì)在引物序列的3’末端側(cè)設(shè)置了單核苷酸多態(tài)性(SNP)的引物，僅能夠從具有特定多態(tài)性的樣品中得到PCR產(chǎn)物，而由于錯(cuò)配從除此以外的樣品中無(wú)法得到PCR產(chǎn)物。制備的引物如表5所示。

【表5】

表5：用于煙草突變體篩選的ASP標(biāo)記物的引物

*小寫字母指示引起與靶模板DNA的錯(cuò)配的堿基。

首先，制備了用于檢測(cè)未產(chǎn)生變異的野生型(WT)eIF(iso)4E基因的引物混合物。組成為eIF(iso)4E＿S＿WT的F和R各10μM、eIF(iso)4E＿T＿WT的F和R各10μM、Nia2基因(對(duì)照，文獻(xiàn)：Vincentz and Caboche(1991)Constitutive expression of nitrate reductase allows normal growth and development of Nicotiana plumbaginifolia plants.EMBO J.10:1027-1035.)的F和R各1μM。接著，制備變異型(Mut)的eIF(iso)4E基因檢測(cè)用引物混合物。組成為eIF(iso)4E＿S＿M(jìn)ut的F和R各10μM、eIF(iso)4E＿T＿M(jìn)ut的F和R各10μM、Nia2基因(對(duì)照)的F和R各1μM。將這些引物混合物分別供于野生型(WT)eIF(iso)4E基因檢測(cè)用的PCR和變異型(Mut)eIF(iso)4E基因檢測(cè)用的PCR。PCR條件如下所述。將調(diào)節(jié)為5ng/μL的DNA溶液1μL、WT或Mut檢測(cè)用引物混合物1μL、滅菌水3μL、Multiplex PCR 2×Master Mix(QIAGEN公司)5μL進(jìn)行混合，在10μL的體系中進(jìn)行了PCR。PCR進(jìn)行1次95℃15分鐘，進(jìn)行40次94℃30秒鐘、59℃1分30秒及72℃1分鐘的循環(huán)，進(jìn)行1次72℃10分鐘。用QIAxcel(Qiagen公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，進(jìn)行檢測(cè)。

將結(jié)果的一部分示于圖4。首先確認(rèn)了作為對(duì)照使用的Nia2基因的擴(kuò)增(圖4的上部的441bp條帶)。對(duì)于野生型的WT檢測(cè)用引物混合物而言，在S型和T型兩者中檢測(cè)WT，對(duì)于變異型的Mut檢測(cè)用引物混合物而言，在S型和T型兩者中檢測(cè)Mut。因此，變異的類型根據(jù)WT和Mut兩者的結(jié)果來(lái)判斷。例如，在eIF(iso)4E＿S＿WT引物中未觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，在eIF(iso)4E＿T＿WT中檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物，而且在eIF(iso)4E＿S＿M(jìn)ut中檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物，在eIF(iso)4E＿T＿M(jìn)ut中未檢測(cè)出的情況下，判斷為僅S型為變異型的基因型ssTT。另外例如，在2個(gè)WT引物中均未檢測(cè)到PCR產(chǎn)物，在2個(gè)Mut引物中均檢測(cè)出PCR產(chǎn)物的情況下，判斷為S型和T型兩者為變異型的基因型sstt。需要說(shuō)明的是，可以認(rèn)為圖4右端的泳道(Mut檢測(cè)用、SSTT)中觀察到的偽帶(feint band)是人工制品。

由此，從F2系中通過(guò)使用了DNA標(biāo)記物的多態(tài)性分析得到了eIF(iso)4E＿ST雙純合突變體(S/T兩型變異型純合個(gè)體，基因型為sstt)及對(duì)照的eIF(iso)4E＿野生型個(gè)體(S/T兩型野生型個(gè)體，基因型為SSTT)。對(duì)篩選的個(gè)體的PCR產(chǎn)物的DNA序列進(jìn)行解讀，確認(rèn)變異，確認(rèn)了DNA標(biāo)記物篩選的結(jié)果是正確的。

(eIF(iso)4E＿S型突變體和eIF(iso)4E＿T型突變體的增殖)

培育上述eIF(iso)4E＿S型突變體(S型eIF(iso)4E基因中具有純合型變異?；蛐蜑閟sTT)或eIF(iso)4E＿T型突變體(T型eIF(iso)4E基因中具有純合型變異?；蛐蜑镾Stt)，得到自身繁殖后代，由此進(jìn)行種子的增殖。對(duì)于得到的后代種子，培育一部分，如上所述提取DNA，實(shí)施使用了DNA標(biāo)記物的多態(tài)性分析，確認(rèn)了分別以純合方式具有S型或T型的變異。

需要說(shuō)明的是，確認(rèn)了變異的這些種子以eIF(iso)4E＿S型突變體為NtS1、eIF(iso)4E＿T型突變體為NtT1的方式保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利生物保藏中心(獨(dú)立行政法人製品評(píng)価技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)特許生物寄託センター；International Patent Organisms Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation)(日本千葉縣木更津市かずさ鐮足2-5-8-1 120號(hào)室；日本國(guó)千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8-1 120號(hào)室；2-5-8-1,120,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。保藏編號(hào)分別為FERM BP-22284(保藏日：2015年2月25日)和FERM BP-22285(保藏日：2015年2月25日)。

(識(shí)別突變體的基因型的dCAPS標(biāo)記物的開(kāi)發(fā))

作為用于檢測(cè)eIF(iso)4E基因的多態(tài)性的檢測(cè)可靠性更高的DNA標(biāo)記物，開(kāi)發(fā)了dCAPS標(biāo)記物。在限制酶的識(shí)別序列存在多態(tài)性的情況下，可以通過(guò)檢測(cè)限制酶處理后的片段長(zhǎng)度的差異來(lái)判斷多態(tài)性，將其稱為CAPS標(biāo)記物、PCR-RFLP標(biāo)記物。在eIF(iso)4E基因中產(chǎn)生的本次變異(在S型中序列號(hào)7的第330號(hào)的C變異為T，在T型中序列號(hào)8的第299號(hào)的G變異為A)的情況下，SNP附近的序列不包含限制酶的識(shí)別序列。因此，在設(shè)計(jì)PCR中使用的引物時(shí)，在SNP(單核苷酸多態(tài)性)附近人為地導(dǎo)入限制酶位點(diǎn)。對(duì)于本次利用的變異而言，在變異型基因中，為了成為限制位點(diǎn)(在S型中Nla III：CATG，在T型中Mbo I：GATC)，需要兩個(gè)堿基的變異，另一方面，在野生型基因中，為了成為限制位點(diǎn)，一個(gè)堿基的變異即可。因此，在本實(shí)施例中，通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)堿基變異，制備了在野生型中被限制酶切斷而在變異型中不被切斷的dCAPS標(biāo)記物。另外，在該情況下，片段長(zhǎng)度的差異以引物長(zhǎng)度之差的方式進(jìn)行檢測(cè)。制備的引物如表6所示。

例如，在序列號(hào)46的情況下，3’末端側(cè)的CaT的下一個(gè)堿基在野生型模板DNA中為G，成為Nla III部位(CATG)，但在變異型模板DNA中為A，不形成限制位點(diǎn)。另外，在序列號(hào)48的情況下，3’末端側(cè)的Gat的下一個(gè)堿基在野生型模板DNA中為C，成為Mbo I部位(GATC)，但在變異型模板DNA中為T，不形成限制位點(diǎn)。

在引物的3’末端附近導(dǎo)入了錯(cuò)配的情況下，使用具有校對(duì)活性的DNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，引物的錯(cuò)配被改正，有可能無(wú)法用限制酶切斷。實(shí)際上，使用具有校對(duì)的Tks GflexTM DNA聚合酶(TAKARA BIO公司制)以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，在進(jìn)行了限制酶處理的產(chǎn)物中未檢測(cè)到多態(tài)性。另一方面，在使用不具有校對(duì)活性的TaKaRa TaqTM(TAKARA BIO公司)以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的情況下，無(wú)法獲得充分的擴(kuò)增。因此，進(jìn)行nested PCR，通過(guò)使用了Tks GflexTM DNA聚合酶(具有校對(duì)功能)的1st PCR對(duì)包含SNP區(qū)域的附近區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后通過(guò)使用了TaKaRa TaqTM(不具有校對(duì)功能)的2nd PCR制備了限制酶的識(shí)別部位。

【表6】

用于煙草突變體篩選的dCAPS標(biāo)記物的引物

對(duì)2nd PCR的引物設(shè)計(jì)了錯(cuò)配，使得對(duì)于eIF(iso)4E＿S而言，僅在包含野生型SNP時(shí)被限制酶Nla III切斷，另外，對(duì)于eIF(iso)4E＿T而言，僅在包含野生型SNP時(shí)被限酶Mbo I切斷。

首先，使用Tks GflexTM DNA聚合酶進(jìn)行了1st PCR。以約5ng基因組DNA作為模板，制備為引物濃度1μM，使用添加了酶的緩沖液。PCR進(jìn)行1次94℃1分鐘，30次98℃10秒鐘、60℃15秒鐘及68℃30秒鐘的循環(huán)，1次68℃90秒鐘。然后，將1st PCR產(chǎn)物稀釋至100倍，以1μL作為模板用TaKaRa TaqTM進(jìn)行了2nd PCR。與1st PCR一樣地制備為引物濃度1μM，使用添加了酶的緩沖液。PCR進(jìn)行1次94℃2分鐘，40次94℃30秒鐘、52℃30秒鐘及72℃30秒鐘的循環(huán)，1次72℃90秒鐘。用Nla III(New England Biolabs公司)對(duì)eIF(iso)4E＿S的2nd PCR產(chǎn)物進(jìn)行了處理。用Mbo I(TAKARA BIO公司)對(duì)eIF(iso)4E＿T的2nd PCR產(chǎn)物進(jìn)行了處理。

將結(jié)果示于圖5。在對(duì)用eIF(iso)4E＿S引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行了限制酶處理的情況下，可以將未觀察到切斷的樣品的基因型判斷為ss，在對(duì)用eIF(iso)4E＿T引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行了限制酶處理的情況下，可以將未觀察到切斷的樣品的基因型判斷為tt。可以容易地進(jìn)行如下判斷：例如，用eIF(iso)4E＿S引物未發(fā)生切斷且用eIF(iso)4E＿T引物發(fā)生了切斷的樣品的基因型為ssTT，用eIF(iso)4E＿S引物發(fā)生切斷且用eIF(iso)4E＿T引物未發(fā)生切斷的樣品的基因型為SStt，兩種引物均發(fā)生了切斷的樣品的基因型為SSTT，兩種引物均未發(fā)生切斷的樣品的基因型為sstt，出現(xiàn)兩種引物均發(fā)生了切斷的情況和未發(fā)生切斷的情況的樣品的基因型為SsTt。因此，本dCAPS標(biāo)記物也與上述ASP標(biāo)記物一樣地顯示出能夠充分用于煙草eIF(iso)4E基因中發(fā)生了變異的個(gè)體的基因型的識(shí)別的性質(zhì)。

(eIF(iso)4E煙草突變體的表達(dá)分析)

對(duì)各種eIF(iso)4E煙草突變體進(jìn)行了eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄分析。與上述同樣地從通過(guò)DNA標(biāo)記物篩選的eIF(iso)4E＿S型突變體(ssTT)、eIF(iso)4E＿T型突變體(SStt)、eIF(iso)4E＿ST雙純合突變體(sstt)及eIF(iso)4E＿野生型系統(tǒng)(SSTT)中提取RNA，合成cDNA，進(jìn)行了定量PCR。引物/探針組在S型eIF(iso)4E基因用的情況下使用了表2所示的序列號(hào)19、20及21。另外，在T型eIF(iso)4E基因用的情況下，新設(shè)計(jì)表6所示的序列號(hào)49、50及51供于實(shí)驗(yàn)。

【表7】

表7：用于T型eIF(iso)4E基因的定量PCR的引物組和探針

將測(cè)定結(jié)果示于圖6。在圖6中，以將基因型為SSTT的品系的轉(zhuǎn)錄物的量的平均值設(shè)為1時(shí)的相對(duì)表達(dá)量表示eIF(iso)4E基因的表達(dá)量。橫軸表示各突變體的基因型，用括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示示分析個(gè)體數(shù)?？v軸表示具有各基因型的品系中的轉(zhuǎn)錄物量的相對(duì)平均值，直線表示標(biāo)準(zhǔn)差。在基因型為SStt的品系中S型eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物的量為對(duì)照的73％，而完全未檢測(cè)到T型eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物。另一方面，在ssTT中，T型eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物的量為對(duì)照的73％，而S型eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物的蓄積減少至對(duì)照的8.0％。另外，在sstt中，完全未檢測(cè)到T型eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物，S型eIF(iso)4E基因的轉(zhuǎn)錄物的量也減少至對(duì)照的8.3％。以上的結(jié)果表明，在SStt中T型eIF(iso)4E基因的表達(dá)特異性地受到抑制，在ssTT中S型eIF(iso)4E基因的表達(dá)特異性地受到抑制，另外，在sstt中S型和T型eIF(iso)4E兩個(gè)基因的表達(dá)均受到抑制。

需要說(shuō)明的是，作為通過(guò)無(wú)義變異而使轉(zhuǎn)錄受到抑制的原因，可以考慮無(wú)義介導(dǎo)的mRNA衰變(NMD)(文獻(xiàn)：Baker and Parker 2004、Current Opinion in Cell Biology 16:293-299)。

(對(duì)eIF(iso)4E煙草突變體的病毒接種試驗(yàn))

向移植于培養(yǎng)土壤后2周的個(gè)體接種PVY-B(馬鈴薯病毒Y的VAM breaking系統(tǒng))或TBTV(煙草叢頂病毒)。病毒接種源的制備及對(duì)煙草的接種方法用與實(shí)施例1相同的方法實(shí)施。接種后，在溫室內(nèi)進(jìn)行栽培，在合適的時(shí)間時(shí)觀察適當(dāng)病狀。將eIF(iso)4E功能缺失突變體煙草的病毒接種試驗(yàn)結(jié)果示于表8和表9。

在PVY-B接種后第10天和之前的病狀評(píng)價(jià)中，在eIF(iso)4E＿ST雙純合突變體系統(tǒng)(ST兩型變異型純合系統(tǒng)，基因型為sstt)中沒(méi)有觀察到發(fā)病的個(gè)體。另一方面，在PVY-B接種后第8天的病狀評(píng)價(jià)中，eIF(iso)4E＿野生型系統(tǒng)(ST兩型野生型純合系統(tǒng)，基因型為SSTT)和栽培品種TN90在全部個(gè)體中確認(rèn)到了發(fā)病。由此表明，S型和T型兩者eIF(iso)4E功能缺失突變體煙草具有對(duì)PVY-B的抗性。另外，對(duì)于僅使T型eIF(iso)4E功能缺失的系統(tǒng)(eIF(iso)4E＿T型突變體系統(tǒng)，對(duì)于T型eIF(iso)4E基因純合型變異?；蛐蜑镾Stt)而言，在PVY-B接種后第10天和之前的病狀評(píng)價(jià)中，與eIF(iso)4E＿野生型系統(tǒng)、栽培品種TN90及僅使S型eIF(iso)4E功能缺失的系統(tǒng)(eIF(iso)4E＿S型突變體系，對(duì)于S型eIF(iso)4E基因具有純合型的變異?；蛐蜑閟sTT)相比，大幅抑制了發(fā)病。由此可以推測(cè)，PVY-B主要在其繁殖、細(xì)胞間轉(zhuǎn)移等病狀表現(xiàn)中利用T型eIF(iso)4E，可以認(rèn)為發(fā)病抑制能夠通過(guò)抑制T型eIF(iso)4E的表達(dá)來(lái)進(jìn)行。

在對(duì)TBTV接種后第12天和之前的病狀評(píng)價(jià)中，eIF(iso)4E＿ST雙純合突變體系(sstt)中沒(méi)有觀察到發(fā)病的個(gè)體。另一方面，在TBTV接種后第10天的病狀評(píng)價(jià)中，eIF(iso)4E＿野生型系(SSTT)和栽培品種TN90在半數(shù)以上的個(gè)體中確認(rèn)到了發(fā)病。由此表明，S型和T型eIF(iso)4E功能缺失突變體煙草具有對(duì)TBTV的抗性。另外，僅使S型eIF(iso)4E功能缺失的品系(eIF(iso)4E＿S型突變體系，ssTT)與eIF(iso)4E＿野生型系(SSTT)、栽培品種TN90及僅使T型eIF(iso)4E功能缺失的系統(tǒng)(eIF(iso)4E＿T型突變體系統(tǒng)，SStt)相比，大幅抑制了發(fā)病。由此可以推測(cè)，TBTV主要在其繁殖、細(xì)胞間轉(zhuǎn)移等病狀表現(xiàn)中利用S型eIF(iso)4E，可以認(rèn)為發(fā)病抑制能夠通過(guò)抑制S型eIF(iso)4E的表達(dá)來(lái)進(jìn)行。

需要說(shuō)明的是，完全未觀察到對(duì)eIF(iso)4E功能抑制煙草的生長(zhǎng)抑制。

以上結(jié)果表明，為了賦予PVY-B抗性，只要抑制煙草的翻譯起始因子eIF(iso)4E的功能即可，另外表明，可以僅抑制T型eIF(iso)4E。另外，為了賦予TBTV抗性，只要抑制煙草的翻譯起始因子eIF(iso)4E的功能即可，另外表明，可以僅抑制S型eIF(iso)4E。

【表8】

表8：eIF(iso)4E功能缺乏煙草突變體上的PVY-B接種測(cè)試的結(jié)果

【表9】

表9：表8：eIF(iso)4E功能缺乏煙草突變體上的TBTV接種測(cè)試的結(jié)果

工業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明可以用于煙草的育種。

保藏編號(hào)

FERM BP-22284

FERM BP-22285

序列表

<110> 日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社(JAPAN TOBACCO INC.)

<120> 病毒抗性煙草及其制備方法

<130> NTF15-0027

<140> PCT/JP2015/068713

<141> 2015-06-29

<150> JP 2014-133378

<151> 2014-06-27

<150> JP 2014-194424

<151> 2014-09-24

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 867

<212> DNA

<213> 煙草

<400> 1

tccattacgc ctctccgttc gctaaaaatc gacacaaagg gaggagagga ttttttgagg 60

caaaaatcaa tggccactga agcaccgata gaggcgacgg aggttccgcc ggcgtcagcg 120

acggagacgg tggcgaagca gccacataag ctagagagga gatggacatt ctggttcgat 180

aatcaatcta agccgaaaca aggagccgct tggggaagtt ctcttcgaaa agcttatact 240

ttcgaaactg ttgaggaatt ctggagttta tatgatcaga tattcaagcc cagcaagttg 300

actgctaatg cggactttca tttgttcaaa gctgggattg agcccaaatg ggaagatcct 360

gagtgtgcta gtggtggcaa gtggactgtt acgagcagca gaaaggctaa tcttgagact 420

atgtggcttg aaactctgat ggcattggtc ggtgagcagt ttgatgagtc agaggagata 480

tgtggagtgg ttgccagtgt acgtcggagt caggataaac tttccttatg gactaagact 540

gcctccaatg aagcaattca gatgagcatt ggtaggaagt ggaaggagat cattgatgct 600

gaaaaaatat cctatagttt ccatgatgac tctaaaaggg aaaggtcagc taagagtcga 660

tatactgtgt gaattccttt attgtgtggg attgacactg gtccctagat tttccaatac 720

tgaaaattgt acgattagca cagttttgcg cttgtctgct gcaaaatttt gattttcttt 780

ttaaatttat tcgcacttga tatggatctt tggatgtatt gtgttaaaga ttttgtttgg 840

ttctgtgtta aaaaaaaaaa aaaaaaa 867

<210> 2

<211> 805

<212> DNA

<213> 煙草

<400> 2

gacacaaaag ggagaggatt ttttgaggca aaatcaatgg ccactgaagc accgatagag 60

gcgacggagg ttctgccggc gccggatacg gtggagaagc agccgcataa gctagagagg 120

agatggacat tctggttcga taagccgaag caaggcgctg tttgggcaag tgctcttcga 180

aaagcctata ctttcgaaac tgttgaggaa ttctggagtt tatatgatca gatattcaag 240

cccagcaagt tgactgctaa tgcggacttt catttgttca aagctgggat tgagcccaaa 300

tgggaagatc ctgagtgtgc caatggtggc aagtggactg tcacgagcag cagaaaggct 360

aatcttgaga ctatgtggct tgaaactctg atggcattgg tgggtgagca atttgatgaa 420

tcagaagaga tatgtggagt ggttgccagt gttcgtcgga gtcaggataa actttccttg 480

tggactagga ctgcctccaa tgaagcagct cagatgagca ttggtaggaa gtggaaggag 540

atcatcgatg ctgaaaaaat atcctatagt ttccatgatg actctaaaaa ggaaaggtca 600

gttaagagtc gatatactgt gtgaattccc ttattgtgtg ggattgacac cggtccctaa 660

gtttactgaa aattgtacga ttagcattag tttgcgcttg tctgctgcaa attttgattt 720

tcttgaaatt tattcgtact tgatatgtat ctttggatgt attgtgttaa agattttgtt 780

tgcttctttg ttacttgaaa aaaaa 805

<210> 3

<211> 200

<212> PRT

<213> 煙草

<400> 3

Met Ala Thr Glu Ala Pro Ile Glu Ala Thr Glu Val Pro Pro Ala Ser

1 5 10 15

Ala Thr Glu Thr Val Ala Lys Gln Pro His Lys Leu Glu Arg Arg Trp

20 25 30

Thr Phe Trp Phe Asp Asn Gln Ser Lys Pro Lys Gln Gly Ala Ala Trp

35 40 45

Gly Ser Ser Leu Arg Lys Ala Tyr Thr Phe Glu Thr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Trp Ser Leu Tyr Asp Gln Ile Phe Lys Pro Ser Lys Leu Thr Ala Asn

65 70 75 80

Ala Asp Phe His Leu Phe Lys Ala Gly Ile Glu Pro Lys Trp Glu Asp

85 90 95

Pro Glu Cys Ala Ser Gly Gly Lys Trp Thr Val Thr Ser Ser Arg Lys

100 105 110

Ala Asn Leu Glu Thr Met Trp Leu Glu Thr Leu Met Ala Leu Val Gly

115 120 125

Glu Gln Phe Asp Glu Ser Glu Glu Ile Cys Gly Val Val Ala Ser Val

130 135 140

Arg Arg Ser Gln Asp Lys Leu Ser Leu Trp Thr Lys Thr Ala Ser Asn

145 150 155 160

Glu Ala Ile Gln Met Ser Ile Gly Arg Lys Trp Lys Glu Ile Ile Asp

165 170 175

Ala Glu Lys Ile Ser Tyr Ser Phe His Asp Asp Ser Lys Arg Glu Arg

180 185 190

Ser Ala Lys Ser Arg Tyr Thr Val

195 200

<210> 4

<211> 195

<212> PRT

<213> 煙草

<400> 4

Met Ala Thr Glu Ala Pro Ile Glu Ala Thr Glu Val Leu Pro Ala Pro

1 5 10 15

Asp Thr Val Glu Lys Gln Pro His Lys Leu Glu Arg Arg Trp Thr Phe

20 25 30

Trp Phe Asp Lys Pro Lys Gln Gly Ala Val Trp Ala Ser Ala Leu Arg

35 40 45

Lys Ala Tyr Thr Phe Glu Thr Val Glu Glu Phe Trp Ser Leu Tyr Asp

50 55 60

Gln Ile Phe Lys Pro Ser Lys Leu Thr Ala Asn Ala Asp Phe His Leu

65 70 75 80

Phe Lys Ala Gly Ile Glu Pro Lys Trp Glu Asp Pro Glu Cys Ala Asn

85 90 95

Gly Gly Lys Trp Thr Val Thr Ser Ser Arg Lys Ala Asn Leu Glu Thr

100 105 110

Met Trp Leu Glu Thr Leu Met Ala Leu Val Gly Glu Gln Phe Asp Glu

115 120 125

Ser Glu Glu Ile Cys Gly Val Val Ala Ser Val Arg Arg Ser Gln Asp

130 135 140

Lys Leu Ser Leu Trp Thr Arg Thr Ala Ser Asn Glu Ala Ala Gln Met

145 150 155 160

Ser Ile Gly Arg Lys Trp Lys Glu Ile Ile Asp Ala Glu Lys Ile Ser

165 170 175

Tyr Ser Phe His Asp Asp Ser Lys Lys Glu Arg Ser Val Lys Ser Arg

180 185 190

Tyr Thr Val

195

<210> 5

<211> 867

<212> RNA

<213> 煙草

<400> 5

uccauuacgc cucuccguuc gcuaaaaauc gacacaaagg gaggagagga uuuuuugagg 60

caaaaaucaa uggccacuga agcaccgaua gaggcgacgg agguuccgcc ggcgucagcg 120

acggagacgg uggcgaagca gccacauaag cuagagagga gauggacauu cugguucgau 180

aaucaaucua agccgaaaca aggagccgcu uggggaaguu cucuucgaaa agcuuauacu 240

uucgaaacug uugaggaauu cuggaguuua uaugaucaga uauucaagcc cagcaaguug 300

acugcuaaug cggacuuuca uuuguucaaa gcugggauug agcccaaaug ggaagauccu 360

gagugugcua gugguggcaa guggacuguu acgagcagca gaaaggcuaa ucuugagacu 420

auguggcuug aaacucugau ggcauugguc ggugagcagu uugaugaguc agaggagaua 480

uguggagugg uugccagugu acgucggagu caggauaaac uuuccuuaug gacuaagacu 540

gccuccaaug aagcaauuca gaugagcauu gguaggaagu ggaaggagau cauugaugcu 600

gaaaaaauau ccuauaguuu ccaugaugac ucuaaaaggg aaaggucagc uaagagucga 660

uauacugugu gaauuccuuu auuguguggg auugacacug gucccuagau uuuccaauac 720

ugaaaauugu acgauuagca caguuuugcg cuugucugcu gcaaaauuuu gauuuucuuu 780

uuaaauuuau ucgcacuuga uauggaucuu uggauguauu guguuaaaga uuuuguuugg 840

uucuguguua aaaaaaaaaa aaaaaaa 867

<210> 6

<211> 805

<212> RNA

<213> 煙草

<400> 6

gacacaaaag ggagaggauu uuuugaggca aaaucaaugg ccacugaagc accgauagag 60

gcgacggagg uucugccggc gccggauacg guggagaagc agccgcauaa gcuagagagg 120

agauggacau ucugguucga uaagccgaag caaggcgcug uuugggcaag ugcucuucga 180

aaagccuaua cuuucgaaac uguugaggaa uucuggaguu uauaugauca gauauucaag 240

cccagcaagu ugacugcuaa ugcggacuuu cauuuguuca aagcugggau ugagcccaaa 300

ugggaagauc cugagugugc caaugguggc aaguggacug ucacgagcag cagaaaggcu 360

aaucuugaga cuauguggcu ugaaacucug auggcauugg ugggugagca auuugaugaa 420

ucagaagaga uauguggagu gguugccagu guucgucgga gucaggauaa acuuuccuug 480

uggacuagga cugccuccaa ugaagcagcu cagaugagca uugguaggaa guggaaggag 540

aucaucgaug cugaaaaaau auccuauagu uuccaugaug acucuaaaaa ggaaagguca 600

guuaagaguc gauauacugu gugaauuccc uuauugugug ggauugacac cggucccuaa 660

guuuacugaa aauuguacga uuagcauuag uuugcgcuug ucugcugcaa auuuugauuu 720

ucuugaaauu uauucguacu ugauauguau cuuuggaugu auuguguuaa agauuuuguu 780

ugcuucuuug uuacuugaaa aaaaa 805

<210> 7

<211> 5140

<212> DNA

<213> 煙草

<220>

<221> misc_feature

<222> (4151)..(4151)

<223> n是a, c, g, 或t

<400> 7

cacccgcggt tggaataccg gcccagtcta tcaatatggg cctaaacgtt gtaagacaag 60

tcccactaat atcaatcaac tgggctacca taaataattc cagctccata ccctgattct 120

cttccaacaa ttccattacg cctctccgtt cgctaaaaat cgacacaaag ggaggagagg 180

attttttgag gcaaaaatca atggccactg aagcaccgat agaggcgacg gaggttccgc 240

cggcgtcagc gacggagacg gtggcgaagc agccacataa gctagagagg agatggacat 300

tctggttcga taatcaatct aagccgaaac aaggagccgc ttggggaagt tctcttcgaa 360

aagcttatac tttcgaaact gttgaggaat tctggaggta tacaaaaaat acaaaacacg 420

agatctcttt tagattcttc tggttatatt ttttttgccc taatttagat tttttaatga 480

aattttatca attgttttat gaattgggta atagcacttt tgattcataa gttattgaga 540

aattctgatt ttgttccctg tagcatttaa ctaagcatat ttaacctttt attcattaaa 600

atgtgtgttt tttggtccca ttacatagga aaatatgttt acatttagat tagttttaga 660

actatattac ccttaaatat gaagtagtag tacaaattta acataacata tgggtactta 720

aatgatttaa aagttaatag ttcgttaaag tgggtagatt cacaaataga aggatgaaaa 780

gtgcacattt taattaattc aagtttaagt atgcataaac agatagcaca aggactataa 840

ctagaatatt tcaacattta agggtcaaaa agaacactct tccgtcctta attaattaag 900

atgctttcat gttgcaatgt tatgttgatg taagagtata tgaatatgtt accttcacaa 960

agagagagca catgtcttgg acctactttg tgctggaaac atattaaaaa ttatactttc 1020

tactacctgc tcgctcatat gaaactctgt tttgggagtt cgaaaaaata ttcaccatta 1080

cgttaattat ggagtattat ttatggaaaa gttccattaa gaatattgtc ctatgcatct 1140

tttgcaattt tcaagaatct aagtgcacct aagggggtgg gctagtggtc aatgaagtac 1200

gagaagaacc ttgagatctc aggttcaagt tccagcggag gcgaaaaata gtaggtgatt 1260

tcttccaatt tgcctaagcc ttggtaggca gaatacccga taccaggtag caggtacacg 1320

gcagaagccg gacatcacgt cataaaaaaa tcaagaattt gaattattta acaatccaaa 1380

gcttgtgata tgttctctgt acacctaagt ttttaggtat caatttagta ttttctttaa 1440

ccaccactaa tataattact atacagtcaa gcattgtgct ataaaaccaa acagtgccat 1500

ttttatctta aatttcataa ttttccatgt aatgaattta ctgctgcaat ttatccatag 1560

tttggatgtt gtgtggcttt attttaattc attaatgaga tattactgtt tagaaagtgt 1620

aatagttcca ctatgtggga ttatactggg tttgttgttg taaagtataa tagttggata 1680

gaagctgctt ttaaatgtca attgaagtgt tagatctttc tcttttcagt ttatatgatc 1740

agatattcaa gcccagcaag ttgactgcta atgcggactt tcatttgttc aaagctggga 1800

ttgagcccaa atgggaagat cctgagtgtg ctagtggtgg caagtggact gttacgagca 1860

gcagaaaggc taatcttgag actatgtggc ttgaaactgt aataaaatct tctctttact 1920

tttcttggtt tctgttcagt aggcaggatg tcatgaaagc attatgttga ttagtttcta 1980

gttaaagatg ctcacatgtt gtttgctcga tggaattctt ttgaatagct gatggcattg 2040

gtcggtgagc agtttgatga gtcagaggag atatgtggag tggttgccag tgtacgtcgg 2100

agtcaggata aactttcctt atggactaag actgcctcca atgaagcaat tcaggttatt 2160

ggaattctca tgatgtagaa tagttactga actgaaaact gtgttatgtt ttaccctata 2220

tcataaatct gatatgaaat attatttaaa aaagaatata ccagaatatg atctttttct 2280

taatgatgat gatatggccc atcttccctt ctaaaaaagg agctatctcc aattcttttt 2340

taaatgctga aaaaggagag cgtatttatt tgagcactga attttgagaa caagggaagc 2400

atgcccttcc ccgttgtgac ccatggatgg aacactagat ctagttatta aatatcggtt 2460

aaaaccatca catgccttag ctaatcagtg gctgaaacta gtatttcttg gtagggaagt 2520

ccttgatatt tcctttaact tgtctctaac cggagttggc agatatgatg ttgtttttgt 2580

aatggtatga cctctaccat gtatttgttt tgaatttttt cttttgataa agtaaataat 2640

tttcttagtg atggggtgac cccgtataca agcctatacc aaaaagtgga gaacctacaa 2700

caaaatatgg ttgtcagtga aagaaaccaa tcatttatac acataaagac ctcatgggta 2760

caccaaaaag ctagaaacga gaggtcgttt tgcaattttt cgaaagcatt atcaacctct 2820

tcaaatactc tcatgttcct ctctttccat agaacccaca taatggctga tggggaaaca 2880

tcccatgccc tcggtcttct cttcctcctg aaggcccaag tatgcaacgc ctctttcatt 2940

gtgcacgcat cacgcattat attcgaaacc aatttaggac caccgaccgc aactgtccag 3000

ccacatgaca acgcaacaag agatggtttt acacctttgc ccgcacaact gtacaagatg 3060

caacaactaa ccatttgttc ttattatggg ccttttgttg ccgttttgca ttaggccttc 3120

gctaaaaaca ctttgaccct ggctcatatc ccttgaactg atctatggac atataggcat 3180

ctgaatgtgc ttcattttca tcttctaaag tacccttgtg cttgaaatcg aaatttgctg 3240

tgtggtgatg ttctatagat catagatggt aagaaattcc aaaagggtgt gaagtttgca 3300

aaggtgttcc ctagaagtct gtactcatca gcttctcatc taaacacagg aatgtggtta 3360

ttttgaaggg ttttacttgt cacgaagtgg atgcaggacc ccctcccccc caacacacac 3420

acacaacaca cccacccacc caatatgtct ttgtctccaa tttaattact taatgattat 3480

ggatttggga aaatggaaat atgctatctg gactttaagg ttgtactttg caatctttta 3540

acctttccga cttgaactgt ataatgaatt gataatgtta caacgacctt ttaacatttg 3600

tttagaaaaa agggcaactc ggtgcatgat gcatcccgcg tttacacaag atccggtgaa 3660

gagccgcaac actagtgcgt gtgatggaaa caactttact gttgctccaa gactccattt 3720

caccttttta acattttagt ttttttattt aagtttgggg gtgggaagag ggatttcaaa 3780

tggagacgtg tacactagaa agaactaact gaaaaaggac aaaggacaga taacctaata 3840

ctgtacctgg gacataaacc atttctctta tctttgcctt catgatttag tgatttttct 3900

cttttttctt ttccttgcga agttttcaca ttgcctctta aaatgtttaa aaactcgtca 3960

gggtggtaaa gtgcaatagg ccttttatac gaatgaaaag acaaagaaac agctaaactg 4020

aaatagtatt tcttcaatct cacctaacag tttcattcat ttacagtgta cctaattctg 4080

gttggtcttg tttaatacac cttctcctgt gtgtaccact aatgcacttg ctaaggatga 4140

tttaattccc nacacacaca cccacccacc cacacaaaag atgctggaaa atgtatcttt 4200

ctccctctga atatgcagct tggagtttta gacacaagtt cttgtatttc attcgttaag 4260

cactattcca tattatacta aaagcttata ttagacatgt tcatcttaca gtattgcaag 4320

acacaaggtt caatttaaat tccattacat tgctccacta ggtttccttt tttgtttatt 4380

gttgtgtgac tgcatgtgtt ttcctgcttt taacacatgt aacatgtctg gatatcaaca 4440

atcttcattc ctaacctttg ttttttggca tgatgctaca cttgatgcat tgttttcctg 4500

cttttaacac atgtaacatg tctggatatc aacaatcttc attcctaacc tttgtttttt 4560

ggcatgatgc tacacttgat gcattgtttt cctgctttta acacatgtaa cacgtctgga 4620

tatcaacaat cttcattcct aacctttgtt ttttggcatg atgctacact tgatgcattg 4680

tggtttcgca attatatata accggttggt tttatgctgc agatgagcat tggtaggaag 4740

tggaaggaga tcattgatgc tgaaaaaata tcctatagtt tccatgtaac ttcccttgcc 4800

gcttgccatt attgcaaagt caagtgtctt ttatctttcc tcctgttaat ttcttttcct 4860

ctcgtaatca accaatcttt tggtcgttgc aggatgactc taaaagggaa aggtcagcta 4920

agagtcgata tactgtgtga attcctttat tgtgtgggat tgacactggt ccctagattt 4980

tccaatactg aaaattgtac gattagcaca gttttgcgct tgtctgctgc aaaattttga 5040

ttttcttttt aaatttattc gcacttgata tggatctttg gatgtattgt gttaaagatt 5100

ttgtttggtt ctgtgttact tatctggagc ctgccccatg 5140

<210> 8

<211> 3620

<212> DNA

<213> 煙草

<400> 8

acaacaaata cccgaggtag gattaccggc ccagtctgtc atcatatatg gacctgaaca 60

ttgcaagatg aggcccaata atagcaatca actgggccag tataaataaa attccagctc 120

cataacctga ttttcttccc aacaattcca ttacgcctca atcgacacaa aagggagagg 180

attttttgag gcaaaaatca atggccactg aagcaccgat agaggcgacg gaggttctgc 240

cggcgccgga tacggtggag aagcagccgc ataagctaga gaggagatgg acattctggt 300

tcgataagcc gaagcaaggc gctgtttggg caagtgctct tcgaaaagcc tatactttcg 360

aaactgttga ggaattctgg aggtatacaa aaaatacaaa acacgagatc acttctagat 420

tcttctggtt atatttattt gccctaattt agatctttaa tgaaattttg tcaattgttt 480

tattaattgg gataatagca cttttgatca tcagttattg ataaattcgg attttgttcc 540

ttgtagcatt caagtaagcc tatttaacct tgaattcatt aaaatgtgtg tttttggtcc 600

ctttacatag gaaatatgtt acatttagat tagttttaga actatattac cctaaaataa 660

gaagtgctag tacaaattta acataacata ggggtactta aatgatattg aaagttaaca 720

attcattaaa gttgtgtaga ttcacaaata gaaggatcaa aagtgcacat tttaattaat 780

tcaaggttaa gtatgcataa gcagatagca caaggactat aactagaata tgtcaatgtt 840

taagggacaa aaagcacaat cttccattct taattagtta agatgctttc atgctgcaag 900

gttctatgtt gatgtaagag tatatgaata tgttaccttc acaaaaagag aacatatatc 960

ttggaccttc tttgtgctgg aaaacatatt gaaaattata ctttctactt cctgcttata 1020

tgactctctg ttttgggact tcaggaattt ttcaccatta cactaattat tgagtattat 1080

tatggaaaag tttctttaag aatattgttc tatgcatctt ttgcaatttt caagaatcta 1140

actgcaacca atgggtgtag ctagtggtga atgaagtggg agaagaacct tgaggtctcg 1200

ggttcaaatt acagcggcag tgaaaagaat actagttccc atttgcaggt acccggcgga 1260

agctggatac cgcatcattt aaaaaaaacc aagaatttga attatttaac aatccaaagc 1320

ttgtgatatg ttctctataa aactaacttt ttagatatca atttagtgtt ttcttcaacc 1380

tccactaata taattactgt ccagtcaagc agtgtgctat aaaaccaaac cgtgcatttt 1440

tatcttaaat ttcataattt ccccagtaat ggattctacc gctgcaattt atccatactt 1500

gggatgttgt gtggctttat tttaattcat tgacgagata ttattattta gaaagtgtaa 1560

tagttggata gaagctgctt ttaaatgcca attgaagtgt tagatctttc tctttgcagt 1620

ttatatgatc agatattcaa gcccagcaag ttgactgcta atgcggactt tcatttgttc 1680

aaagctggga ttgagcccaa atgggaagat cctgagtgtg ccaatggtgg caagtggact 1740

gtcacgagca gcagaaaggc taatcttgag actatgtggc ttgaaactgt aataaagtct 1800

tccctttgct tctgttggtt tctgttcagt aggcaggatg tcatgaaagc attatgttga 1860

ttaatttctt gctaaagatg ctcacatatt gtttgctgga tggatttctt ttgggcagct 1920

gatggcattg gtgggtgagc aatttgatga atcagaagag atatgtggag tggttgccag 1980

tgttcgtcgg agtcaggata aactttcctt gtggactagg actgcctcca atgaagcagc 2040

tcaggttagt ttggaattct cgtggtgtca aatagtatct gaaattctga actaaaaact 2100

gtgttatttt ttcccctata tcctaaatct gatatgaaat attattaaaa aaaggatata 2160

ccagaatatt atctttttct taatgatgat ctgtcccatc tccaattttt ttgtaaacgc 2220

tgaaaaagga gagcagcttt atttgagcac cgaattttga gaacaagaaa agaatgccct 2280

tccccattgt gacccatgga tggagcacta gatctgttat tcaatatata atttaaatat 2340

caattaaaac catcacatac cctagctaat cagtggctga aattattatt tttcttggca 2400

gggaatcctt gatatttcct ttcacttatt ctctaaccat aattggcagc tatgacgttt 2460

ttatttattg taatggtata gcttttctct ggcatttgtt cagttttctt gataaagtaa 2520

ataattttat tagtgatggg gagaccccgt atacaagcct ataccaaaaa gtggagaacc 2580

tacaacagaa tacggttctc catgaaagaa atacacatag gtacctcatg ggtacatcaa 2640

aaagaaacta gacaagagat tgttttgcaa ttttactaaa tcattatcaa ccccttcaaa 2700

tgctctcatg ttcctttctt tccatataac ccacataatg gctgatgggg cgacatcaca 2760

tgccctcaat cttctgttcc tcctcctgaa ggcccaacta tgcaacacct ccttcattgt 2820

gcccgcatca cccattgtat tccaaaaaaa aagatgctgg aaaatgtatc ttttcccctc 2880

tgaacatgca gcttggagtt tgacataagt ttttgtattt cattctgtaa gcactgttcc 2940

agattatact aaaagcttat attagacatg ttcatcttac agtattgcaa tacacaaggt 3000

ttcaatttaa attcgattac atttctccac taggttccct tttttgttta ttgttgtctg 3060

actgcgtata tttcctgctt ttgaccatgt aacctgtctg gatatcaaca atcttcactc 3120

ttaacttttg ttttctggca tgttgctaca cttgatgctc catggttttg caatgatata 3180

tgactggttg gttttatgct gcagatgagc attggtagga agtggaagga gatcatcgat 3240

gctgaaaaaa tatcctatag tttccatgta acttctgttg ccccttacca ttattgcaaa 3300

atcaagtgtc ttttatcttt cctcctgtta atttttttct ttcttaatca acctttcttt 3360

tggttgttgc aggatgactc taaaaaggaa aggtcagtta agagtcgata tactgtgtga 3420

attcccttat tgtgtgggat tgacaccggt ccctaagttt actgaaaatt gtacgattag 3480

cattagtttg cgcttgtctg ctgcaaattt tgattttctt gaaatttatt cgtacttgat 3540

atgtatcttt ggatgtattg tgttaaagat tttgtttgct tctttgttac ttgtctaaag 3600

tgtgcctcat gtcttaattt 3620

<210> 9

<211> 313

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNAi 觸發(fā)器

<400> 9

agaggcgacg gaggttccgc cggcgtcagc gacggagacg gtggcgaagc agccacataa 60

gctagagagg agatggacat tctggttcga taatcaatct aagccgaaac aaggagccgc 120

ttggggaagt tctcttcgaa aagcttatac tttcgaaact gttgaggaat tctggagttt 180

atatgatcag atattcaagc ccagcaagtt gactgctaat gcggactttc atttgttcaa 240

agctgggatt gagcccaaat gggaagatcc tgagtgtgct agtggtggca agtggactgt 300

tacgagcagc aga 313

<210> 10

<211> 954

<212> DNA

<213> 煙草

<400> 10

ggcacgagga aacattgaac ttttcctacg aatacaaatt cggaatttct gtgagaagtt 60

acacattttc agttgaaacc catcaccaaa agtccaaaat cacaaatttc cagacgaaag 120

ctatagtgtt gagaacacca aaatggttga tgaagtagag aaaccggtgt cgttagagga 180

atcgaagact aatactcgtg aggtggaaga ggaaggagag atcgtggggg aatcagacga 240

tacgatgtcg tctttaggga acccaagcat ggcaatgaaa cacgcgctag aacattcatg 300

gacattttgg ttcgataacc catcagggaa atcaaaacag gctgcttggg gtagttccat 360

tcgaccaatt tacaccttct ccactgtcga agatttttgg agtgtgtaca acaatatcca 420

ccacccaagc aaattggctg tgggggcaga ctttcactgt tttaagaata aaattgagcc 480

aaagtgggag gatcctgtct gcgccaacgg aggaaagtgg acaatgagct tttcgagggg 540

taaatctgat acctgctggc tgtatacgct gctggctatg attggagaac aatttgactg 600

cggagatgaa atttgtggag ctgttattaa tgttcgagtt agacaagaaa aaatagcttt 660

gtggaccagg aatgctgcca atgaaacagc tcaggtgagc attggtaaac agtggaagga 720

atttctggat tacaatgact cggttggctt tatatttcat gatgatgcaa agaagctaga 780

cagagctgcc aagaatcgtt attctgtgta gttctatcgt tacaatagga attgtgaacg 840

acacagttac tgagaagcag tcacctgtgg ctgcctgttt tgaccgctta cattggtatt 900

cacagttttc ataaggaaat ttgtttggtt ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 954

<210> 11

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNAi 觸發(fā)器

<400> 11

cgaagactaa tactcgtgag gtggaagagg aaggagagat cgtgggggaa tcagacgata 60

cgatgtcgtc tttagggaac ccaagcatgg caatgaaaca cgcgctagaa cattcatgga 120

cattttggtt cgataaccca tcagggaaat caaaacaggc tgcttggggt agttccattc 180

gaccaattta caccttctcc actgtcgaag atttttggag tgtgtacaac aatatccacc 240

acccaagcaa attggctgtg ggggcagact ttcactgttt taagaataaa attgagccaa 300

agtgggagga tcctgtctgc gccaacgga 329

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

caccgaagac taatactcgt gagg 24

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

tccgttggcg cagacagg 18

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

caccagaggc gacggaggtt cc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tctgctgctc gtaacagtcc 20

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

cgagttagac aagaaaaaat agctttgt 28

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

atccagaaat tccttccayt gttt 24

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

accaggaatg ctgccaatga aacagc 26

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gccactgaag caccgataga g 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ttatcgaacc agaatgtcca tctc 24

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 21

tccgccggcg tcagcgac 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

ctaagggtgc tgccagcttt 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

gtcaagcact ggagcatatc ca 22

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 24

atcatgaacc atccaggaca gattgg 26

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ggcctaaacg ttgtaagaca a 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

tgcttagtta aatgctacag gg 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ttacgcctct ccgttcgcta 20

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ctgggtttgt tgttgtaaag ta 22

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cacagttttc agttcagtaa c 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gatgggccat atcatcatca t 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gacctgaaca ttgcaagatg a 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ggcttacttg aatgctacaa gg 22

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ttacgcctca atcgacacaa 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ccccagtaat ggattctacc 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

atcagattta ggatataggg g 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

cagatactat ttgacaccac 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

ccataccctg attctcttcc 20

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

aacttcccca agcggctcat agt 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

aacttcccca agcggctcat aat 23

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gcctcaatcg acacaaaagg gagag 25

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ttgcttcggc ttatcgatcc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

ttgcttcggc ttatcgattc 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

ccgagtaaag atgaatgtgt gc 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ttgccaggag agtcagaggt 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

aaatcgacac aaagggagga g 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

aacttcccca agcggctcca t 21

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gcctcaatcg acacaaaagg gagag 25

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

agcgccttgc ttcggcttat cgat 24

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gccggatacg gtggagaag 19

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

ccaaacagcg ccttgctt 18

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 51

atggacattc tggttcgat 19

PCT/RO/134表