本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)和植物育種的領(lǐng)域。本發(fā)明提供了產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)(外觀為粉紅色且有光澤的果實(shí))的番茄(Solanum lycopersicum)的栽培植物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因(成髓細(xì)胞血癥等位基因12)，并且額外地包含在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變，如在編碼CD蛋白(角質(zhì)缺乏(Cutin Deficient或Cutin Deficiency)蛋白)的等位基因中，所述突變導(dǎo)致與野生型相比，(顯著)增加的果實(shí)的光澤度，和/或紅熟(Red Ripe)(RR)期的(顯著)增加或減少的角質(zhì)積累。在一方面，與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中(如編碼CD蛋白的CD基因的等位基因)缺少突變的植物相比，紅熟期的角質(zhì)累積的增加或減少為至少15％的增加或減少，即角質(zhì)層厚度分別增厚至少15％或變薄至少15％。在一方面，栽培的番茄植物包含純合形式的myb12等位基因(也稱為粉紅色等位基因)，還包含純合或雜合形式的cd等位基因(也稱為光澤等位基因或角質(zhì)缺乏(cutin deficiency)等位基因)，尤其是cd2/cd2(純合型)或CD2/cd2(雜合型)，由此所述植物的紅色新鮮果實(shí)具有無色果皮，因此除光澤外觀之外還有粉紅色外觀。與缺少突變的植物(野生型CD2/CD2純合型的)相比，光澤突變cd2的雜合形式顯示出增加的光澤度。

本發(fā)明還提供包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因的本發(fā)明的植物，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或者其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或在其變體中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或其中所述植物包含y(黃色)基因。此外，包含突變myb12蛋白的植物也優(yōu)選地包含編碼突變CD蛋白的等位基因，例如CD1、CD2或CD3蛋白的突變等位基因。在一方面，突變CD蛋白為SEQ ID NO:11的蛋白，其相對(duì)于野生型CD2蛋白(SEQ ID NO:2)而言包含G736V氨基酸置換；和/或SEQ ID NO:15的突變CD2蛋白，其相對(duì)于如SEQ ID NO:10所示的野生型CD2蛋白而言包含D737N和/或Q708H氨基酸置換。因此，在一方面，所述番茄植物產(chǎn)生粉紅色光澤的果實(shí)，并且所述果實(shí)的細(xì)胞對(duì)于myb12/myb12(突變粉紅色等位基因)或y/y(黃色等位基因)是純合型的，或?qū)τ谶x自cd1、cd2和cd3(突變光澤等位基因，例如CD2/cd2或cd2/cd2；CD1/cd1或cd1/cd1；CD3/cd3或cd3/cd3)的突變cd等位基因是純合型或雜合型的。本發(fā)明還提供這樣的番茄種子，即可從其生長出本發(fā)明的植物，和/或可從其中獲得本發(fā)明的突變myb12基因和/或突變cd2基因并可通過常規(guī)育種將其引入至任何其他番茄植物中，以產(chǎn)生其他的產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄植物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的植物果實(shí)或由其組成的食品和食品產(chǎn)品。本文還包括由任何其他番茄植物、種子、組織、細(xì)胞、食品或飼料產(chǎn)生本發(fā)明的植物、種子、植物組織和細(xì)胞并且/或者由這些制成的食品和/或飼料產(chǎn)品的方法，由此可檢測突變myb12和/或cd2基因，mRNA(cDNA)和/或蛋白質(zhì)的存在。

背景技術(shù)：

番茄果實(shí)的表皮顏色是由Y基因決定?；験產(chǎn)生遍布果實(shí)表皮細(xì)胞壁的獨(dú)特的黃色色素，而其等位基因——y基因，在表皮壁中產(chǎn)生透明或無色的情況(E.W.Lindstrom,1925,Inheritance in Tomatoes,Genetics,issue 10(4)pp 305–317)。

粉紅色番茄果實(shí)在亞洲是非常流行的用于食用的。首次記載的粉紅色果實(shí)是在具有缺少黃色色素的透明表皮的果實(shí)中(Lindstrom,1925,Inheritance in Tomatoes,Genetics,issue 10(4)pp 305–317)。遺傳研究表明粉紅色果實(shí)是由1號(hào)染色體上存在的單基因的隱性y(黃色)基因座導(dǎo)致的，而紅色的果實(shí)具有顯性Y等位基因(Lindstrom 1925)。所述Y基因已被鑒定為MYB12(Ballester et al,見下文)。包含y基因的許多番茄種質(zhì)(assession)是可獲得的，參見例如萬維網(wǎng)tgrc.ucdavis.edu/data/acc/GenDetail.aspx？gene＝y(tǒng)。

番茄果實(shí)的顏色主要由類胡蘿卜素和類黃酮決定。成熟番茄果實(shí)的紅色主要是由于在果實(shí)成熟過程中產(chǎn)生的類胡蘿卜素全反式-番茄紅素的累積。除了番茄紅素之外，番茄果實(shí)還包含顯著水平的堇黃素(violaxanthin)和葉黃素(lutein)。在類胡蘿卜素途徑中具有突變的番茄植物具有改變的類胡蘿卜素組成，其導(dǎo)致不同的果實(shí)顏色，例如橙色(橘紅β)或黃色(r)果實(shí)(Lewinsohn et al.2005 Trends Food Sci Technol.,Vol 16pp 407-415)。

此外，類黃酮在決定番茄果實(shí)的顏色中發(fā)揮作用。類黃酮主要在果皮中積累，因?yàn)楣庵械念慄S酮途徑不活躍。番茄果皮中最豐富的類黃酮之一是黃色的柚配基查爾酮(naringenin chalcone)。此外，已經(jīng)在番茄果實(shí)中鑒定出最多達(dá)70種不同的類黃酮。

Ballester等人進(jìn)行了對(duì)來源于番茄“Moneyberg”與野生種克梅留斯基番茄(Solanum chmielewskii)之間的雜交的漸滲系(IL)群體的表型分析，其顯示出三個(gè)具有粉紅色果實(shí)顏色的IL。這些IL在1號(hào)染色體的短臂上具有純合型克梅留斯基番茄基因滲入，與已知導(dǎo)致無色表皮的y(黃色)突變的位置一致，并因此在與紅色果肉結(jié)合時(shí)為粉紅色的果實(shí)。該同一研究表明，粉紅色果實(shí)在果皮中缺少黃色類黃酮柚配基查爾酮的成熟依賴性的積累——該物質(zhì)在Moneyberg果實(shí)的果皮中隨成熟而增加，而類胡蘿卜素水平不受影響(Ballester et al.2010 Plant Physiology,vol 152pp 71-84)。在同一研究中，Ballester等公開了(Ballester et al.2010 Plant Physiology,vol 152pp 77右欄)“獲自商業(yè)來源的粉紅色MYB12等位基因的推斷的氨基酸序列與紅色Moneyberg等位基因相同”，表明了“在所有[由Ballester et al.]測試的粉紅色基因型中觀察到的下調(diào)的MYB12基因表達(dá)，而非異常的MYB12[蛋白]功能，是粉紅色表型的主要原因”。使用基因沉默研究遺傳作圖、分離分析和VIGS(病毒誘導(dǎo)的基因沉默)結(jié)果確認(rèn)了粉紅色的這一原因。

到目前為止，對(duì)現(xiàn)有的商業(yè)非GMO無色果皮(即粉紅色)y突變體的分析顯示在myb12等位基因和其啟動(dòng)子序列中都沒有突變，這表明y突變體表型是由于調(diào)節(jié)基因中的突，即額外的突變等位基因中的突變(Adato et al 2009 PLoS Genetics,vol 5,issue 12,e1000777)。

在PCT/EP2014/051582中公開了兩種非GMO，栽培的粉紅色番茄植物，其具有突變myb12蛋白，其中與野生型番茄myb12蛋白序列相比，所述突變myb12蛋白具有G50R氨基酸置換，或其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1中包含氨基酸61至338的缺失。當(dāng)與野生型(即紅色)栽培番茄植物相比時(shí)，這些非GMO栽培番茄植物的粉紅色果實(shí)(由于無色果皮)的外觀暗淡，正如對(duì)于單基因隱性y(黃色)基因座為純合型的植物的粉紅色果實(shí)。因此這些果實(shí)顯得更缺少光澤。因此，與野生型栽培番茄植物的果實(shí)(有光澤)相比，粉紅色非GMO栽培番茄果實(shí)的外觀吸引力更差。

植物角質(zhì)層為由角質(zhì)組成并充滿蠟的保護(hù)層，所述蠟也在表面上積累。植物角質(zhì)層由植物表皮細(xì)胞壁合成。植物角質(zhì)層在限制氣生植物器官的水分損失、防治病原體、開裂(cracking)以及收獲后保質(zhì)期中發(fā)揮重要作用。番茄果實(shí)亮度(也稱為光澤度)也通過番茄果實(shí)角質(zhì)層控制，并且似乎與蠟載量(load)無關(guān)。然而，迄今為止，沒有確定角質(zhì)載量和/或組成與果實(shí)亮度之間有明顯的聯(lián)系。果實(shí)具有改變的角質(zhì)層的番茄植物看起來是暗淡的或有光澤的。這顯示有許多基因參與角質(zhì)發(fā)育。這些基因可被繪制(map)到不同的染色體，并且甚至可以具有不同的遺傳模式(Petit et al Plant Physiology,2014,Vol 164,pp 888-906；Isaacson et al The Plant Journal,2009,Vol 60,pp 363-377)。

因此，需要產(chǎn)生這樣的粉紅色番茄果實(shí)的非GMO、栽培番茄植物，所述粉紅色番茄果實(shí)與產(chǎn)生粉紅色番茄果實(shí)的正常的非GMO、栽培番茄植物的果實(shí)相比更有光澤的(即光澤度更高的)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，具有異常的MYB12蛋白質(zhì)功能，而非下調(diào)的MYB12基因表達(dá)的番茄種的栽培植物產(chǎn)生粉紅色外觀的番茄果實(shí)。鑒于Ballester et al.2010和Adato et al.(2009)(見上文)公開了下調(diào)的MYB12基因表達(dá)產(chǎn)生粉紅色外觀的番茄果實(shí)，這是非常令人驚奇的。不幸地是，這些具有異常的MYB12蛋白質(zhì)功能的植物也有暗淡的(即無光澤的)番茄果實(shí)，像包含y基因的非GMO番茄植物一樣。然而，當(dāng)具有(能夠產(chǎn)生)粉紅色果實(shí)的番茄種栽培植物在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中——例如在角質(zhì)缺乏基因(CD基因)的等位基因中——具有額外的突變時(shí)，所述突變導(dǎo)致所述果實(shí)的有光澤的外觀。在一方面，所述突變導(dǎo)致在果實(shí)紅熟(RR)期時(shí)角質(zhì)積累增加或減少。在一方面，與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因(例如CD等位基因)中缺少突變的植物相比，在果實(shí)紅熟(RR)期時(shí)的角質(zhì)量(角質(zhì)層中的角質(zhì)含量)增加至少15％或減少至少15％，和/或角質(zhì)層分別增厚至少15％或變薄至少15％。這種植物產(chǎn)生(能夠產(chǎn)生)具有光澤的粉紅色番茄果實(shí)。這是非常令人驚奇的，特別是鑒于所述植物或果實(shí)不具有任何其他植物或果實(shí)的表型改變或疾病易感性的事實(shí)。在一方面，參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因選自番茄CD基因(例如番茄CD1基因、CD2基因或CD3基因)，特別是選自突變cd1等位基因、cd2等位基因或cd3等位基因。角質(zhì)量和/或角質(zhì)層厚度是與不包含突變CD基因(即包含野生型CD1、CD2和CD3等位基因)的正常番茄植物進(jìn)行比較。

因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生粉紅色且有光澤的果實(shí)(也稱為“粉紅色光澤果實(shí)”)的番茄種的栽培植物，其包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，以及在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中包含突變，所述突變將導(dǎo)致與野生型植物(在用于角質(zhì)層發(fā)育的基因中缺少突變等位基因)相比，紅熟(RR)期時(shí)的角質(zhì)積累增加或減少。在一方面，與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變的植物相比，角質(zhì)增加或減少至少15％，和/或角質(zhì)層厚度分別增厚至少15％或變薄至少15％。

本發(fā)明也涉及產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄種的栽培植物，其包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的純合形式的myb12等位基因，或包含純合形式的y(黃色)基因，并且還包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的純合或雜合形式的角質(zhì)層缺乏(CD)等位基因，與缺少所述突變的cd等位基因的植物果實(shí)相比，所述突變cd等位基因?qū)?dǎo)致果實(shí)的光澤度增加。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的栽培番茄植物，其中基因組myb12基因中的所述突變導(dǎo)致所述植物的果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期顯示出粉紅色外觀，優(yōu)選地由于突變cd等位基因(優(yōu)選編碼突變CD蛋白質(zhì)的突變cd等位基因)的存在，所述果實(shí)兼有光澤的(不暗淡的)外觀。在一方面，所述突變cd等位基因?yàn)閏d2等位基因，并且相對(duì)于野生型(功能性)CD2蛋白質(zhì)而言，所述突變引起SEQ ID NO:10或編碼SEQ ID NO:10的變體的CD等位基因(例如編碼CD2蛋白質(zhì)的cd等位基因，所述CD2蛋白質(zhì)包含了與SEQ ID NO:10至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，其選自G736V置換、D737N置換和/或Q708H置換。因此，在一方面，選自G736V置換、D737N置換和/或Q708H置換的一個(gè)或多個(gè)突變存在于這類SEQ ID NO:10的變體中。

一般性定義

術(shù)語“核酸序列”(或核酸分子)是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，尤其是編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的DNA?！胺蛛x的核酸序列”是指不再處于分離出其的天然環(huán)境中的核酸序列，例如，在細(xì)菌宿主細(xì)胞中或者在植物細(xì)胞核或質(zhì)體基因組中的核酸序列。

術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”可互換使用并且指的是由氨基酸鏈組成的分子，而不涉及具體的作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來源。因此，Myb12白的“片段”或“部分”仍可被稱為“蛋白質(zhì)”?！胺蛛x的蛋白質(zhì)”用于指不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如在體外或者在重組的細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中。

術(shù)語“基因”意指DNA序列，其包含在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄為RNA分子(例如mRNA、hpRNA或RNAi分子)的區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū))，該轉(zhuǎn)錄區(qū)與適合的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子)可操作地連接。因此，基因可以包含數(shù)個(gè)可操作地連接的序列，例如啟動(dòng)子、含有例如參與翻譯起始的序列的5’前導(dǎo)序列、(蛋白質(zhì))編碼區(qū)(cDNA或基因組DNA)和含有例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的3’非翻譯序列?；蚩梢允莾?nèi)源基因(在來源的物種中)或是嵌合基因(例如轉(zhuǎn)基因或同源轉(zhuǎn)基因(cis-gene))。

“基因的表達(dá)”是指其中與適合的調(diào)節(jié)區(qū)(特別是啟動(dòng)子)可操作地連接的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄為RNA的過程，所述RNA具有生物活性，即其能夠被翻譯為有生物活性的蛋白質(zhì)或肽(或活性肽片段)或其本身具有活性(例如，在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中)。編碼序列可以是有義方向的并編碼所需的、有生物活性的蛋白質(zhì)或肽、或活性肽片段。

“活性蛋白質(zhì)”或“功能性蛋白質(zhì)”是具有在體外可測量的(例如通過體外活性測定法)和/或在體內(nèi)可測量的(例如通過所述蛋白質(zhì)賦予的表型)蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)?！耙吧汀盡yb12蛋白質(zhì)為包含與SEQ ID NO:1有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的完全功能性蛋白質(zhì)(也稱為SEQ ID NO:1的“變體”或“功能性變體”)。同樣地，野生型Myb12等位基因是編碼所述野生型蛋白質(zhì)或野生型功能性變體的等位基因。

本文的“突變myb12蛋白質(zhì)”是在編碼所述野生型Myb12蛋白的核酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變的蛋白質(zhì)，由此所述突變導(dǎo)致(所述突變核酸分子編碼的)“功能降低”或“功能喪失”的蛋白質(zhì)，例如在體內(nèi)可測量的(例如通過所述突變等位基因賦予的經(jīng)修飾的表型)。“功能降低的myb12蛋白”或“活性降低的myb12蛋白”或功能喪失的myb12蛋白是指突變myb12蛋白，其導(dǎo)致無色的果實(shí)表皮或無色的果皮，所述表皮或果皮在與紅色番茄果肉結(jié)合時(shí)使成熟果實(shí)為粉紅色。

本文的“突變cd蛋白質(zhì)”是在編碼所述野生型CD蛋白(角質(zhì)缺乏蛋白)的核酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變的蛋白質(zhì)，由此所述突變導(dǎo)致(所述突變核酸分子編碼的)“功能降低”或“功能喪失”的蛋白質(zhì)，例如在體內(nèi)可測量的(例如通過所述突變等位基因賦予的經(jīng)修飾的表型)?！肮δ芙档偷腸d蛋白”或“活性降低的cd蛋白”或功能喪失的cd蛋白是指突變cd蛋白，其導(dǎo)致在紅熟期番茄果實(shí)的光澤外觀和/或果實(shí)的(果實(shí)角質(zhì)層的)角質(zhì)含量和/或角質(zhì)層厚度的顯著增加或減少。所述突變cd蛋白質(zhì)可以是突變cd1、cd2或cd3蛋白質(zhì)。

“粉紅色番茄果實(shí)”、“y突變體”、“y表型”或“無色果皮y表型/突變體”或“無色表皮”或“無色果皮”是指番茄果實(shí)、或能產(chǎn)生果實(shí)的番茄植物，其例如與黃色/橙色正常表皮(存在于包含一個(gè)或兩個(gè)拷貝的編碼SEQ ID NO:1的野生型Myb12蛋白或功能性變體的基因的植物的果實(shí)中)相比時(shí)，具有更淺顏色(更少色素；更透明)的果實(shí)表皮，這導(dǎo)致在與紅色果肉結(jié)合時(shí)果實(shí)的粉紅色外觀。由于myb12突變是隱性的，只有包含純合形式的突變myb12等位基因的番茄植物的果實(shí)表皮才會(huì)具有無色的果皮。果實(shí)表皮的顏色可通過以下的方式來簡單地從視覺上比較，即通過觀察紅色期的果實(shí)和/或通過剝離表皮并(例如通過對(duì)著光源拿著表皮)從視覺上評(píng)估表皮的色素沉著?；蛘?，如Adato et al.(見上文)或Ballester et al.2010(見上文)中所述，可確定果皮組織中的總類黃酮含量或柚配基查爾酮水平。具體地，在材料與方法——類黃酮和類胡蘿卜素提取和HPLC分析——中，Ballester等人提及了Boni et al.(2005)，其在段落“酚酸和抗壞血酸提取、分離和HPLC-PDA檢測”中記載了類黃酮檢測方法(Boni et al.(2005)的第429頁的左欄(Boni et al.New Phytologist(2005)volume 166pp 427-438))。與野生型果實(shí)的果皮相比，無色表皮myb12突變體的表皮組織(果皮)包含顯著更少的柚配基查爾酮，例如在突變myb12等位基因純合型的果實(shí)中低于50mg/kg果皮鮮重，優(yōu)選低于20、10、5、2或低于1mg/kg果皮鮮重。

表皮是指覆蓋植物的葉、花、果實(shí)和莖的單層細(xì)胞群。它在植物和外部環(huán)境之間形成邊界。表皮發(fā)揮著多種功能，它防止失水、調(diào)節(jié)氣體交換、分泌代謝化合物并且(特別是在根部)吸收水和礦物營養(yǎng)。

正常/紅色番茄果實(shí)(即，包含編碼野生型Myb12蛋白的基因的植物)的正常表皮或表皮在成熟的紅熟期時(shí)，由于果實(shí)表皮中黃色的類黃酮柚配基查爾酮的累積而具有黃色/橙色，例如在紅色品種(如Moneyberg、Pusa Sheetal、Tapa、M82或TPAADASU)中，以及在除中國之外的國家中生長的許多其他番茄品種中。

功能降低的myb12蛋白可通過“部分敲除突變myb12等位基因”(例如，在其核酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變的野生型Myb12等位基因)的轉(zhuǎn)錄和翻譯來獲得。在一方面，這種部分敲除突變myb12等位基因?yàn)榘粋€(gè)或多個(gè)突變的野生型Myb12等位基因，所述突變優(yōu)選地導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的myb12蛋白，即其中至少一個(gè)保守的和/或功能性的氨基酸被另一個(gè)氨基酸置換以使得生物活性顯著降低但不完全消除。但是，番茄Myb12等位基因中的其他突變(例如一個(gè)或多個(gè)無義、錯(cuò)義、剪接位點(diǎn)或移碼突變)也可以導(dǎo)致功能降低的myb12蛋白，并且這種功能降低的蛋白相對(duì)于野生型Myb12蛋白，可以有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、插入或缺失。突變等位基因可以是“天然突變”等位基因(其是天然存在的突變等位基因，例如，沒有人工應(yīng)用誘變劑的情況下自發(fā)產(chǎn)生的)或“誘導(dǎo)突變”等位基因(其是由人工干預(yù)誘導(dǎo)的，例如，通過誘變)。

編碼蛋白質(zhì)的核酸分子中的“突變”是與野生型序列相比一個(gè)或多個(gè)核苷酸的改變，例如通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、缺失或插入?！包c(diǎn)突變”是單個(gè)核苷酸的替換，或單個(gè)核苷酸的插入或缺失。

“無義”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的(點(diǎn))突變，由此一個(gè)密碼子變?yōu)榻K止密碼子。這導(dǎo)致在mRNA中存在的提前終止密碼子并導(dǎo)致截短的蛋白。截短的蛋白可能具有降低的功能或喪失功能。

“錯(cuò)義”或非同義突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的(點(diǎn))突變，由此一個(gè)密碼子變?yōu)榫幋a不同的氨基酸。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。

“剪接位點(diǎn)”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此前mRNA(pre-mRNA)的RNA剪接發(fā)生改變，產(chǎn)生了具有與野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有與野生型不同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。

“移碼”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此mRNA的讀碼框發(fā)生改變，產(chǎn)生不同的氨基酸序列。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。

調(diào)節(jié)序列(例如基因的啟動(dòng)子)中的突變是例如通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、缺失或插入導(dǎo)致的與野生型序列相比的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的改變，從而導(dǎo)致例如產(chǎn)生減少的或不產(chǎn)生所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

“沉默”是指下調(diào)或完全抑制靶基因或基因家族的基因表達(dá)。

基因沉默方法中的“靶基因”是這樣的基因或基因家族(或所述基因的一個(gè)或多個(gè)具體的等位基因)：當(dāng)嵌合沉默基因(或‘嵌合RNAi基因’)被表達(dá)并且例如產(chǎn)生沉默RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如能夠沉默內(nèi)源靶基因表達(dá)的dsRNA或發(fā)夾RNA)時(shí)，其內(nèi)源性基因表達(dá)被下調(diào)或完全抑制(沉默)。在誘變方法中，靶基因是待突變的內(nèi)源基因，導(dǎo)致基因表達(dá)的改變(降低或喪失)或所編碼的蛋白質(zhì)的功能的改變(降低或喪失)。

本文使用的術(shù)語“可操作地連接”是指處于功能性關(guān)系中的多核苷酸元件的連接。當(dāng)一種核酸被置于與另一核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，該核酸被“可操作地連接”。例如，如果啟動(dòng)子(或者更確切地說是轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列)影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與所述編碼序列可操作地連接。可操作地連接意指所連接的DNA序列通常是相鄰的(contiguous)，并且當(dāng)需要連接兩種蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)所連接的DNA序列是相鄰的且處于讀碼框中以產(chǎn)生“嵌合蛋白”?！扒逗系鞍住被颉半s合蛋白”是包含不同的蛋白“結(jié)構(gòu)域”(或基序)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)本身不是天然存在的，但是連接后形成了顯示出被連接的結(jié)構(gòu)域的功能的功能性蛋白。嵌合蛋白也可以是兩個(gè)或更多個(gè)天然存在的蛋白的融合蛋白。

術(shù)語“食品”是被食用以給機(jī)體提供營養(yǎng)支持的任何物質(zhì)。其通常是植物或動(dòng)物來源的，并且包含必需營養(yǎng)(例如碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素或礦物質(zhì))。所述物質(zhì)被生物體攝取并被生物體的細(xì)胞吸收以努力產(chǎn)生能量、維持生命或刺激生長。術(shù)語食品包括被食用以給人類和動(dòng)物機(jī)體提供營養(yǎng)支持的物質(zhì)。

應(yīng)當(dāng)理解，在不同植物株系之間進(jìn)行的比較包括在與一種或多種對(duì)照植物株系的植物(優(yōu)選野生型植物)相同的條件下生長一種株系的多株植物(例如每種株系至少5株植物，優(yōu)選地至少10、15或20株植物)，并且測定在相同環(huán)境條件下生長時(shí)所述植物株系之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。

番茄果實(shí)的“成熟階段”可劃分如下：(1)綠熟期：表面完全是綠色的；綠色的深淺可從淺色到深色不等。(2)破色期：在不多于10％的表面上存在顏色從綠色到淺棕黃色(tannish yellow)、粉紅色或紅色的明確變化(break)。(3)轉(zhuǎn)色期：10％到30％的表面不是綠色的；整體來看，顯示出從綠色到淺棕黃色、粉紅色、紅色或其組合的明確變化。(4)粉紅期：30％到60％的表面不是綠色的：整體來看，顯示出粉紅色或紅色。(5)淺紅期(或橙色期后期)：60％到90％的表面不是綠色的；整體來看，顯示出淺紅色(pinkish-red)或紅色。(6)紅色期(或紅熟期)：90％以上的表面不是綠色的：整體來看，顯示出紅色。值得注意的是，正常的番茄果實(shí)(例如成熟時(shí)為紅色的)和本發(fā)明的粉紅色果實(shí)具有相似的成熟階段。然而，在紅色期(6)的顏色不同：本發(fā)明的果實(shí)為粉紅色，正常(野生型)番茄果實(shí)為紅色。

“嚴(yán)格的雜交條件”可用于鑒定核甘酸序列，其與所給出的核苷酸序列基本相同。嚴(yán)格的條件是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境下是不同的。通常，所選擇的嚴(yán)格條件為在所限定的離子強(qiáng)度和pH下，比具體序列的熱熔解溫度(T_m)低約5℃。所述T_m為(在所限定的離子強(qiáng)度和pH下)50％的靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。通常，所選擇的嚴(yán)格條件為其中鹽濃度在pH 7下為約0.02摩爾，并且溫度為至少60℃。降低該鹽濃度和/或升高該溫度均會(huì)增加嚴(yán)格度。RNA-DNA雜交(使用例如100nt探針的RNA印跡)的嚴(yán)格條件為，例如包括在63℃下以0.2X SSC進(jìn)行的至少一次持續(xù)20min的洗滌的那些，或等同條件。DNA-DNA雜交(使用例如100nt探針的DNA印跡)的嚴(yán)格條件為，例如包括在至少50℃(通常約55℃)溫度下以0.2X SSC進(jìn)行的至少一次持續(xù)20min的洗滌(通常2次)的那些，或等同條件。也可參見Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。

可通過使用全局或局部比對(duì)算法比對(duì)兩個(gè)肽或兩個(gè)核苷酸序列來確定“序列同一性”或“序列相似性”。然后，當(dāng)通過例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默認(rèn)參數(shù)，參見下文)對(duì)序列進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，這些序列共有至少某一最小的序列同一性百分比(如下文進(jìn)一步定義的)時(shí)，則所述序列可以被稱作“基本相同”或“基本相似”。這些程序使用Needleman和Wunsch全局比對(duì)算法來對(duì)兩個(gè)序列的全長進(jìn)行比對(duì)，該算法最大化匹配數(shù)并最小化空位數(shù)。通常，使用默認(rèn)參數(shù)，其中空位生成(gap creation)罰分＝10，空位延伸(gag extension)罰分＝0.5(對(duì)于核苷酸比對(duì)和蛋白質(zhì)比對(duì))。對(duì)于核苷酸，使用的默認(rèn)得分矩陣是DNAFULL，而對(duì)于蛋白質(zhì)，默認(rèn)得分矩陣是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。例如可以使用計(jì)算機(jī)程序(例如可在萬維網(wǎng)上http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/獲得EMBOSS)來確定用于百分比序列同一性的序列比對(duì)和得分。或者，可以通過檢索數(shù)據(jù)庫(例如FASTA、BLAST等)來確定序列相似性或同一性，但是應(yīng)檢索命中并進(jìn)行兩兩比對(duì)以比較序列同一性。如果百分比序列同一性為至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多(例如至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或更多)(如通過使用得分矩陣DNAFULL(核酸)和Blosum62(蛋白質(zhì))并且使用默認(rèn)參數(shù)(即，空位生成罰分＝10，空位延伸罰分＝0.5)的Emboss“Needle”確定的)，則兩個(gè)蛋白質(zhì)或兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、或兩個(gè)核酸序列具有“基本序列同一性”。

當(dāng)提到核酸序列(例如DNA或基因組DNA)時(shí)，所述核酸序列與參照序列具有“基本序列同一性”或與參考序列具有至少80％，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.9％的核酸序列同一性時(shí)，則在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸序列被認(rèn)為是與給定的核苷酸序列基本上相同的，并且可以使用嚴(yán)格的雜交條件進(jìn)行鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與給定的核苷酸序列相比，所述核酸系列包含一個(gè)或更多的突變，但是仍然可以使用嚴(yán)格的雜交條件進(jìn)行鑒定。

在本說明書及其權(quán)利要求中，動(dòng)詞“包含”及其詞形變化(conjugation)以其非限制性的含義使用，意指包括該詞之后所列的項(xiàng)(item)，但是不排除未明確提到的項(xiàng)。另外，通過不定冠詞“一”或“一個(gè)”提及一種要素(element)時(shí)，不排除存在超過一個(gè)所述元素的可能性，除非上下文明確要求有且僅有一個(gè)所述元素。因此，不定冠詞“一”或“一個(gè)”通常意指“至少一個(gè)”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)本文中提到“序列”時(shí)，通常是指具有某一亞基(例如氨基酸)的序列的實(shí)際物理分子。

本文使用的術(shù)語“植物”包括完整的植物或其任何部分或衍生物，例如植物器官(如收獲的或未收獲的果實(shí)、花、葉等)、植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可由其再生出完整植物的植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、可再生或不可再生的植物細(xì)胞、植物愈傷組織、植物細(xì)胞團(tuán)和植物中完整的植物細(xì)胞、或植物的部分，例如胚、花粉、胚珠、子房、果實(shí)(例如收獲的組織或器官，如收獲的番茄或其部分)、花、葉、種子、塊莖、無性繁殖的植物、根、莖、子葉、下胚軸、根尖等。還包括任何發(fā)育階段，例如未成熟和成熟的幼苗等。本文使用的術(shù)語植物包括植物和植物部分，其包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的突變myb12等位基因和/或myb12蛋白，和/或參與角質(zhì)層發(fā)育——特別是果實(shí)角質(zhì)層的角質(zhì)含量和/或果實(shí)的角質(zhì)層厚度——的等位基因中的突變。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語植物部分是指這樣的植物細(xì)胞或植物組織或植物器官，即其包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的突變myb12等位基因和/或myb12mRNA(cDNA)和/或myb12蛋白，此外還包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變。在一方面，植物部分可生長為植物和/或靠光合作用生存(即從無機(jī)物質(zhì)(例如水、二氧化碳和無機(jī)鹽)合成碳水化合物和蛋白質(zhì))。在另一方面，植物部分不能生長為植物和/或靠光合作用生存(即由無機(jī)物質(zhì)(例如水、二氧化碳和無機(jī)鹽)合成碳水化合物和蛋白質(zhì))。

“植物株系”或“育種系”是指植物及其后代。本文使用的術(shù)語“自交系”是指已經(jīng)被反復(fù)自交的植物株系。

“植物品種”是在已知最低等級(jí)的相同植物分類單位中的一組植物，所述植物品種可以基于源自某一特定基因型或基因型組合的特征的表達(dá)來定義(無論是否滿足《植物育種者權(quán)利》(plant breeder's rights)中的識(shí)別條件)，可以通過那些特征中的至少一種的表達(dá)而將所述植物品種與任何其他組的植物區(qū)分開，也可將所述植物品種看作一個(gè)實(shí)體，因?yàn)槠淇杀环敝扯鵁o任何改變。因此，如果一組植物的特征都在于存在1個(gè)基因座或基因(或者由該單個(gè)基因座或基因產(chǎn)生的一系列表型特征)，但是它們又在其它基因座或基因上可以彼此顯著不同，那么即使它們是同一類的，也不可以使用術(shù)語“植物品種”來指示該組植物。

“F1、F2等”是指兩個(gè)親本植物或親本株系之間雜交后的連續(xù)相關(guān)世代。由兩個(gè)植物或株系雜交產(chǎn)生的種子長出的植物稱為F1代。F1代植物自交產(chǎn)生F2代，等等?！癋1代雜種”植物(或F1種子)是由兩個(gè)近交的親本株系雜交得到的世代?！癕1群體”是某植物株系或栽培種的多個(gè)誘變種子/植株。“M2、M3、M4等”指第一誘變種子/植株(M1)自交后得到的連續(xù)世代。

關(guān)于番茄果實(shí)的術(shù)語“光澤”、“有光澤的”或“光澤度”或“亮度”涉及番茄果實(shí)表面的鏡面反射水平。光澤是使番茄果實(shí)的表面具有發(fā)亮的或有光澤的外觀的一個(gè)屬性。光澤會(huì)隨著表面反射而不散射光線的能力而增加。因此通常通過將功率恒定的光束以一個(gè)角度投射到測試表面，隨后通過監(jiān)測反射光的量來測量光澤。然而，也可通過相對(duì)于陽性和/或陰性對(duì)照(例如，WT栽培番茄植物的果實(shí))對(duì)光反射進(jìn)行評(píng)分來從視覺上測量果實(shí)光澤度?；蛘?，在果實(shí)的照片圖片中，可采取光飽和像素的數(shù)量作為光澤度的量度(特別是當(dāng)在相同的條件下——如光強(qiáng)度、角度、相對(duì)于光源而言果實(shí)的環(huán)境和位置——測量不同的果實(shí)時(shí))。在番茄果實(shí)中，包埋表皮細(xì)胞的角質(zhì)層在番茄果實(shí)亮度中起關(guān)鍵性作用，然而角質(zhì)載量(即角質(zhì)層的果實(shí)角質(zhì)含量和/或果實(shí)角質(zhì)層厚度)與果實(shí)亮度(見上文)之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)。果實(shí)角質(zhì)層厚度在番茄果實(shí)發(fā)育的紅熟期時(shí)達(dá)到完全成熟。消費(fèi)者通常將果實(shí)光澤度與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)聯(lián)，因此光澤度是一項(xiàng)重要的果實(shí)特征。類似地，當(dāng)番茄果實(shí)被稱作是暗淡的時(shí)候，那么它不是有光澤的?？赏ㄟ^比較兩個(gè)或更多對(duì)象相對(duì)于彼此的光澤度來從視覺上測量光澤度，或者可以使用光澤計(jì)(Gloss Meter)。參見實(shí)施例3。因此，在本文中，產(chǎn)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上“顯著增加的光澤度”或“增加的光澤度”的果實(shí)的番茄植物為這樣一種植物，即其中該株系或品種的多個(gè)植物和多個(gè)果實(shí)的平均光澤度(在統(tǒng)計(jì)學(xué)上)顯著高于對(duì)照的果實(shí)(例如野生型CD等位基因純合型的，如編碼功能性CD2蛋白的CD2/CD2),例如通過測量例如在如上所述的以及在實(shí)施例中所述的紅熟期時(shí)果實(shí)的表面反光所測得的。

術(shù)語“等位基因”意指特定基因座上的基因的一種或多種替代形式中的任一種，所有這些等位基因均涉及特定基因座處的一種性狀或特征。在生物體的二倍體細(xì)胞中，給定基因的等位基因位于染色體上的特定位置或基因座處。一對(duì)同源染色體的每條染色體上存在一個(gè)等位基因。二倍體植物物種可以在特定基因座上包含大量不同的等位基因。這些可以是所述基因的相同等位基因(純合型的)或兩個(gè)不同的等位基因(雜合型的)。

術(shù)語“基因座”(多個(gè)基因座)意指染色體上存在例如基因或遺傳標(biāo)記物的具體位置或位點(diǎn)。因此，Myb12基因座是在基因組中存在Myb12基因的位置。

“野生型等位基因”(WT或Wt)在本文中是指編碼完全功能性蛋白(野生型蛋白)的基因形式。這類編碼完全功能性Myb12蛋白的序列為例如基于NCBI EU419748番茄MYB12(MYB12)mRNA(如ncbi.nlm.nih網(wǎng)站上/nuccore/171466740下所公開的完整的cds)的SEQ ID NO:4中描述的野生型Myb12cDNA(mRNA)序列，或在SEQ ID NO:7中描述的野生型Myb12基因組序列。SEQ ID NO:1中描述了由該野生型Myb12mRNA編碼的蛋白質(zhì)序列。其由338個(gè)氨基酸組成。其他由等位基因(即賦予與SEQ ID NO:1的蛋白相同程度的果實(shí)顏色，即當(dāng)果實(shí)處于成熟階段時(shí)為紅色番茄果實(shí)的等位基因)編碼的完全功能性Myb12蛋白可能存在于其他番茄植物中并可與SEQ ID NO:1具有基本序列同一性，即與SEQ ID NO:1至少約85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性。這類完全功能性野生型Myb12蛋白在本文中被稱作SEQ ID NO:1的“變體”。同樣地，編碼這類完全功能性Myb12蛋白的核苷酸序列被稱作SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7的變體。

編碼完全功能性CD2(角質(zhì)缺乏2)蛋白的野生型(WT)序列為例如由SEQ ID NO:12中描述的野生型CD2cDNA(mRNA)序列(基于萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih上于/nuccore/NM_001247728下的NCBI NM_001247728番茄CD2(CD2)mRNA、完整的cds(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247728))編碼，或由SEQ ID NO:14中描述的野生型CD2基因組序列編碼。SEQ ID NO:10中描述了由該野生型CD2 mRNA編碼的野生型(功能性)蛋白質(zhì)序列。其由821個(gè)氨基酸組成。其他由等位基因(即賦予與SEQ ID NO:10的蛋白相同程度的角質(zhì)層發(fā)育，即當(dāng)果實(shí)處于成熟階段時(shí)為有光澤的番茄果實(shí)的等位基因)編碼的完全功能性CD2蛋白可能存在于其他番茄植物中并可能與SEQ ID NO:10具有基本序列同一性，即與SEQ ID NO:10至少約85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性。這類完全功能性野生型CD2蛋白在本文中被稱作SEQ ID NO:10的“變體”。同樣地，編碼這類完全功能性CD2蛋白的核苷酸序列被稱作SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14的變體，并且可能包括與SEQ ID NO:12或14的基本序列同一性，即與SEQ ID NO:12或14至少約70％、75％、85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性。

下面的突變myb12等位基因是myb12突變體的實(shí)例，所述myb12突變體與本發(fā)明所述的野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比，當(dāng)為純合形式時(shí)，在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期具有番茄果實(shí)的較淺顏色的表皮，和/或具有粉紅色番茄果實(shí)。

值得注意的是，本文提到的核苷酸序列(SEQ ID NO:4-6)是編碼SEQ ID NO:1-3的蛋白的cDNA，即編碼DNA序列。將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1，SEQ ID NO:4-6具有包括TAG終止密碼子在內(nèi)的1017個(gè)核苷酸。顯然，當(dāng)提到這些cDNA核苷酸序列時(shí)，應(yīng)理解，cDNA是相應(yīng)的番茄基因組myb12序列的編碼區(qū)，但是番茄基因組myb12序列還額外地包含內(nèi)含子，因此所述核苷酸具有不同的編號(hào)。因此，當(dāng)提到包含例如SEQ ID NO:4-6中的任一個(gè)的myb12序列的番茄植物時(shí)，應(yīng)理解，該番茄植物包含含有編碼DNA(cDNA)的基因組myb12序列，SEQ ID NO:4-6的mRNA是從該編碼DNA(cDNA)轉(zhuǎn)錄而來(并進(jìn)而被翻譯為蛋白質(zhì))。除了mRNA中的胸腺嘧啶(T)是尿嘧啶(U)之外，mRNA的核苷酸序列與cDNA相同。

此外，當(dāng)提到包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO:2或3的突變myb12蛋白)的核苷酸序列的番茄植物時(shí)，由于遺傳密碼的簡并性，其包含不同的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物包含SEQ ID NO:7中描述的基因組Myb12序列或與其基本相同的基因組Myb12序列(例如具有與SEQ ID NO:7至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性)，但在所述序列中，特別是所述基因組序列的外顯子的編碼序列(外顯子1的編碼序列的范圍為第1至134位核苷酸；外顯子2的范圍為第225至353位核苷酸，外顯子3的范圍為第1791至2140位核苷酸以及外顯子4的范圍為第2734至3137位核苷酸；將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1)中具有一個(gè)或多個(gè)突變，其編碼導(dǎo)致番茄果實(shí)的顏色較淺的表皮和/或無色的表皮的突變myb12蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因組序列編碼SEQ ID NO:2或3的突變myb12蛋白。

本發(fā)明所鑒定的在純合形式時(shí)賦予粉紅色的番茄果實(shí)和/或較淺顏色的表皮和/或無色表皮的一個(gè)示例性突變myb12等位基因(突變體2961，存在于種子保藏物NCIMB42087和NCIMB42268中)，包含導(dǎo)致在翻譯過程中產(chǎn)生60個(gè)氨基酸殘基的截短蛋白質(zhì)的突變，而野生型蛋白具有338個(gè)氨基酸殘基(參見SEQ ID NO:1)。SEQ ID NO:2描述了突變體2961的截短的蛋白序列。所述截短是由于SEQ ID NO:4的第182位核苷酸處的胸腺嘧啶(T)變?yōu)橄汆堰?A)，將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1。突變體2961中的這種T182A突變導(dǎo)致亮氨酸(即Leu或L)密碼子(TTG)變?yōu)榻K止密碼子(TAG)。這對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:7的第1305位的基因組DNA中從胸腺嘧啶(T)到腺嘌呤(A)的突變。SEQ ID NO:5描述了該突變cDNA。

本發(fā)明所鑒定的在純合形式時(shí)賦予粉紅色的番茄果實(shí)和/或較淺顏色的表皮和/或無色表皮的另一個(gè)示例性突變myb12等位基因(突變體5505，存在于種子保藏物NCIMB42088中)，包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:3)中第50位氨基酸從甘氨酸(Gly或G)變?yōu)榫彼?Arg或R)的突變，即G50R突變。SEQ ID NO:3描述了突變體5505的蛋白序列。所述氨基酸置換是由于SEQ ID NO:4的第148位核苷酸處從鳥嘌呤(G)到胞嘧啶(C)的突變，將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1(即G148C突變)。這對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:7的第1271位的基因組DNA中從鳥嘌呤到胞嘧啶的突變。SEQ ID NO:6描述了該突變cDNA。

下面的突變cd2等位基因是cd2突變體的實(shí)例，所述cd2突變體與本發(fā)明所述的野生型CD2等位基因純合型的番茄相比，當(dāng)突變cd2等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，具有有光澤的番茄果實(shí)(在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期)，即具有顯著增加的光澤度的果實(shí)。而且與野生型CD2等位基因(編碼野生型CD2蛋白)純合型——即缺少突變cd2等位基因(編碼突變cd2蛋白)——的番茄植物果實(shí)相比，當(dāng)突變cd2等位基因?yàn)殡s合形式時(shí)，果實(shí)具有顯著增加的光澤度。

因此，在一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄種栽培植物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的純合形式的myb12等位基因或包含純合形式的y(黃色)基因，并且包含純合或雜合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)缺乏(cd)等位基因，例如下文所述的突變cd2等位基因，與缺少所述突變cd-等位基因的植物(如缺少突變cd2等位基因的植物)的果實(shí)相比，所述突變cd-等位基因?qū)е鹿麑?shí)的(統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著)增加的光澤度。值得注意的是，本發(fā)明的番茄植物優(yōu)選地包含在選自cd1、cd2和cd3中僅一種cd基因的等位基因中的突變，即使可能存在多個(gè)不同CD基因的突變等位基因，因?yàn)閏d1、cd2和cd3為位于不同染色體上的單一性隱性基因(根據(jù)Isaacson et al.2009的記載，將cd2繪制(map)至染色體1，cd3繪制至染色體8以及cd1繪制至染色體11)。

值得注意的是，本文提到的核苷酸序列(SEQ ID NO:12、13、和16)分別是編碼下述蛋白的cDNA，即編碼DNA序列：SEQ ID NO:10的蛋白(野生型CD2蛋白)、SEQ ID NO:11的蛋白(具有G736V的突變cd2蛋白，即從甘氨酸(G或Gly)到纈氨酸(V或Val)，產(chǎn)生光澤度的氨基酸變化)，以及SEQ ID NO:15的蛋白(分別具有Q708H(即從谷氨酰胺(Q或Gln)到組氨酸(H或His))和D737N(即從天冬氨酸(D或Asp)到天冬酰胺(N或Asn))的突變cd2蛋白，產(chǎn)生光澤度的氨基酸變化)。將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1，SEQ ID NO:12、13和16具有包括TAA終止密碼子在內(nèi)的2466個(gè)核苷酸。顯然，當(dāng)提到這些cDNA核苷酸序列時(shí)，應(yīng)理解，cDNA是相應(yīng)的番茄基因組cd2序列的編碼區(qū)，但是番茄基因組cd2序列還額外地包含內(nèi)含子，因此所述核苷酸具有不同的編號(hào)。因此，當(dāng)提到包含例如SEQ ID NO:12、13、或16中任一個(gè)的cd2序列的番茄植物時(shí)，應(yīng)理解，該番茄植物包含含有編碼DNA(cDNA)的基因組cd2序列，SEQ ID NO:12、13、和16的mRNA分別是從該編碼DNA(cDNA)轉(zhuǎn)錄而來(并進(jìn)而被翻譯為蛋白質(zhì))。除了mRNA中的胸腺嘧啶(T)是尿嘧啶(U)之外，mRNA的核苷酸序列與cDNA相同。

此外，當(dāng)提到包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)(參與角質(zhì)層發(fā)育，特別是角質(zhì)生成中)(即SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15的突變cd2蛋白)的核苷酸序列的番茄植物時(shí)，由于遺傳密碼的簡并性，其包含不同的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物包含SEQ ID NO:14中描述的基因組CD2序列或與其基本相同的基因組CD2序列(例如與SEQ ID NO:14具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性)，但在所述序列中，特別是所述基因組序列的外顯子的編碼序列(外顯子1中的編碼序列范圍為第1至(并且包括)第204位核苷酸；外顯子2的范圍為第282至502位核苷酸，外顯子3的范圍為第600至715位核苷酸以及外顯子4的范圍為第809位核苷酸至第1494位核苷酸；外顯子5的范圍為第1617位核苷酸至第1717位核苷酸；外顯子6的范圍為第1819位核苷酸至第2032位核苷酸；外顯子7的范圍為第3417位核苷酸至第3591位核苷酸；外顯子8的范圍為第3718位核苷酸至第4086位核苷酸以及外顯子9的范圍為第4542位核苷酸至第4921位核苷酸；將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1)中具有一個(gè)或多個(gè)突變，其編碼導(dǎo)致在番茄果實(shí)發(fā)育的綠熟期(例如破色期、橙色期、或紅熟期)產(chǎn)生有光澤的番茄果實(shí)的突變cd2蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因組序列編碼SEQ ID NO:11的突變蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物包含SEQ ID NO:14中所描述的基因組CD2序列(在SEQ ID NO:14的第7171位核苷酸處含有從鳥嘌呤(G)到胸腺嘧啶(T)的突變(其導(dǎo)致如SEQ ID NO:11中所描述的G736V氨基酸變化))，或與其基本相同的基因組CD2序列。

本發(fā)明所鑒定的賦予有光澤的番茄果實(shí)的一個(gè)示例性突變cd2等位基因(如存在于突變體8.17中和突變體26428_001中)，包含導(dǎo)致在所編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:11)中第736位氨基酸處從甘氨酸(Gly或G)變?yōu)槔i氨酸(Val或V)的突變，即G736V突變。SEQ ID NO:11描述了突變體8.17(和突變體26428_001)的cd2蛋白序列。所述氨基酸置換是由于SEQ ID NO:12的第2207位核苷酸處從鳥嘌呤(G)到胸腺嘧啶(T)的突變，將起始密碼子ATG的A計(jì)數(shù)為核苷酸位置1(即G2207T突變)。SEQ ID NO:13描述了該突變cDNA。在SEQ ID NO:12的cDNA中G2207T突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:14的基因組DNA中G7171T突變。

因此，一方面，本發(fā)明的番茄植物包含純合或雜合形式的突變CD2等位基因，由此果實(shí)與缺少突變cd2等位基因的植物的果實(shí)相比，具有增加的光澤度，并且由此突變cd2等位基因編碼在第736位氨基酸處(或在變體中的等效位置處)包含纈氨酸的SEQ ID NO:10(或包含與SEQ ID NO:10的至少85％、90％、95％或更多的序列同一性的SEQ ID NO:10變體)的CD2蛋白。

本發(fā)明所鑒定的賦予有光澤的番茄果實(shí)的另一個(gè)示例性突變cd2等位基因(如存在于Isaacson et al(Isaacson et al,2009,The plant Journal 60,363-377)中的突變“cd2”；該論文中CD2的序列數(shù)據(jù)可在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫中由登錄號(hào)GQ222185找到)，包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:15)中第737位氨基酸處從天冬氨酸(Asp或D)變?yōu)樘於０?Asn或N)的突變，即D737N突變，并且額外地包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:15)中第708位氨基酸處從谷氨酰胺(Gln或Q)變?yōu)榻M氨酸(His或H)的突變，即Q708H突變。SEQ ID NO:15描述了這種“Isaacson 2009”cd2蛋白序列。值得注意的是，在結(jié)果部分中，Isaacson等人記載了他們的僅包含G736R突變的cd2突變體(Isaacson et al,2009,The plant Journal 60,363-377，第372頁左欄)。包含由Isaacson 2009記載的突變cd2等位基因的植物株系(株系e4393m2)可從康奈爾大學(xué)的“制備番茄的基因”種質(zhì)庫(‘Genes that make tomatoes’collection)中得到。或者，可通過誘導(dǎo)突變重新產(chǎn)生包含具有一個(gè)或兩個(gè)氨基酸置換的等位基因的植物。

因此，在另一方面，本發(fā)明的番茄植物包含純合或雜合形式的突變cd2等位基因，由此果實(shí)與缺少突變cd2等位基因的植物的果實(shí)相比，具有增加的光澤度，并且由此突變cd2等位基因編碼在第737位氨基酸處(或在變體中的等效位置處)包含天冬酰胺和/或在第708位氨基酸處(或在變體中的等效位置處)包含組氨酸的SEQ ID NO:10(或包含與SEQ ID NO:10的至少85％、90％、95％或更多的序列同一性的SEQ ID NO:10變體)的CD2蛋白。

如Isaacson et al,2009(The plant Journal 60,363-377)中所公開的，其他示例性突變角質(zhì)缺乏等位基因是cd1和cd3。包含突變cd1等位基因的植物株系(株系e4247m1)或突變cd3等位基因的植物株系(株系n3056m1)可從康奈爾大學(xué)的‘制備番茄的基因’種質(zhì)庫中得到。

如在Petit et al(Plant Physiology 2014vol 164pp 888-906)中所公開的其他有光澤的植物，例如突變體P23C10、P32H5、P8A12、P5E1、P4B6、P30B6、P6A2、P3H6、P4E2、P15C12、P30A12、P18H8、P17F12、P23F12、P11H2和P26E8的(如在Petit et al中列出，參見上文，表1中有光澤的植物下)。

本文中的“突變等位基因”是指與野生型等位基因相比在編碼序列(mRNA、cDNA或基因組序列)中含有一個(gè)或多個(gè)突變的等位基因。這類突變(例如，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、倒位、缺失和/或替換)可導(dǎo)致所編碼的蛋白具有降低的體外和/或體內(nèi)功能(功能降低)或沒有體外和/或體內(nèi)功能(功能喪失)，例如，由于所述蛋白例如被截短或者具有其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、插入或替換的氨基酸序列。這類改變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有不同的3D構(gòu)象、被靶向到不同的亞細(xì)胞區(qū)室、具有經(jīng)修飾的催化結(jié)構(gòu)域、具有經(jīng)修飾的對(duì)核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合活性等。

本文中的“野生型植物”和“野生型果實(shí)”或“正常成熟”的植物/果實(shí)是指包含編碼完全功能性Myb12蛋白的野生型(WT或Wt)Myb12等位基因的兩個(gè)拷貝(Myb12/Myb12)的番茄植物(例如不同于包含純合形式的突變myb12等位基因的“突變植物”)。本文中“野生型果實(shí)光澤度”或“正常果實(shí)光澤度”或“正常光澤度”是指包含正常角質(zhì)層，例如包含編碼功能性CD蛋白質(zhì)的CD1、CD2和/或CD3基因的野生型(WT或Wt)CD等位基因的兩個(gè)拷貝(即CD1/CD1,CD2/CD2和CD3/CD3)的番茄植物；特別是包含編碼完全功能性CD2蛋白的野生型CD2等位基因(CD2/CD2)的植物(例如不同于包含純合形式的突變cd2等位基因的“突變植物”)。這些植物為例如在表型測定中的合適的對(duì)照。優(yōu)選地，野生型和/或突變植物為“栽培的番茄植物”。例如栽培種Moneymaker是野生型植物，栽培種Ailsa Craig、栽培種Tapa、M82以及許多其他的野生CD1、CD2和/或CD3等位基因(編碼完全功能性CD蛋白質(zhì))純合型的栽培種都是野生型植物。

“番茄植物”或“栽培的番茄植物”是這樣的番茄的植物：即人工栽培并具有優(yōu)良的農(nóng)藝學(xué)特征的番茄種的品種、育種系或栽培種；優(yōu)選地，這類植物不是“野生植物”，所述野生植物即一般具有比栽培植物差得多的產(chǎn)量和差得多的農(nóng)藝學(xué)特征以及例如在野生群中天然生長的植物?！耙吧参铩卑ɡ缥锓N的生態(tài)型、PI(植物引種)系、當(dāng)?shù)仄贩N(landrace)或野生種質(zhì)(accession)或野生近緣種(relative)。所謂的傳統(tǒng)品種(heirloom variety)或栽培種——即，通常在人類歷史的較早時(shí)期被種植并通常被改造為適于特定地理區(qū)域的自由授粉品種或栽培種——在本文中作為栽培番茄植物被涵蓋在本發(fā)明的一個(gè)方面中。

番茄的野生近緣種包括：S.arcanum、克梅留斯基番茄(S.chmielewskii)、小花番茄(S.neorickii(＝L.parviflorum))、契斯曼尼番茄(S.cheesmaniae)、多腺番茄(S.galapagense)、細(xì)葉番茄(S.pimpinellifolium)、智利番茄(S.chilense)、S.corneliomulleri、多毛番茄(S.habrochaites(＝L.hirsutum)、S.huaylasense、赤茄(S.sisymbriifolium)、秘魯番茄(S.peruvianum)、多毛番茄(S.hirsutum)或潘那利番茄(S.pennellii)。

本文中“平均”或“平均值”是指算術(shù)平均值，并且這兩個(gè)術(shù)語可交換使用。因此，術(shù)語“平均”或“平均值”是指若干個(gè)測量值的算術(shù)平均值。技術(shù)人員應(yīng)理解植物株系或品種的表型在一定程度上取決于生長條件，因此，測量至少5、10、15、20、30或更多植物(或植物部分)的算術(shù)平均值，優(yōu)選地在隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中進(jìn)行——具有數(shù)個(gè)重復(fù)并且在相同實(shí)驗(yàn)中的相同條件下生長的合適的對(duì)照植物?！敖y(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”或“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地”不同或“顯著地”不同是指這樣的植物株系或品種的特征，即其在與合適的對(duì)照物或?qū)Ρ任锵啾葧r(shí)，顯示出與對(duì)照物或?qū)Ρ任?的平均值)的該特征具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(例如，使用ANOVA時(shí)，p值小于0.05，p<0.05)。

顏色(colour)和顏色(color)可互換使用。

在本文中術(shù)語“產(chǎn)生具有某些表型性狀的果實(shí)的番茄植物”與“能夠產(chǎn)生具有某些表型性狀的果實(shí)的番茄植物”可交換使用，并且是指能夠產(chǎn)生果實(shí)的(栽培的)番茄植物。具體說明的表型性狀僅在果實(shí)上可見，而不必于植物自身上可見。

序列表說明

SEQ ID NO:1示出了源自基于NCBI EU419748番茄MYB12(MYB12)mRNA(完整的cds http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171466740)的mRNA的番茄野生型、完全功能性MYB12蛋白序列。

SEQ ID NO:2示出番茄突變體2961myb12蛋白序列。

SEQ ID NO:3示出番茄突變體5505myb12蛋白序列。

SEQ ID NO:4示出了基于NCBI EU419748番茄MYB12(MYB12)mRNA(完整的cds http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171466740)的mRNA的番茄野生型Myb12cDNA。

SEQ ID NO:5示出番茄突變體2961 Myb12 cDNA序列。

SEQ ID NO:6示出番茄突變體5505 Myb12 cDNA序列。

SEQ ID NO:7示出了與SEQ ID NO:1和4相同來源的番茄野生型Myb12基因組DNA。

SEQ ID NO:8示出了突變體5058 myb12蛋白序列，其不影響果實(shí)的表皮顏色。

SEQ ID NO:9示出了突變體6899 myb12蛋白序列，其不影響果實(shí)的表皮顏色。

SEQ ID NO:10示出了源自基于NCBI NM_001247728番茄CD2(CD2)mRNA(完整的cds在萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih上/nuccore/NM_001247728下(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247728))的mRNA的番茄野生型、完全功能性CD2蛋白序列。

SEQ ID NO:11示出了番茄突變體26428_001cd2蛋白序列。

SEQ ID NO:12示出了基于NCBI NM_001247728番茄CD2(CD2)mRNA(完整的cds在萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih上/nuccore/NM_001247728下(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001247728))的番茄野生型、完全功能性Cd2cDNA。

SEQ ID NO:13示出了番茄突變體26428_001 cd2 cDNA序列。

SEQ ID NO:14示出了與SEQ ID NO:10和12相同來源的番茄野生型Cd2基因組DNA。對(duì)應(yīng)的突變體26428_001 cd2基因組DNA在第7171位處包含胸腺嘧啶(T)而不是如野生型序列中的鳥嘌呤(G)，即在SEQ ID NO:14中的G7171T突變。

SEQ ID NO:15示出了Isaacson等人的番茄突變體cd2蛋白序列(見上文)；Genbank EMBL ACCESSION GQ222185版本GQ222185.1 GI:255529748http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/gq222185。

SEQ ID NO:16示出了Isaacson等人的番茄突變體cd2 cDNA序列(見上文)；Genbank EMBL ACCESSION GQ222185版本GQ222185.1 GI:255529748http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/gq222185。

附圖說明

圖1：正常(野生型)和突變果實(shí)的番茄果皮(表皮)的圖。野生型果實(shí)的表皮中具有黃色/橙色化合物，突變體1(即突變體2961，編碼SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)的myb12等位基因純合型)中缺少所述化合物并具有無色的皮。當(dāng)突變myb12等位基因以雜合形式存在時(shí)，突變體2(即突變體5505)顯示出黃色/橙色番茄果皮，當(dāng)突變myb12等位基因(編碼SEQ ID NO:3的蛋白質(zhì))以純合形式存在時(shí)，顯示出無色的皮。在純合形式中，果實(shí)主要為粉紅色；僅在果實(shí)與植物連接部位的周圍，表皮確實(shí)包含一些黃色/橙色化合物，而在果實(shí)的其余部分，表皮中不存在此化合物。

圖2：Wt Myb12蛋白(SEQ ID NO:1)、突變體2961 myb12蛋白(SEQ ID NO:2)、突變體5505 myb12蛋白(SEQ ID NO:3)和其他兩種非粉紅色，即“正常紅色”植物的Myb12蛋白(命名為5058(SEQ ID NO:8)和6899(SEQ ID NO:9))的氨基酸序列的表格。

圖3：正常和突變果實(shí)的在紅熟期時(shí)的番茄果實(shí)的圖(關(guān)于粉紅色和光澤性狀)。上層示出了紅色的番茄果實(shí)(例如野生型Myb12等位基因純合型的(Myb12/Myb12)或野生型Myb12等位基因雜合型的(Myb12/myb12)；下層示出了來自突變myb12等位基因純合型(myb12/myb12)(如存在于突變體2961中)的植物的番茄果實(shí)；從左向右，番茄果實(shí)為野生型CD2等位基因純合型的(CD2/CD2)、如在突變體26428_001的植物中存在的突變型cd2等位基因雜合型的(CD2/cd2)，以及如在突變體26428_001的植物中存在的突變型cd2等位基因純合型的(cd/cd2)。

圖4：野生型和突變番茄CD2蛋白序列與在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/gq222185下由Isaacson et al The Plant Journal,2009,Vol 60,pp 363-377提交并記載于Isaacson et al The Plant Journal,2009,Vol 60,pp 363-377中的突變CD2蛋白序列的差異。

具體實(shí)施方式

最廣義上，本發(fā)明涉及導(dǎo)致‘粉紅色’果實(shí)顏色的等位基因與導(dǎo)致果實(shí)的‘光澤度’顯著增加和/或果實(shí)角質(zhì)層的角質(zhì)量顯著增加或減少的突變的組合。在一方面，角質(zhì)層厚度顯著增加和/或減小，將導(dǎo)致光澤度的增加或減少。因此，在一方面，本發(fā)明分別涉及導(dǎo)致‘粉紅色’果實(shí)顏色的等位基因與導(dǎo)致果實(shí)的‘光澤度’顯著增加和/或果實(shí)角質(zhì)層的角質(zhì)量顯著增加或減少和/或果實(shí)角質(zhì)層顯著增厚或變薄的突變的組合(即具有較高角質(zhì)量的較厚角質(zhì)層，以及具有較低角質(zhì)量的較薄角質(zhì)層)。所以將用于粉紅色的任何突變等位基因(本文所述的myb12突變體和y基因)與用于光澤度和/或角質(zhì)積累的突變等位基因(特別是CD1、CD2或CD3基因的突變等位基因)組合。盡管在本文中于不同的方面描述了粉紅色和有光澤的突變體，但是應(yīng)理解，指的是在單一植物(株系或品種)的基因組中，或在這種單一植物(株系或品種)的細(xì)胞中的遺傳組合，其導(dǎo)致粉紅色光澤的果實(shí)。本文也涵蓋適于產(chǎn)生F1代雜種的親本株系(例如近交系)，所述F1代雜種產(chǎn)生粉紅色且有光澤的果實(shí)。所述親本株系可為突變myb12等位基因或y基因雜合型的，只要F1雜種為myb12或y基因純合型的以表達(dá)粉紅色。

因此，在一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄種的栽培植物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，或包含純合形式的y(黃色)基因并且包含純合或雜合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)缺乏(cd)等位基因，與缺少所述突變cd-等位基因的植物的果實(shí)相比，所述突變cd-等位基因?qū)е鹿麑?shí)的光澤度增加。

本發(fā)明公開了一種(能夠)產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄種的栽培植物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，并且在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因(特別是選自CD1、CD2和CD3基因)中包含突變；與野生型植物(即在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變的植物)相比，所述突變導(dǎo)致在紅熟期的角質(zhì)累積增加或減少至少15％；和/或在一方面，角質(zhì)層分別增厚至少15％或變薄至少15％；和/或與野生型植物(即在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變(即具有參與角質(zhì)層發(fā)育的完全功能性等位基因，如完全功能性CD基因)的植物)相比，所述突變導(dǎo)致果實(shí)光澤度的顯著增加。

在一方面，能夠產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的本發(fā)明的植物包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因(本文中也稱作“突變myb12等位基因”)，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白。在另一方面，所述具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因具有選自以下的突變：編碼區(qū)中的突變、非編碼區(qū)中的突變、myb12等位基因的啟動(dòng)子中的突變、以及調(diào)節(jié)myb12等位基因表達(dá)的基因中的突變。在另一方面，導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變?yōu)橐饄突變表型(即由于如本領(lǐng)域已知的調(diào)節(jié)基因的突變)的突變(例如Adato et al 2009 PLoS Genetics,Vol 5issue 12,e1000777)。

在另一方面，導(dǎo)致在能夠產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的本發(fā)明植物中產(chǎn)生突變myb12蛋白或較低的myb12蛋白水平的突變?yōu)閙yb12等位基因中的突變。應(yīng)理解，所述較低的myb12蛋白水平是與缺少所述包含一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因的植物相比較。

導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變。優(yōu)選地，除myb12等位基因之外，缺少所述突變的植物與本發(fā)明的植物具有相同的遺傳組成。在另一方面，myb12等位基因中的這種突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白。

在另一方面，能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的本發(fā)明植物包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1(即相對(duì)于SEQ ID NO:1的野生型蛋白)中具有G50R氨基酸置換，或在SEQ ID NO:1的(功能性)變體(即相對(duì)于SEQ ID NO:1的野生型蛋白的功能性變體)中具有G50R氨基酸置換，除了與具有所述G50R氨基酸置換的SEQ ID NO:1的序列同一性之外，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少約85％的氨基酸序列同一性；或者與SEQ ID NO:1具有至少約90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性；或者，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1(即相對(duì)于SEQ ID NO:1的野生型蛋白)中包含氨基酸61至338的缺失，或在其(功能性)變體(即相對(duì)于SEQ ID NO:1的野生型蛋白的功能性變體)中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少約85％的氨基酸序列同一性；或者與SEQ ID NO:1具有至少約90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，或者所述變體與SEQ ID NO:1的氨基酸1至60具有至少95％(例如96％、97％、98％、99％)的氨基酸序列同一性。換言之，所述突變myb12蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至60，或包含SEQ ID NO:1的功能性變體的氨基酸1至60，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少約85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。當(dāng)提到在SEQ ID NO:1的(功能性)變體中具有G50R氨基酸置換的突變myb12蛋白時(shí)，這樣的SEQ ID NO:1的(功能性)變體除具有G50R置換外，還與SEQ ID NO:1具有至少約85％的氨基酸序列同一性；或與SEQ ID NO:1具有至少約90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。換言之，G50R置換必須存在于SEQ ID NO:1的變體中，從而使得所述變體成為本發(fā)明的功能降低的myb12蛋白。

應(yīng)當(dāng)理解，無論何時(shí)提到這樣的SEQ ID NO:1的(功能性)變體(所述變體與SEQ ID NO:1具有至少約85％的氨基酸序列同一性(或任何其他的百分比序列同一性)并且具有所述G50R氨基酸置換)，則由于在SEQ ID NO:1的變體中可能出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或插入，因此G至R氨基酸置換的位置可以變化某些氨基酸位置，例如氨基酸位置-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、+5。還應(yīng)理解，無論何時(shí)提到具有特定位置處的突變的其他序列的變體時(shí)，該原理均適用。

在另一方面，能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的本發(fā)明的植物包含y(黃色)等位基因，所述植物包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生較少量的myb12蛋白。

SEQ ID NO:1的變體是否是功能性的可從表型上測試，即通過確定編碼SEQ ID NO:1的變體的等位基因純合型的番茄植物是否在果實(shí)發(fā)育的紅熟期在番茄果實(shí)上產(chǎn)生有顏色的(黃色-橙色)表皮，在這種情況下其是功能性Myb12蛋白。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的栽培番茄植物，其中當(dāng)突變myb12等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，所述突變導(dǎo)致所述植物的果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期顯示出粉紅色外觀。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的本發(fā)明的栽培番茄植物，其中當(dāng)突變myb12等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)或當(dāng)y基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，與野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比，所述突變導(dǎo)致所述植物的果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期顯示出粉紅色外觀。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的栽培番茄植物，其中當(dāng)突變myb12等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，與野生型Myb12等位基因(即編碼SEQ ID NO:1的蛋白的基因)純合型的番茄植物的表皮相比，所述突變導(dǎo)致所述植物的果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期顯示出番茄果實(shí)的顏色更淺的表皮，或無色的表皮。

在一方面，本發(fā)明涉及包含一個(gè)或兩個(gè)拷貝(即純合或雜合形式)的myb12等位基因的本發(fā)明的栽培番茄植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，所述myb12等位基因發(fā)現(xiàn)于并可來源于或可獲自(或來源于或獲自)以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的種子。在雜合形式中，另一個(gè)等位基因可以是野生型Myb12等位基因或另一突變myb12等位基因，例如來自本文提供的其他Myb12突變體中的任意一個(gè)，或者編碼本文所述的功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白的任何其他突變myb12等位基因。因此，在雜合形式中，其他等位基因可以是功能降低或功能喪失的myb12等位基因。如果兩個(gè)等位基因都是功能降低或功能喪失的myb12等位基因，則表皮將是無色的，或相比于野生型Myb12等位基因純合型的植物，或相比于包含一個(gè)拷貝(雜合型)的功能性(野生型或變體)Myb12等位基因的植物，表皮具有顯著降低的色素沉著。

在一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)可通過將其種子以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物與另一種番茄植物雜交而獲得；在另一方面，這樣的另一種植物為能夠產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)可通過以下方式從其種子以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物而獲得：通過將從所述種子中生長出的植物與另一種番茄植物雜交；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)可通過將其種子以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物與另一種番茄植物雜交而獲得；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物。

因此，可通過傳統(tǒng)育種將NCIMB 42087或NCIMB 42088的突變myb12等位基因——其在純合形式時(shí)賦予無色果皮表型——轉(zhuǎn)移到任何其他番茄植物中，以在將所述等位基因轉(zhuǎn)移到紅色果肉的番茄中時(shí)產(chǎn)生粉紅色果實(shí)的品種。還可將所述突變等位基因轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生其他果肉顏色(如黃色、綠色、橙色等)的番茄植物中。有若干決定果肉的顏色的基因座(參見Sacks and Francis 2001,J.Amer.Soc.Hort.Sci.126(2):221-226)。然而，在一方面，將其與產(chǎn)生紅色果肉顏色的番茄植物結(jié)合以在紅熟期得到果實(shí)的整體粉紅色外觀。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)包含突變myb12等位基因，所述突變myb12等位基因例如在以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的種子中的突變myb12等位基因。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)可通過將其種子以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物與另一種番茄植物雜交而得到；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物，即包含參與角質(zhì)層發(fā)育中的基因的突變等位基因，特別是包含選自基因CD1、CD2和CD3的突變CD基因的植物?？梢赃x擇這樣的雜交后代：其包含純合形式的兩個(gè)突變myb12等位基因(或y基因)(例如，如上所述)，并且其包含突變cd-等位基因，特別是在由所述等位基因編碼的CD1、CD2或CD3蛋白中包含突變的突變cd1、cd2或cd3等位基因，由此所述植物產(chǎn)生的果實(shí)具有粉紅色且有光澤的表型。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))可從其種子以登錄號(hào)NCIMB 42087保藏的植物與另一種番茄植物中獲得；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物(特別是包含純合或雜合形式的突變cd等位基因(例如cd1、cd2或cd3)的植物)。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))可從其種子以登錄號(hào)NCIMB 42088保藏的植物與另一種番茄植物中獲得；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物(特別是包含純合或雜合形式的突變cd等位基因(例如cd1、cd2或cd3)的植物)。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))可通過將其種子以登錄號(hào)NCIMB 42088保藏的植物與另一種番茄植物的雜交而得到；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物(特別是包含純合或雜合形式的突變cd等位基因(例如cd1、cd2或cd3)的植物)。

在另一方面，本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))可通過將其種子以登錄號(hào)NCIMB 42087保藏的植物與另一種番茄植物的雜交而得到；在另一方面，這樣的另一種植物為產(chǎn)生有光澤番茄果實(shí)的植物(特別是包含純合或雜合形式的突變cd等位基因(例如cd1、cd2或cd3)的植物)。

在另一方面，在本發(fā)明的植物中，具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因以純合形式存在。

在一方面，在本發(fā)明的植物中，具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因以雜合形式存在。

在一方面，所述y基因是純合形式。

在一方面，本發(fā)明公開了(能夠)產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄種栽培植物，其包含純合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因(導(dǎo)致無色果實(shí)表皮或具有顯著降低的色素沉著的表皮)，并且還包含純合或雜合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(Cuticle Deficiency(cd))等位基因，與缺少所述突變cd-等位基因的植物的果實(shí)相比，所述突變cd-等位基因?qū)е鹿麑?shí)的光澤度增加。在一方面，所述突變cd等位基因是本文中其他處所述的等位基因之一，特別是突變cd2等位基因，如編碼SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15蛋白的等位基因。增加的光澤度可通過多種方法進(jìn)行例如在視覺上或定量測量，例如通過使用Gloss Meter如實(shí)施例中所述測量光反射。平均果實(shí)光澤度優(yōu)選地比野生型果實(shí)(缺少突變cd-等位基因/包含野生型，完全功能性CD等位基因)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高。因此，平均光澤度優(yōu)選地為野生型(無光澤、暗淡)果實(shí)(如品種M82、Moneymaker或其他品種的果實(shí))的平均光澤度的至少1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍或更多。

在一方面，本發(fā)明公開了(能夠)產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的番茄種栽培植物，其包含純合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因(導(dǎo)致無色果實(shí)表皮或具有顯著降低的色素沉著的表皮)，并且在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中還包含突變(例如CD基因的突變等位基因)；與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變的植物相比，所述突變導(dǎo)致在紅熟期(RR)的角質(zhì)累積增加或減少至少15％(例如增加或減少至少約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％，或甚至至少90％、95％、97％、98％)；和/或在另一方面，與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變的植物相比，所述的在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因(如CD基因的突變等位基因)中的突變導(dǎo)致角質(zhì)層增厚至少15％或變薄至少15％(例如分別增厚或變薄至少約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％，或甚至至少90％、95％、97％、98％)。因此，在一方面，與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變的植物的果實(shí)相比，所述的在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因(如CD基因的突變等位基因)中的突變導(dǎo)致在RR期果實(shí)的角質(zhì)層的平均角質(zhì)含量(在統(tǒng)計(jì)學(xué)上)顯著地增加或減少，并且果實(shí)的平均角質(zhì)層厚度(在統(tǒng)計(jì)學(xué)上)顯著地增加或減少。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述突變所導(dǎo)致的在紅熟期(RR)的角質(zhì)累積增加和/或減少或者角質(zhì)層厚度增加或減少至少15％(例如增加或減少至少約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％，或甚至至少90％、95％、97％、98％)是與野生型植物例如M82或Moneymaker或TAPA進(jìn)行比較的。

在另一方面，角質(zhì)的累積和/或角質(zhì)層厚度是和與本發(fā)明植物具有相同遺傳學(xué)的植物(除了參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變以外)進(jìn)行比較。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中角質(zhì)的量和/或角質(zhì)層厚度小于正常的番茄種栽培植物的70％。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中角質(zhì)的量和/或角質(zhì)層厚度小于包含兩種野生型CD等位基因(例如CD2/CD2)的植物(如M82(例如正常/野生型植物))的90％、85％，或小于它的70％。例如，角質(zhì)的量和/或角質(zhì)層厚度小于正常的番茄種栽培植物(缺少突變cd-等位基因)的65％，例如60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％，或甚至小于它的10％或甚至小于5％或甚至小于4％或3％或2％。在另一方面，角質(zhì)的量和/或角質(zhì)層厚度小于M82的65％，例如60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、或甚至小于它的10％或甚至小于5％、甚至小于4％、或3％或2％。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中在紅熟期(RR)角質(zhì)的平均量小于850μg cm^-2或小于700μg cm^-2，或小于600或500μg cm^-2。例如角質(zhì)層厚度小于450μg cm^-2，例如小于400μg cm^-2、或小于350μg cm^-2、或小于300μg cm^-2、或小于250μg cm^-2、或小于200μg cm^-2、或小于150μg cm^-2、或甚至小于100μg cm^-2、或小于50μg cm^-2、或小于40μg cm^-2、或小于20μg cm^-2(在紅熟期)。

果實(shí)角質(zhì)層的角質(zhì)(平均)量可以通過如Isaacson et al.2009(見上文)，第375頁于Cutin monomer and wax analysis中所記載的測量角質(zhì)單體的水平來測量。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中在紅熟期(RR)的平均角質(zhì)層厚度小于11μm、10μm、8μm、6μm、4μm或甚至小于2μm。所述角質(zhì)層厚度(或‘角質(zhì)膜’)可以通過例如透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)或光顯微鏡測量，如Isaacson et al.2009(見上文)，第374和375頁于相同主題中所記載的。

如已經(jīng)提到的，在一方面，平均角質(zhì)含量和平均角質(zhì)層厚度這兩者均受突變等位基因的影響，即以選自兩個(gè)列表的任何組合將上述兩者的數(shù)值組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中在紅熟期(RR)果實(shí)的光澤度水平是在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變(例如突變cd1、cd2或cd3等位基因)的相同株系或野生型植物的果實(shí)的光澤度水平的至少1.3倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，光澤度水平是與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變但產(chǎn)生粉紅色果實(shí)的相同株系(具有相同遺傳學(xué))的植物進(jìn)行比較。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中在紅熟期(RR)粉紅色果實(shí)的光澤度水平是在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變的相同株系或野生型植物的果實(shí)的光澤度水平的至少1.3倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，光澤度水平是與在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中缺少突變但產(chǎn)生粉紅色果實(shí)的相同株系(即具有相同遺傳學(xué))的植物進(jìn)行比較。

Isaacson等人(參見上文)公開了角質(zhì)層厚度減小(參見例如Discussion，第5行“dramatic reduction in cutin content”)和高度有光澤的表型的3種突變系(cd1、cd2和cd3)。這些突變體獲自“制備番茄的基因”種質(zhì)庫(Menda et al,2004,In silico screening of a saturated mutation library of tomato,Plant Journal 38,pp 861-872)。Isaacson將cd2的因果突變(causal mutation)繪制至番茄染色體1。他們聲稱所述因果突變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的G736R。但是這與他們在文章末尾中提到的蛋白質(zhì)序列(即GenBank/EMBL登錄號(hào)GQ222185)不一致。所述Genbank蛋白質(zhì)序列并未顯示出G736R突變，而是顯示出與野生型蛋白質(zhì)序列(如SEQ ID NO:10描述的)相比的另外兩處突變：在野生型cd2序列的第708位，谷氨酰胺(Q或Gln)被組氨酸(H或His)替換(即Q708H突變)；此外，737位天冬氨酸(D或Asp)被天冬酰胺(N或Asn)替換(即D737N突變)。

本發(fā)明人還鑒定了包含CD2基因中的突變并且導(dǎo)致比缺少突變的野生型植物具有更明顯光澤的果實(shí)的突變植物，然而該突變體具有與Isaacson 2009的突變體不同的氨基酸置換，即G736V氨基酸置換。將G736V突變體與不同的myb12突變體(粉紅色突變體)結(jié)合，導(dǎo)致番茄果實(shí)呈現(xiàn)為(producing)有光澤的粉紅色果實(shí)。

因此，本發(fā)明在一方面涉及本發(fā)明的植物，即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物，其中參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變在CD1、CD2、或CD3基因的等位基因中(例如，如Isaacson et al所公開的，見上文，或本文中其他處所述)。由于突變，編碼的CD1、CD2或CD3蛋白包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入或缺失，因此果實(shí)光澤度顯著增加和/或果實(shí)角質(zhì)層的角質(zhì)水平顯著增加或降低和/或角質(zhì)層厚度顯著增加或減??；或其中在參與角質(zhì)層發(fā)育的CD2等位基因中的突變導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其(SEQ ID NO:10)變體中的G736V(甘氨酸至纈氨酸的置換)氨基酸置換(如SEQ ID NO:11所示)，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％,80％,85％,90％,95％或更多的氨基酸序列同一性(并且其變體在氨基酸736位具有纈氨酸)；或其中在參與角質(zhì)層發(fā)育的CD2等位基因中的突變導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10變體中的Q708H(谷氨酰胺至組氨酸)和/或D737N(天冬氨酸至天冬酰胺)氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更多的氨基酸序列同一性。具有Q708H和D737N氨基酸置換的SEQ ID NO:10的氨基酸序列被公開于SEQ ID NO:15中，并且可從Isaacson et al,2009(The plant Journal 60,363-377)所記載的植物而得到，例如通過將株系e4393m2e(來自康奈爾大學(xué)的“制備番茄的基因”種質(zhì)庫)與缺少所述突變基因的野生型番茄植物雜交而得到。即可使用常規(guī)育種將突變cd2等位基因轉(zhuǎn)移到其他番茄植物中?；蛘?，可使用例如TILLING的方法來鑒定包含適合于提高粉紅色果實(shí)光澤度的突變cd2等位基因的植物(包含突變myb12等位基因或y基因)。

類似地，突變cd1和cd3等位基因可從包含突變cd1等位基因的植物株系(株系e4247m1)或突變cd3等位基因(株系n3056m1)的植物株系中獲得，所述植物株系均可從來自康奈爾大學(xué)的“制備番茄的基因”種質(zhì)庫中得到。或者，可將cd1和cd2克隆且測序，此后可以使用誘變重新生成提高光澤度的突變等位基因(和包含所述等位基因的植物)。番茄CD1序列也可以從GenBank登錄號(hào)AEJ88779.1(蛋白質(zhì))和JF968592(基因組DNA)得到，因此基于該序列可以鑒定在CD1靶基因中導(dǎo)致果實(shí)光澤度提高的TILLING突變體。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含突變cd2等位基因的本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生(編碼)在SEQ ID NO:10或其(即SEQ ID NO:10的)變體中包含G736V氨基酸置換的cd2蛋白，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少70％的氨基酸序列同一性并且具有所述G736V氨基酸置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.5％的序列同一性，包含第736位纈氨酸，并且與野生型(功能性)變體CD2蛋白相比賦予果實(shí)提高的光澤度。

當(dāng)提到具體的突變時(shí)，例如序列“變體”中的G736V，應(yīng)理解所述氨基酸編號(hào)/位置不必相同，即SEQ ID NO:11的736位的纈氨酸在變體中可能具有不同的位置編號(hào)。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地鑒定其是否為變體中的等同氨基酸，例如通過查看在突變之前和之后例如5個(gè)氨基酸的片段(例如VVMNGVDSAYV)或通過彼此比對(duì)序列。因此當(dāng)恰當(dāng)?shù)貎蓛杀葘?duì)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員因高度氨基酸序列同一性(至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.5％的蛋白質(zhì)同一性)而能夠鑒定變體蛋白質(zhì)中的等同氨基酸。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其包含編碼CD2蛋白的突變cd2等位基因，所述CD2蛋白在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的變體中具有Q708H和/或D737N氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸同一性并且具有所述Q708H和/或D737N氨基酸置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.5％或99.9％的氨基酸序列同一性，并且與野生型(功能性)變體CD2蛋白相比，賦予果實(shí)提高的光澤度。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含突變cd2等位基因的本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述突變cd2等位基因編碼SEQ ID NO:13或其變體的mRNA，所述變體與SEQ ID NO:13具有70％的氨基酸序列同一性并且在第2207位具有胸腺嘧啶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體與SEQ ID NO:13具有至少75％、80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.5％或99.9％的序列同一性，并且編碼賦予提高的光澤度的突變cd2蛋白。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含突變cd2等位基因的本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述突變cd2等位基因編碼SEQ ID NO:12或其變體的mRNA，所述變體與SEQ ID NO:12具有70％的氨基酸序列同一性并且具有所述G2207T核苷酸置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體與SEQ ID NO:12具有至少75％、80％，例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少99.5％或99.9％的序列同一性，并且編碼賦予提高的光澤度的突變cd2蛋白。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述植物包含編碼SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15的突變cd2蛋白的核苷酸序列。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述植物包含編碼SEQ ID NO:10的CD2蛋白的核苷酸序列，所述CD2蛋白包含一個(gè)或多個(gè)以下的氨基酸置換：G736V、D737N和/或Q708H。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述植物包含與SEQ ID NO:14基本相同的基因組cd2序列，尤其是與SEQ ID NO:14具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％的序列同一性，并且編碼SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因組cd2序列包含在SEQ ID NO:14的第7171位核苷酸處的從鳥嘌呤(g)到胸腺嘧啶(t)(G7171T)的突變。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述突變cd2等位基因是雜合形式。由于發(fā)現(xiàn)CD2/cd2植物產(chǎn)生比野生型CD2/CD2植物顯著更有光澤的果實(shí)，因此本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案也使用雜合形式的突變cd等位基因，例如CD2/cd2(或CD1/cd1；CD3/cd3)，其與突變myb12等位基因(優(yōu)選地以純合形式)或y基因(優(yōu)選地以純合形式)結(jié)合，產(chǎn)生粉紅色光澤的果實(shí)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中所述突變cd2等位基因是純合形式。由于發(fā)現(xiàn)cd2/cd2植物產(chǎn)生非常有光澤的果實(shí)，比包含野生型CD2/CD2等位基因的植物的果實(shí)有光澤得多，因此本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案也使用純合形式的突變cd等位基因，例如cd2/cd2(或cd1/cd1；cd3/cd3)，其與突變myb12等位基因(優(yōu)選地以純合形式)或y基因(優(yōu)選地以純合形式)結(jié)合，產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)。

值得注意的是，盡管由于cd基因在不同的染色體上而可能產(chǎn)生多個(gè)突變cd基因的堆疊(stacking)，但是在一方面，粉紅色等位基因與參與角質(zhì)層發(fā)育的選自CD1基因、CD2基因或CD3基因中的僅一種基因的突變體結(jié)合。因此，將CD1基因、CD2基因或CD3基因(的突變等位基因)的任意一種與突變myb12等位基因或y基因結(jié)合于番茄植物中，而所述番茄植物包含其他CD基因的野生型(功能性)等位基因(例如，如果以純合或雜合形式使用突變cd2等位基因，CD1和CD3基因是野生型、功能性的)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變?yōu)橐訬CIMB 42268保藏的種子中存在的突變cd2等位基因中的突變。可使用傳統(tǒng)育種以將該等位基因與突變myb12等位基因或y基因結(jié)合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)，其中在參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變?yōu)橐訬CIMB 42269保藏的種子中存在的突變cd2等位基因中的突變。可使用傳統(tǒng)育種以將該等位基因與突變myb12等位基因或y基因結(jié)合。

在另一方面，本發(fā)明的栽培番茄植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)是F1代雜種。所述F1代雜種優(yōu)選地包含本發(fā)明的兩個(gè)突變myb12等位基因。在另一方面，所述F1代雜種包含本發(fā)明的兩個(gè)突變cd2等位基因。在另一方面，所述F1代雜種包含本發(fā)明的兩個(gè)突變myb12等位基因，以及本發(fā)明的一個(gè)或兩個(gè)突變cd2等位基因。F1代雜種是由兩個(gè)近交的親本株系制備，所述兩個(gè)近交的親本株系也是本發(fā)明的一個(gè)方面，因?yàn)樗鼈儼辽僖粋€(gè)突變myb12等位基因，或任選地兩個(gè)突變myb12等位基因(myb12純合型)。或者，這些親本株系包含本發(fā)明的至少一個(gè)突變myb12等位基因和一個(gè)突變cd2等位基因。在一方面，所述親本株系包含本發(fā)明的兩個(gè)突變myb12等位基因和兩個(gè)突變cd2等位基因。

本發(fā)明還涉及可從其生長出本發(fā)明的植物的種子。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含可從其生長出本發(fā)明的植物的種子的容器。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)的植物部分，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，或包含y基因，并且還包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變，即包含突變的cd等位基因(例如cd2)，其導(dǎo)致顯著提高的果實(shí)光澤度。由于突變等位基因被結(jié)合于植物的基因組中，因此植物和植物部分的所有營養(yǎng)細(xì)胞均包含該組合。此外，一些生殖細(xì)胞(花粉、子房)也將保留該組合。因此，在一方面，涵蓋了具有如本文所述的突變等位基因的所有營養(yǎng)細(xì)胞和包含這些營養(yǎng)細(xì)胞的植物部分，同樣也涵蓋了保留突變等位基因的生殖細(xì)胞。

在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物的植物部分(例如番茄果實(shí)、種子、花粉、細(xì)胞或后代)，其在它們的基因組中包含突變等位基因的組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)的植物和植物部分(例如番茄果實(shí)、種子、花粉、細(xì)胞或后代)，其包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，所述myb12等位基因選自：

包含導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性(如90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)；

包含導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至388的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性(如0％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)；以及y(黃色)基因；

并且其中所述植物或植物部分還包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變，所述參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因選自：

包含導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換的突變的cd2等位基因，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)；

以及

包含導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生Q708H和/或D737N氨基酸置換的突變的cd2等位基因，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)的植物或植物部分(例如番茄果實(shí)、種子、花粉、細(xì)胞或后代)，所述植物或植物部分包含具有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性，并且其中所述植物或植物部分還包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變，所述參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因選自：

包含導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換的突變的cd2等位基因，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)；

以及

包含導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生Q708H和/或D737N氨基酸置換的突變的cd2等位基因，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物(即能夠產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)的植物)的植物和植物部分(例如番茄果實(shí)、種子、花粉、細(xì)胞或后代)，所述植物和植物部分包含具有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至388的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)，并且其中所述植物部分還包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變，特別是導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換的cd2等位基因中的突變，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)；在另一方面，將與SEQ ID NO:1具有90％的序列同一性的變體和與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)的SEQ ID NO:10的變體結(jié)合；在另一方面，將與SEQ ID NO:1具有95％的序列同一性的變體和與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)的SEQ ID NO:10的變體結(jié)合；在另一方面，將與SEQ ID NO:1具有99％的序列同一性的變體和與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性(如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％)的SEQ ID NO:10的變體結(jié)合。在一方面，當(dāng)所述突變myb12等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，包含任意上述組合的番茄果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期均顯示出粉紅色外觀。在一方面，當(dāng)所述突變myb12等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，包含任意上述組合的番茄果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期均顯示出粉紅色和有光澤的外觀。

在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明植物的番茄果實(shí)、種子、花粉、細(xì)胞或后代，其包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白，其中所述所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少約85％的氨基酸序列同一性；

或其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至388的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性。

可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來確定任何番茄植物組織、細(xì)胞、果實(shí)、花粉、花或番茄植物的其他部分中本發(fā)明的突變myb12等位基因的一個(gè)或兩個(gè)拷貝的存在，以檢測存在的內(nèi)源等位基因(基因組DNA)、mRNA(cDNA)或蛋白質(zhì)。例如可使用PCR、測序、ELISA測定或其他技術(shù)。

可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來確定任何番茄植物組織、細(xì)胞、果實(shí)、花粉、花或番茄植物的其他部分中本發(fā)明的突變cd2等位基因的一個(gè)或兩個(gè)拷貝的存在，以檢測存在的內(nèi)源等位基因(基因組DNA)、mRNA(cDNA)或蛋白質(zhì)。例如可使用PCR、測序、ELISA測定或其他技術(shù)。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的番茄果實(shí)，其中所述番茄果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期顯示出粉紅色外觀，并且所述植物和植物部分是本發(fā)明的突變myb12等位基因純合型的。在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物的番茄果實(shí)，其中所述番茄果實(shí)與野生型Myb12等位基因(例如編碼SEQ ID NO:1的蛋白的等位基因)純合型的番茄相比，在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期顯示出粉紅色外觀。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的番茄果實(shí)，其中所述番茄果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期顯示出有光澤的粉紅色外觀，并且所述植物和植物部分是本發(fā)明的突變myb12等位基因純合型的。在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物的番茄果實(shí)，其中所述番茄果實(shí)與野生型Myb12等位基因(例如編碼SEQ ID NO:1的蛋白的等位基因)純合型和野生型CD2等位基因(例如編碼SEQ ID NO:10的蛋白的等位基因)純合型的番茄相比，在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和紅色期顯示出有光澤的粉紅色外觀。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明植物的果實(shí)或所述果實(shí)的部分或者由其組成的食品或食品產(chǎn)品。同樣地，所述食品或食品產(chǎn)品中本發(fā)明突變等位基因(例如突變cd2等位基因或突變myb12等位基因)的一個(gè)或兩個(gè)拷貝的存在可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來檢測，尤其是如果所述食品或食品產(chǎn)品包含新鮮果實(shí)組織或由其組成；根據(jù)組織的類型，仍然可能難以看見本發(fā)明植物的果實(shí)的粉紅色和光澤表型。在高度加工的食品產(chǎn)品例如番茄糊、湯或調(diào)味醬(sauce)中，檢測突變myb12等位基因或其片段(myb12等位基因的基因組DNA片段)或突變myb12蛋白可能是困難的，因?yàn)檫@些物質(zhì)可能已經(jīng)在加工過程中被破壞。在這些產(chǎn)品中，分析需要在較早期進(jìn)行。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明植物的果實(shí)或果實(shí)的部分的組合物。本發(fā)明的植物的無性繁殖物也是本文涵蓋的一個(gè)方面。同樣涵蓋了用于新鮮食用的或用于加工的或?yàn)榻?jīng)加工形式的收獲的果實(shí)和果實(shí)的部分?？蓪⒐麑?shí)分級(jí)、按大小分類和/或進(jìn)行包裝?？梢詫⒐麑?shí)切成片狀或切丁或進(jìn)一步加工。

應(yīng)注意的是，可將本發(fā)明的突變等位基因轉(zhuǎn)移到任何類型的栽培番茄中，即產(chǎn)生各種形狀(圓形，長方形(oblong)，細(xì)長形，梨形等)和大小(如櫻桃番茄、小番茄、微型番茄、牛排番茄、葡萄番茄、切片或球狀番茄、李子番茄、梨形番茄等)的果實(shí)。果實(shí)可以是雙室或多室類型。因此，任何這種類型均可以產(chǎn)生本發(fā)明的粉紅色光澤果實(shí)。粉紅色且有光澤的特征也可以與如WO2013135726中所述的致密(intense)果實(shí)表型相組合。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生雜種番茄植物的方法，所述方法包括：

(a)獲得本發(fā)明的第一番茄植物(例如從權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng))或來自可從其生長出本發(fā)明的植物的種子(例如根據(jù)權(quán)利要求8)的第一番茄植物；以及

(b)將所述第一番茄植物與第二番茄植物雜交以獲得雜種種子，

其中從所述雜種種子中生長出的所述雜種番茄植物包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；

或其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至338的缺失，其中所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或其中所述植物包含y(黃色)基因。

在一方面，從步驟b)產(chǎn)生的種子中生長出的植物也包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變，如包含選自下述突變的cd2等位基因：導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換的突變，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性；以及導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生Q708H和/或D737N氨基酸置換的突變，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性。

在一方面，從步驟b)產(chǎn)生的種子中生長出的植物也包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因(如cd2等位基因)中的突變，導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性；此外，這些植物具有包含一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中產(chǎn)生G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或其中植物包含y(黃色)基因。

在一方面，番茄植物也為本發(fā)明的植物，即包含至少一個(gè)本發(fā)明突變cd2和myb12等位基因。所得的F1雜種種子和從所述種子中生長出的植物包含至少一個(gè)(優(yōu)選地兩個(gè))cd2等位基因，以及一個(gè)(優(yōu)選地兩個(gè))突變myb12等位基因，優(yōu)選地兩個(gè)相同的cd2等位基因和兩個(gè)相同的myb12等位基因。因此，所述F1雜種種子(和從其中生長出的植物)在一方面是本發(fā)明的myb12等位基因純合型的并且也是本發(fā)明的cd2等位基因純合型的。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述突變myb12等位基因源自栽培的番茄(例如育種系、品種或傳統(tǒng)品種)或番茄的野生近緣種和/或在其中產(chǎn)生。這種人工誘導(dǎo)的突變可以例如使用EP1963505中描述的定向誘變來誘導(dǎo)。隨后，番茄的野生近緣種中產(chǎn)生的突變myb12等位基因可容易地通過育種而轉(zhuǎn)移至栽培的番茄中。類似地，突變cd2等位基因可源自栽培的番茄(例如育種系、品種或傳統(tǒng)品種)或番茄的野生近緣種和/或在其中產(chǎn)生。這種人工誘導(dǎo)的突變可以例如使用EP1963505中描述的定向誘變來誘導(dǎo)。隨后，番茄的野生近緣種中產(chǎn)生的突變myb12等位基因可容易地通過育種而轉(zhuǎn)移至栽培的番茄中。將存在于NCIMB 42087中的突變myb12等位基因(編碼SEQ ID NO:2的myb12蛋白)例如與存在于NCIMB42269中的突變cd2等位基因(編碼SEQ ID NO:11的cd2蛋白)組合于以NCIMB 42268保藏的單一番茄植物中。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的番茄植物，與野生型(Myb12/Myb12)植物相比時(shí)，本發(fā)明的番茄植物在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期或紅色期具有較淺顏色的表皮和/或無色的表皮和/或粉紅色的番茄果實(shí)，這是由于所述植物包含純合形式的編碼功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白的內(nèi)源myb12等位基因，所述myb12蛋白與SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:3具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的蛋白是100％相同的。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的番茄植物，與野生型(Myb12/Myb12)植物相比，本發(fā)明的番茄植物在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期或紅色期(例如紅熟期)具有較淺顏色的表皮和/或無色的表皮和/或粉紅色的番茄果實(shí)，這是由于所述植物包含純合形式的編碼功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白的內(nèi)源myb12等位基因，所述myb12蛋白與SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:3具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的蛋白是100％相同的，其中所述植物還包含純合或雜合形式的編碼SEQ ID NO:10的CD2蛋白的內(nèi)源cd2等位基因，所述SEQ ID NO:10的CD2蛋白包含選自G736V、D737N和Q708H的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，并且與野生型(CD2/CD2)植物的果實(shí)相比，在果實(shí)發(fā)育的紅色期(RR期)產(chǎn)生顯著更有光澤的果實(shí)；和/或與野生型(CD2/CD2)植物的果實(shí)相比，在果實(shí)發(fā)育的紅色期(RR期)，其果實(shí)包含顯著更高或更低量的角質(zhì)，和/或與野生型(CD2/CD2)植物的果實(shí)相比，在果實(shí)發(fā)育的紅色期(RR期)，其果實(shí)包含顯著更厚或更薄的角質(zhì)層。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的蛋白質(zhì)，其與SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:3具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有100％的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸序列，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:3具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有100％的序列同一性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的蛋白質(zhì)，其與SEQ ID NO:11具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:11具有100％的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸序列，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO:11具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:11具有100％的序列同一性。

在甚至另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸序列、DNA或RNA，其與SEQ ID NO:5或與SEQ ID NO:6具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有100％的序列同一性；或者涉及分離的核酸序列，其被轉(zhuǎn)錄為與SEQ ID NO:5或與SEQ ID NO:6具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有100％的序列同一性的核酸序列。

在甚至另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸序列、DNA或RNA，其與SEQ ID NO:13具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:13具有100％的序列同一性；或者涉及分離的核酸序列，其被轉(zhuǎn)錄為與SEQ ID NO:13具有基本序列同一性，或與SEQ ID NO:13具有100％的序列同一性的核酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了在果實(shí)發(fā)育的紅熟期具有與本發(fā)明番茄植物的果實(shí)相同和/或相似的表皮和/或果皮顏色的番茄植物，所述本發(fā)明番茄植物的代表性種子由Nunhems B.V.保藏并根據(jù)布達(dá)佩斯條約按照Expert Solution(EPC 2000,Rule 32(1))于2012年12月5日被接受保藏在NCIMB Ltd.(英國蘇格蘭，阿伯丁郡AB219YA，巴克斯本，克萊伯斯通區(qū)，弗格森大廈(Ferguson Building,Craibstone Estate,BucksburnAberdeen,Scotland AB219YA,UK))。種子被給予以下保藏號(hào)：NCIMB 42087(突變體2961)或NCIMB 42088(突變體5505)。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了在果實(shí)發(fā)育的紅熟期具有與本發(fā)明番茄植物的果實(shí)相同或相似的光澤度，和/或相同或相似的角質(zhì)含量，和/或相同或相似的角質(zhì)層厚度的番茄植物，所述本發(fā)明番茄植物的代表性種子由Nunhems B.V.以NCIMB 42268(突變體8.17)和NCIMB42269(突變體26428.001)保藏。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了在果實(shí)發(fā)育的紅熟期具有與F1番茄植物的果實(shí)相同或相似的光澤度，和/或相同或相似的角質(zhì)含量，和/或相同或相似的角質(zhì)層厚度的番茄植物，所述F1番茄植物是通過將從以NCIMB 42268(突變體8.17；cd2/cd2)或以NCIMB42269(突變體26428.001；cd2/cd2)保藏的種子生長出的植物與缺少cd2突變體的另一種番茄植物(CD2基因的野生型，CD2/CD2)雜交而獲得。

在本發(fā)明的又另一方面，本發(fā)明提供了在果實(shí)發(fā)育的紅熟期具有與本發(fā)明番茄植物或F1植物的果實(shí)相同或相似的光澤度(和/或角質(zhì)含量和/或角質(zhì)層厚度)，以及相同或相似的表皮和/或果皮顏色的番茄植物，所述本發(fā)明番茄植物的代表性種子是由Nunhems B.V.以NCIMB 42268(突變體8.17；myb12/myb12和cd2/cd2)保藏；所述F1植物是通過將NCIMB42268與野生型番茄植物(Myb12/Myb12和CD2/CD2)雜交而獲得。

“相同或相似”是指特征(例如顏色；光澤度；角質(zhì)含量；角質(zhì)層厚度)與所描述和/或保藏的植物的特征沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；換句話說，關(guān)于特征，沒有發(fā)現(xiàn)在所比較的植物(或植物株系或植物品種)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(例如在單因素ANOVA中，P值大于0.05，表明沒有顯著性差異)。

本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的番茄植物的細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。所述細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物包含可再生細(xì)胞。這類細(xì)胞或組織可從本發(fā)明番茄植物的葉、花粉、胚、子葉、下胚軸、分生細(xì)胞、根、根尖、花藥、花、種子或莖中得到。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物不包含可再生細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的非增殖細(xì)胞，以及包含本發(fā)明的非增殖細(xì)胞或由其組成的細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。

本發(fā)明的一方面是產(chǎn)生本發(fā)明番茄植物的方法，所述方法包括以下步驟：

a.獲得番茄植物的植物材料，優(yōu)選種子；

b.用誘變劑處理所述植物材料以產(chǎn)生誘變的植物材料，例如誘變的種子；

c.分析所述誘變的植物材料，例如誘變的種子或通過自交獲得的所述種子的后代，以及

鑒定在至少一個(gè)與SEQ ID NO:7或其功能性變體具有基本序列同一性的myb12等位基因中具有至少一個(gè)突變的植物；和/或

鑒定在至少一個(gè)與SEQ ID NO:14或其功能性變體具有基本序列同一性的cd2等位基因中具有至少一個(gè)突變的植物；或

鑒定在至少一個(gè)與SEQ ID NO:7或其功能性變體具有基本序列同一性的myb12等位基因中具有至少一個(gè)突變，并且在至少一個(gè)與SEQ ID NO:14或其功能性變體具有基本序列同一性的cd2等位基因中具有至少一個(gè)突變的植物。

所述方法可任選地還包括將包含所述至少一個(gè)myb12等位基因的植物或通過自交產(chǎn)生的其后代，與包含所述至少一個(gè)cd2等位基因的所述植物或通過自交產(chǎn)生的其后代進(jìn)行雜交，以獲得包含所述myb12等位基因和所述cd2等位基因的植物。

所述方法還可包括分析所選植物或所述植物的后代的番茄果實(shí)的顏色或光澤度，以及選擇其果實(shí)具有粉紅色或淺粉紅色(pinkish)的植物。在一方面，所述突變選自導(dǎo)致選自SEQ ID NO:1或其變體中的G50R的氨基酸置換的突變，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性。

在另一方面，所述突變選自引起選自SEQ ID NO:4中的G148C和T182A的cDNA中改變的突變。

在本方法中，在步驟c)中可鑒定植物材料，其包含具有至少一個(gè)突變的cd2等位基因，所述突變在至少一個(gè)與SEQ ID NO:14具有基本序列同一性的cd2等位基因中或在其功能性變體中。在一方面，這種在cd2等位基因中的至少一個(gè)突變?yōu)閷?dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中的G736V和/或D737N和/或Q708H氨基酸置換的突變，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少85％的氨基酸序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)cd2等位基因中的該至少一個(gè)突變包含在SEQ ID NO:14中的G7171T突變。

在本方法中，步驟a)的植物材料優(yōu)選地選自番茄植物株系或栽培種的種子、花粉、植物細(xì)胞或植物組織。更優(yōu)選植物種子。在另一方面，本方法使用的誘變劑是甲基磺酸乙酯。在步驟b)和步驟c)中，所述誘變的植物材料優(yōu)選地為突變體群，例如番茄TILLING群。

因此，在一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生包含突變myb12等位基因的番茄植物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)提供番茄TILLING群，

b)篩選所述TILLING群中的myb12基因的突變體，和

c)從b)的突變植物中選擇出其果實(shí)與野生型(Myb12/Myb12)果實(shí)相比產(chǎn)生無色的表皮或顏色降低的表皮的那些植物(或那些植物的后代)。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生包含突變cd2等位基因的番茄植物的方法，所述方法包括以下步驟：

i)提供番茄TILLING群，

ii)篩選所述TILLING群中的cd2基因的突變體，和

iii)從b)的突變植物中選擇出其果實(shí)與野生型(CD2/CD2)果實(shí)相比更有光澤的那些植物(或那些植物的后代)。

因此，在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的包含突變myb12和cd2等位基因的番茄植物的方法，所述方法包括下述步驟：將選自步驟c)的植物(或通過自交產(chǎn)生的其后代)與選自步驟iii)的植物(或通過自交產(chǎn)生的其后代)雜交，使后代植物自交，以及選擇產(chǎn)生粉紅色光澤果實(shí)的后代。

優(yōu)選地將突變植物(M1)自交一次或多次以產(chǎn)生用于步驟c)中的表型分析的例如M2群或優(yōu)選M3或M4群。在M2群中，所述突變等位基因以1(突變等位基因純合型):2(突變等位基因雜合型):1(野生型等位基因純合型)的比例存在。

在又另一方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生雜種番茄植物的方法，所述方法包括：

(a)獲得本發(fā)明的第一番茄植物或來自可從其生長出本發(fā)明植物的種子的第一番茄植物；以及

(b)將所述第一番茄植物與第二番茄植物雜交以獲得雜種種子，

其中所述雜種番茄植物包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白，所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；

或者，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1中包含氨基酸61至338的缺失，或在SEQ ID NO:1的變體中包含氨基酸61至338(或氨基酸61至蛋白質(zhì)的末端)的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；

此外，

其中所述植物包含參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因，特別是cd2等位基因中的突變，所述cd2等位基因選自：包含導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換的突變的cd2等位基因，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性；以及包含導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或其變體中產(chǎn)生Q708H和/或D737N氨基酸置換的突變的cd2等位基因，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性。

本發(fā)明的植物和植物部分(例如果實(shí)、細(xì)胞等)可以是所述突變myb12等位基因純合型或雜合型的。

優(yōu)選地，本發(fā)明的植物——其包含一個(gè)或多個(gè)突變myb12等位基因，并且產(chǎn)生在SEQ ID NO:1或其變體中具有G50R氨基酸置換的突變myb12蛋白，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列相似性；

或者其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性——不產(chǎn)生與野生型植物相比更少的果實(shí)。因此，優(yōu)選地，每個(gè)植株的果實(shí)數(shù)目不減少。

可通過計(jì)算機(jī)(in silico)來鑒定其他推定的MYB12基因/蛋白質(zhì)，例如通過在已有的核酸或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中鑒定核酸或蛋白質(zhì)序列并使用標(biāo)準(zhǔn)的序列分析軟件(例如序列相似性檢索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了功能喪失的myb12蛋白或功能降低的突變myb12蛋白(包括變體或直系同源物，例如野生番茄近緣種的myb12蛋白)以及在其基因組中含有一個(gè)或多個(gè)myb12等位基因的植物或植物部分，所述myb12等位基因編碼功能喪失的myb12蛋白或功能降低的突變體，由此與野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比，當(dāng)突變等位基因?yàn)榧兒闲问綍r(shí)，所述降低的功能賦予了粉紅色的番茄果實(shí)(與具有紅色果肉的純合型myb12突變體的組合)和/或較淺顏色的表皮和/或無色的表皮。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的突變蛋白，其與SEQ ID NO:1具有至少約85％的氨基酸序列同一性；或與SEQ ID NO:1具有至少約90％、93％、95％、96％、97％、98％、或99％、或100％的氨基酸序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這類突變蛋白的片段，其包含SEQ ID NO:1的或與SEQ ID NO:1具有至少約90％、93％、95％、96％、97％、98％、或99％、或100％的氨基酸序列同一性的序列的20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120或150個(gè)連續(xù)的氨基酸，包括SEQ ID NO:1中的G50R氨基酸置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼這類蛋白或蛋白片段的核酸序列。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了番茄植物中的如本文所定義的突變蛋白或其變體、或其片段的用途，以在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期獲得番茄果實(shí)的無色表皮。本發(fā)明還提供了編碼這類蛋白或蛋白片段的核酸的這種用途。

任何類型的突變都可能導(dǎo)致所編碼的Myb12蛋白的功能降低，例如在包含所述cDNA(SEQ ID NO:4或其變體)的基因組DNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、缺失和/或替換。然而，并不是所有突變都確實(shí)會(huì)引起本文包含的實(shí)施例中舉例說明的無色表皮。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由于一個(gè)或多個(gè)突變而編碼功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白的myb12核酸序列，例如在與野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比時(shí)，所述myb12蛋白造成粉紅色的番茄果實(shí)(與具有紅色果肉的純合myb12突變體組合)和/或較淺顏色的表皮和/或無色表皮。

類似地，本發(fā)明提供了由于一個(gè)或多個(gè)突變而編碼功能喪失的CD蛋白或功能降低的CD蛋白(例如突變的cd1、cd2或cd3蛋白)的cd核酸序列，在與野生型CD等位基因純合型的番茄相比時(shí)，所述cd蛋白導(dǎo)致在紅色期果實(shí)光澤度的提高，和/或角質(zhì)水平的顯著升高或降低，和/或角質(zhì)層厚度的顯著增厚或變薄。

通過確定純合形式的突變等位基因?qū)Τ壬诤笃诨蚣t熟期的番茄果實(shí)的表皮顏色的影響，或通過確定突變對(duì)橙色期后期或紅熟期的番茄果實(shí)的番茄果實(shí)的顏色的影響，可如本文所述來測試體內(nèi)myb12蛋白功能喪失或這類蛋白的功能降低；當(dāng)純合型突變等位基因與紅色果肉結(jié)合時(shí)，果實(shí)顏色將變?yōu)榉奂t色。如本領(lǐng)域已知的，例如可以使用例如誘變來重新產(chǎn)生并通過TILLING來鑒定這樣的植物，即其包含編碼這類突變的功能喪失的myb12蛋白或功能降低的蛋白的核酸序列，并且任選地與野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比在橙色期后期和/或紅熟期具有較淺顏色的表皮和/或無色表皮和/或粉紅色的番茄果實(shí)。

如本文所述，可通過確定純合或雜合形式的該突變等位基因?qū)t熟期果實(shí)的光澤度、角質(zhì)含量和/或角質(zhì)層厚度的影響來測試體內(nèi)CD蛋白的功能喪失或功能降低。

還可以使用轉(zhuǎn)基因方法來測試編碼突變myb12蛋白或cd蛋白的突變myb12等位基因或cd等位基因的體內(nèi)功能性。可以將突變等位基因與植物啟動(dòng)子可操作地連接，并可以通過轉(zhuǎn)化將嵌合基因引入番茄植物中?？梢詼y試再生的植物(或后代，例如通過自交獲得)在橙色期后期和/或紅熟期的表皮顏色和/或番茄果實(shí)顏色。例如可以轉(zhuǎn)化包含無功能的myb12等位基因或cd等位基因的番茄植物以測試轉(zhuǎn)基因myb12等位基因或cd等位基因的功能性。

TILLING(定向誘導(dǎo)基因組局部損傷)是一種常見的反向遺傳技術(shù)，該技術(shù)使用傳統(tǒng)化學(xué)誘變方法產(chǎn)生誘變個(gè)體文庫，然后對(duì)所述誘變個(gè)體文庫進(jìn)行高通量篩選以發(fā)現(xiàn)突變。TILLING將化學(xué)誘變與對(duì)混合的PCR產(chǎn)物的突變篩選相結(jié)合，導(dǎo)致對(duì)靶基因的錯(cuò)義和無義突變等位基因的分離。因此，TILLING使用傳統(tǒng)化學(xué)誘變(例如EMS或MNU誘變)或其他誘變方法(例如輻射，如UV)，隨后高通量篩選特定靶基因(例如本發(fā)明Myb12)中的突變。使用S1核酸酶(CEL1或ENDO1)來切割突變體和野生型靶DNA的異源雙鏈體，并使用例如電泳(如LI-COR凝膠分析儀系統(tǒng))檢測切割產(chǎn)物，參見例如Henikoff et al.Plant Physiology 2004,135:630-636。TILLING已經(jīng)應(yīng)用于很多植物物種，例如番茄(參見http://tilling.ucdavis.edu/index.php/Tomato_Tilling)、稻(Till et al.2007,BMC Plant Biol 7:19)、擬南芥(Till et al.2006,Methods Mol Biol 323:127-35)、蕓苔屬(Brassica)、玉米(Till et al.2004,BMC Plant Biol 4:12)等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼所述突變myb12或cd蛋白的(cDNA或基因組)核酸序列包含一個(gè)或多個(gè)無義和/或錯(cuò)義突變，例如轉(zhuǎn)換(將嘌呤替換為另一嘌呤或?qū)⑧奏ぬ鎿Q為另一嘧啶)或顛換(將嘌呤替換為嘧啶，或反之亦然)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述無義和/或錯(cuò)義突變位于編碼任意Myb12外顯子或CD外顯子或Myb12蛋白變體或CD蛋白變體的基本相似的結(jié)構(gòu)域(即包含與SEQ ID NO:1(Myb12)或SEQ ID NO:10(CD2)或其變體的氨基酸至少80％、90％、95％、98％、99％的氨基酸同一性的結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在一個(gè)外顯子編碼序列中含有一個(gè)或多個(gè)無義和/或錯(cuò)義突變的myb12核苷酸序列，以及含有這樣的突變等位基因的植物，所述突變等位基因任選地導(dǎo)致與野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比時(shí)粉紅色的番茄果實(shí)和/或較淺顏色的表皮和/或無色表皮。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在一個(gè)外顯子編碼序列上含有一個(gè)或多個(gè)無義和/或錯(cuò)義突變的cd2核苷酸序列，以及含有這樣的突變等位基因的植物，所述突變等位基因?qū)е屡c野生型CD2等位基因純合型的番茄相比時(shí)有光澤或顯著地更有光澤的番茄果實(shí)。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的功能喪失或功能降低的突變myb12等位基因和/或cd2等位基因的番茄植物和植物部分(果實(shí)、種子等)。

本發(fā)明還提供了編碼功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白(例如SEQ ID NO:2或3中描述的myb12，或上文所定義的其變體(包括任何嵌合或雜合蛋白或突變蛋白或截短的蛋白))的核酸序列(基因組DNA、cDNA、RNA)。由于遺傳密碼的簡并性，多種核酸序列可編碼相同的氨基酸序列。所提供的核酸序列包括天然存在的、人工或合成的核酸序列。在SEQ ID NO:4(NCBI EU419748番茄MYB12(MYB12)mRNA，完整的cds http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/171466740)中提供了編碼Myb12的核酸序列。

本發(fā)明還提供了編碼功能喪失的cd蛋白(特別是cd2)或功能降低的cd2蛋白(特別是cd2)(例如SEQ ID NO:11或15描述的cd2，或上文所定義的其變體(包括任何嵌合或雜合蛋白或突變蛋白或截短的蛋白))的核酸序列(基因組DNA、cDNA、RNA)。

應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)序列被描述為DNA序列并同時(shí)提及RNA時(shí)，所述RNA分子的實(shí)際堿基序列是相同的，差異在于胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替換。當(dāng)本文中提到核苷酸序列(例如DNA或RNA)時(shí)，使用斜體，例如myb12等位基因，而當(dāng)提到蛋白時(shí)不使用斜體，例如myb12蛋白。突變體用小寫字母(例如myb12等位基因或myb12蛋白)表示，而野生型/功能性的形式以大寫字母開頭(Myb12等位基因或Myb12蛋白)。

本發(fā)明還提供了編碼突變myb12蛋白(即如上文所述的功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白)的核酸序列(基因組DNA、cDNA、RNA)，以及含有所述突變序列的植物和植物部分。例如，在野生型Myb12編碼序列中含有一個(gè)或多個(gè)無義和/或錯(cuò)義突變的myb12核酸序列，使得所編碼的蛋白質(zhì)在體內(nèi)功能喪失或功能降低。本發(fā)明還提供了具有其他突變的序列，例如剪接位點(diǎn)突變體(即導(dǎo)致前mRNA異常剪接的基因組myb12序列中的突變)、和/或移碼突變、和/或插入(例如轉(zhuǎn)座子插入)和/或一個(gè)或多個(gè)核酸的缺失。

顯然，可以使用很多方法(例如核酸雜交、PCR技術(shù)、計(jì)算機(jī)分析和核酸合成等)來鑒定、合成或分離myb12或cd核酸序列的變體或片段。SEQ ID NO:4(或SEQ ID NO:10)的變體可以編碼野生型、功能性Myb12蛋白(或CD2蛋白)，或它們可以編碼功能喪失的myb12蛋白(或CD2蛋白)或這些中任一種的功能降低的突變等位基因(例如，通過例如TILLING或其他方法進(jìn)行的誘變產(chǎn)生)。

可將本發(fā)明的植物用于傳統(tǒng)的植物育種方案中以產(chǎn)生更多的具有相同特征的植物，或者用于將所述突變myb12或cd2等位基因引入到相同或相關(guān)植物物種的其他植物株系或品種中。

還可以使用本領(lǐng)域中已知的植物轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)使用本發(fā)明的突變myb12或cd2核苷酸序列來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?？梢赃x擇“良種事件(elite event)”，其為具有被插入到基因組中特定位置中的嵌合基因(包含與編碼功能喪失的myb12或cd蛋白或者功能降低的myb12或cd蛋白的核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子)的轉(zhuǎn)化事件，該嵌合基因?qū)е滤璞硇偷牧己帽磉_(dá)。

如上文所述的本發(fā)明植物是突變myb12等位基因純合型或雜合型的。類似地，如上文所述的本發(fā)明植物是突變cd等位基因(cd1、cd2或cd3)，例如cd2等位基因純合型或雜合型的。為產(chǎn)生含有純合形式的突變等位基因的植物，可以使用自交。可以通過傳統(tǒng)的育種技術(shù)(例如雜交、自交、回交等)將本發(fā)明的突變myb12和/或cd等位基因(例如cd2等位基因)轉(zhuǎn)移到任何其他番茄植物中。因此，可以產(chǎn)生任何類型的包含至少一個(gè)本發(fā)明的突變myb12和/或cd(例如cd2)等位基因的番茄?？梢援a(chǎn)生和/或鑒定任何番茄，所述番茄在其基因組中含有至少一個(gè)突變myb12和/或cd(例如cd2)等位基因并產(chǎn)生myb12蛋白(或cd蛋白，例如cd2蛋白)，所述myb12蛋白(或cd蛋白，例如cd2蛋白，分別地)與野生型Myb12(或CD，例如CD2)蛋白相比具有功能喪失myb12蛋白(或cd蛋白，例如cd2蛋白)或活性降低。因此，所述番茄植物可以是任何栽培的番茄、任何商業(yè)品種、任何育種系或其它，其可以是確定或不確定的、自由授粉或雜交的，可以產(chǎn)生具有任何顏色的果肉、任何形狀和大小的果實(shí)?？梢酝ㄟ^育種(與含有突變等位基因的植物雜交然后選擇含有所述突變等位基因的后代)容易地將在具體的番茄植株中或在番茄的性相容(sexually compatible)近緣種中產(chǎn)生和/或鑒定的突變等位基因轉(zhuǎn)移到任何其他的番茄植物中。

任何番茄植物或植物部分中的本發(fā)明的突變myb12等位基因和/或cd等位基因(例如cd2等位基因)的存在或不存在和/或所述等位基因到后代植物的遺傳，都可以從表型上和/或使用分子工具來確定(例如使用直接或間接的方法檢測myb12或cd核苷酸序列或myb12或cd蛋白的存在或不存在)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在栽培植物中產(chǎn)生或鑒定所述突變等位基因，但是也可以在野生植物或非栽培植物中產(chǎn)生和/或鑒定所述突變等位基因，然后使用例如雜交和選擇(任選地使用種間雜交與例如胚胎拯救來轉(zhuǎn)移所述突變等位基因)將其轉(zhuǎn)移到栽培植物中。因此，可以在番茄或其他茄屬(Solanum)物種中產(chǎn)生(使用誘變技術(shù)誘變所述靶myb12基因或cd基因或其變體的人工誘發(fā)突變)和/或鑒定(自發(fā)的或天然的等位基因變異)突變myb12等位基因或cd等位基因，然后通過傳統(tǒng)育種技術(shù)將其轉(zhuǎn)移到栽培的茄屬植物例如番茄(Solanum lycopersicum)中，所述其他茄屬物種包括例如番茄的野生近緣種，如契斯曼尼番茄、智利番茄、多毛番茄(S.habrochaites,(L.hirsutum))、克梅留斯基番茄、S.lycopersicum x S.peruvianum、多腺番茄(S.glandulosum)、多毛番茄(S.hirsutum)、小花番茄(S.minutum)、小花番茄(S.parviflorum)、潘那利番茄、秘魯番茄、S.peruvianum var.humifusum和細(xì)葉番茄。術(shù)語“傳統(tǒng)育種技術(shù)”在本文中包括育種者已知的雜交、自交、選擇、雙單倍體產(chǎn)生、胚胎拯救、原生質(zhì)體融合、通過中間物種(bridge species)的轉(zhuǎn)移等，即除了遺傳修飾之外的可轉(zhuǎn)移等位基因的方法。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，將含有突變myb12等位基因和/或突變cd等位基因的植物(例如番茄)與相同種或相近(closely related)種的另一植物雜交，以產(chǎn)生含有所述突變myb12等位基因和/或突變cd等位基因的雜種植物(雜種種子)。所述雜種植物也是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了F1代雜種番茄種子(即可由其生長出F1代雜種番茄植物的種子)，其含有本發(fā)明的至少一個(gè)突變myb12等位基因和/或至少一個(gè)突變cd等位基因，優(yōu)選地兩個(gè)myb12等位基因和/或一個(gè)或兩個(gè)cd等位基因(例如cd2)。F1代雜種種子(也稱為雜種種子)是從兩個(gè)近交番茄親本植株之間的雜交中收獲的種子。所述F1代雜種可以包含一個(gè)或兩個(gè)本發(fā)明的突變myb12等位基因和/或一個(gè)或兩個(gè)本發(fā)明的突變cd等位基因(例如cd2)。所述包含兩個(gè)本發(fā)明的突變myb12等位基因的F1代雜種可以包含本發(fā)明的相同myb12等位基因的兩個(gè)拷貝或兩個(gè)不同的本發(fā)明的myb12等位基因。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的植物用作親本植物以產(chǎn)生F1代雜種。所述包含兩個(gè)本發(fā)明的突變cd等位基因的F1代雜種可以包含本發(fā)明的相同cd等位基因的兩個(gè)拷貝(兩者都編碼SEQ ID NO:11蛋白的cd2/cd2)或兩個(gè)不同的本發(fā)明的cd等位基因(例如，一個(gè)編碼SEQ ID NO:11蛋白的cd2和一個(gè)編碼SEQ ID NO:15蛋白的cd2)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的植物用作親本植物以產(chǎn)生F1代雜種。

本發(fā)明還提供了將突變myb12等位基因或cd等位基因(例如cd2)轉(zhuǎn)移到另一植物的方法，所述方法包括提供在其基因組中含有突變myb12等位基因和/或cd等位基因(例如cd2)的番茄植物，將所述植物與另一番茄植物雜交并獲得所述雜交的種子。任選地，可以將獲自這些種子的植物進(jìn)一步自交和/或雜交，并選擇包含所述突變基因和/或從表型上選擇存在所述突變基因的后代，例如選擇產(chǎn)生在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期顯示出較淺顏色或無色的番茄果實(shí)的表皮的果實(shí)、或粉紅色番茄果實(shí)的植物將為對(duì)突變myb12等位基因(為純合形式)的選擇。類似地，可轉(zhuǎn)移突變cd等位基因如cd2等位基因，并在基因型和/或表型上進(jìn)行選擇。

如所提及的，應(yīng)當(dāng)理解，其他誘變和/或選擇方法可以等同地用于產(chǎn)生本發(fā)明的突變植物。例如可以對(duì)種子進(jìn)行輻射或化學(xué)處理以產(chǎn)生突變?nèi)后w。也可使用對(duì)myb12或cd(例如cd2)的直接基因測序來篩選誘變的植物群中的突變等位基因。例如，KeyPoint篩選是可以用于鑒定含有突變myb12或cd等位基因的植物的基于測序的方法(Rigola et al.PloS One,March 2009,Vol4(3):e4761)。

因此，本發(fā)明提供了非轉(zhuǎn)基因的突變番茄植物，所述番茄植物在果實(shí)中產(chǎn)生更低水平的野生型Myb12蛋白、或在果實(shí)中完全缺失野生型Myb12蛋白，并且其由于一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性myb12等位基因中的一個(gè)或多個(gè)突變而在果實(shí)中產(chǎn)生功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白。可以通過誘變方法(例如TILLING或其變化方案)或通過任何其他方法來產(chǎn)生這些突變體?？梢詫⒕幋a功能喪失的Myb12蛋白或功能降低的Myb12蛋白的myb12等位基因分離并測序，或可以通過傳統(tǒng)育種方法將其轉(zhuǎn)移到其他植物中。

同樣，本發(fā)明提供了非轉(zhuǎn)基因的突變番茄植物，所述番茄植物在果實(shí)中產(chǎn)生更低水平的野生型CD蛋白(例如CD2蛋白)、或在果實(shí)中完全缺失野生型CD蛋白(例如CD2蛋白)，并且其由于一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性cd蛋白(例如cd2蛋白)等位基因中的一個(gè)或多個(gè)突變而在果實(shí)中產(chǎn)生功能喪失的cd蛋白(例如cd2蛋白)或功能降低的cd蛋白(例如cd2蛋白)?？梢酝ㄟ^誘變方法(例如TILLING或其變化方案)或通過任何其他方法來產(chǎn)生這些突變體?？梢詫⒕幋a功能喪失的CD蛋白(例如CD1、CD2或CD3)或功能降低的CD蛋白(例如CD1、CD2或CD3)的CD等位基因分離并測序，或可以通過傳統(tǒng)育種方法將其轉(zhuǎn)移到其他植物中。

特別是，本發(fā)明提供了非轉(zhuǎn)基因的突變番茄植物，所述番茄植物在果實(shí)中產(chǎn)生更低水平的野生型Myb12蛋白、或在果實(shí)中完全缺失野生型Myb12蛋白，并且其由于一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性myb12等位基因中的一個(gè)或多個(gè)突變而在果實(shí)中產(chǎn)生功能喪失的myb12蛋白或功能降低的myb12蛋白，其額外地在果實(shí)中產(chǎn)生更低水平的野生型CD蛋白(例如CD2蛋白)、或在果實(shí)中完全缺失野生型CD蛋白(例如CD2蛋白)，并且其由于一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性cd蛋白(例如cd2蛋白)等位基因中的一個(gè)或多個(gè)突變而在果實(shí)中產(chǎn)生功能喪失的cd蛋白(例如cd2蛋白)或功能降低的cd蛋白(例如cd2蛋白)。

本發(fā)明提供了基因組中含有本發(fā)明的突變myb12等位基因和/或突變cd等位基因的所述植物或其后代的任意部分，包括收獲的果實(shí)、收獲的組織或器官、種子、花粉、花、子房等。本發(fā)明還提供了在其基因組中含有突變myb12等位基因和/或突變cd等位基因的植物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物組織培養(yǎng)物。優(yōu)選地，所述植物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物組織培養(yǎng)物可再生為在其基因組中含有突變myb12等位基因和/或突變cd等位基因的完整植株。本文還包括通過對(duì)含有myb12突變等位基因和/或cd突變等位基因的單倍體細(xì)胞進(jìn)行染色體加倍而產(chǎn)生的雙單倍體植物(以及可從其生長出所述雙單倍體植物的種子)，和其基因組中含有突變myb12等位基因和/或cd等位基因的雜種植物(以及可從其生長出所述雜種植物的種子)，由此在一方面含有突變myb12等位基因的雙單倍體植物和雜種植物與野生型Myb12等位基因純合型的番茄相比，在果實(shí)發(fā)育的橙色期后期和/或紅色期顯示出較淺顏色或無色的番茄果實(shí)的表皮，和/或由此在一方面含有突變cd等位基因的雙單倍體植物和雜種植物與野生型CD等位基因純合型的番茄相比，在果實(shí)發(fā)育的紅色期顯示出有顯著更有光澤的番茄果實(shí)。

植物部分可以是繁殖的或非繁殖的，例如提供了非繁殖植物細(xì)胞，特別是在其基因組中含有如本文所公開的本發(fā)明的突變myb12等位基因的非繁殖植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及非繁殖植物細(xì)胞，其含有如本文所公開的本發(fā)明的突變myb12等位基因，并且含有如本文所公開的參與角質(zhì)層發(fā)育的等位基因中的突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及非繁殖植物細(xì)胞，其含有如本文所公開的本發(fā)明的突變myb12等位基因，并且含有本發(fā)明的突變cd2等位基因。

本發(fā)明還涉及具有至少一個(gè)人工誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因突變的內(nèi)源myb12蛋白，所述突變選自SEQ ID NO:1的G50R，或者其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或其變體中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1具有至少85％的氨基酸序列同一性；或涉及編碼這樣的蛋白的內(nèi)源性myb12等位基因。

優(yōu)選地，所述突變植物還具有良好的其他農(nóng)藝學(xué)特征，即與野生型植物相比，它們不具有減少的果實(shí)數(shù)目和/或降低的果實(shí)質(zhì)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是番茄植物，所述果實(shí)是番茄果實(shí)，例如具有任何形狀、大小或果肉顏色的加工的番茄、生鮮市場番茄。因此，本發(fā)明還提供了含有一個(gè)或兩個(gè)突變myb12等位基因和/或一個(gè)或兩個(gè)突變cd等位基因的植物或植物部分的收獲產(chǎn)品。其包括下游的經(jīng)加工的產(chǎn)品，例如番茄糊(tomato paste)、番茄醬(ketchup)、番茄汁、切開的番茄果實(shí)、灌裝果實(shí)、干燥的果實(shí)、去皮的果實(shí)等?？梢酝ㄟ^其基因組DNA中含有所述突變等位基因來鑒定所述產(chǎn)品。

在一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的植物(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，其包含如以NCIMB 42268保藏的植物中的粉紅色和有光澤性狀的遺傳學(xué)。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的植物(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，其包含如以NCIMB 42268或NCIMB 42269保藏的植物中的有光澤性狀的遺傳學(xué)。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的植物(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，其包含如以NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物中的粉紅色性狀的遺傳學(xué)。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的植物(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，其包含如以NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物中的粉紅色性狀的遺傳學(xué)，并且包含如以NCIMB 42268保藏的植物中的光澤度性狀的遺傳學(xué)。

在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的植物(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，其包含如以NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的植物中的粉紅色性狀的遺傳學(xué)，并且包含如以NCIMB 42269保藏的植物中的光澤度性狀的遺傳學(xué)。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(或植物部分)(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，所述植物或植物部分包含含有突變的cd等位基因，所述突變導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性并且具有G736V置換。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的番茄植物(或植物部分，如果實(shí)、種子、花粉、細(xì)胞)，所述植物(或植物部分)包含具有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1變體中包含氨基酸61至388的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1的氨基酸1至60具有至少95％的氨基酸序列同一性。

在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(或植物部分)(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，所述植物或植物部分包含含有突變的cd等位基因，所述突變導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10變體中產(chǎn)生G736V氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性并且具有G736V置換；并且所述植物(或其部分)包含具有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1變體中包含氨基酸61至388的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1的氨基酸1至60具有至少95％的氨基酸序列同一性。

在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(或植物部分)(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí)，所述植物或植物部分包含含有突變的cd等位基因，所述突變導(dǎo)致在SEQ ID NO:10中產(chǎn)生G736V氨基酸置換，并且所述植物(或其部分)包含具有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1中包含氨基酸61至388的缺失。

在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物(或植物部分)(即產(chǎn)生有光澤粉紅色果實(shí))，所述植物或植物部分包含具有一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致產(chǎn)生突變myb12蛋白的突變的myb12等位基因，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1中包含氨基酸61至388的缺失；并且其中所述植物部分還包含含有突變的cd等位基因，所述突變導(dǎo)致在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10變體中產(chǎn)生G736V和/或Q708H和/或D737N氨基酸置換，所述變體與SEQ ID NO:10具有至少75％的氨基酸序列同一性。

本發(fā)明還涉及以下的實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，在這些實(shí)施方案中，非繁殖性植物細(xì)胞為不能夠通過光合作用由無機(jī)物質(zhì)(如水、二氧化碳和礦物鹽等)合成碳水化合物和蛋白質(zhì)而維持其生命的植物細(xì)胞。

1.番茄種的栽培植物的非繁殖細(xì)胞，所述植物能夠產(chǎn)生粉紅色光澤的果實(shí)，所述植物包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因或包含純合形式的y(黃色)基因；

以及包含純合或雜合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(CD)等位基因，所述突變cd-等位基因?qū)е屡c缺少所述突變cd-等位基因的植物相比果實(shí)的光澤度增加。

2.實(shí)施方案1的非繁殖植物細(xì)胞，其中含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因具有選自下述的突變：編碼區(qū)中的突變、非編碼區(qū)中的突變、myb12等位基因的啟動(dòng)子中的突變和調(diào)節(jié)myb12等位基因表達(dá)的基因中的突變。

3.實(shí)施方案1或2的非繁殖植物細(xì)胞，其中含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因?qū)е庐a(chǎn)生突變myb12蛋白或更低的myb12蛋白水平，其中所述更低的myb12蛋白水平是與缺少所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因的植物的比較。

4.實(shí)施方案4的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1中具有甘氨酸50到精氨酸(G50R)的氨基酸置換；或其中所述突變myb12蛋白由SEQ ID NO:1組成，并且還含有所述G50R氨基酸置換；或其中所述突變myb12蛋白由SEQ ID NO:1組成，并且還含有所述G50R氨基酸置換，以及最多達(dá)8(例如最多達(dá)1、2、3或4)個(gè)氨基酸置換或缺失；或其中所述突變myb12蛋白由SEQ ID NO:1組成，并且還含有所述G50R氨基酸置換，以及最多達(dá)8(例如最多達(dá)1、2、3或4)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及還由在SEQ ID NO:1的N和/或C末端處1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成；

或

實(shí)施方案3的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變myb12蛋白在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1變體中包含氨基酸61至388的缺失，所述變體與SEQ ID NO:1的氨基酸1至60具有至少95％的氨基酸序列同一性；

或

實(shí)施方案3的植物細(xì)胞，其中所述植物包含y(黃色)基因。

5.實(shí)施方案1至4中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中包含一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:7雜交，并且還包含在核苷酸1271位置處的鳥嘌呤(G)到胞嘧啶(C)的突變(G1271C)；或其中所述myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:4雜交，并且還包含在核苷酸148位置處的鳥嘌呤(G)到胞嘧啶(C)的突變(G148C)；

或

實(shí)施方案1至4中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中包含一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:7雜交，并且還包含在核苷酸1305位置處的胸腺嘧啶(T)到腺嘌呤(A)的突變(T1305)；或其中myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:4雜交，并且還包含在核苷酸182位置處的胸腺嘧啶(T)到腺嘌呤(A)的突變(T182A)。

6.實(shí)施方案1至5中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，包含發(fā)現(xiàn)于并可來源于或可獲自(或來源于或獲自)以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的種子的myb12等位基因。

7.實(shí)施方案1至6中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變cd等位基因是選自CD1基因、CD2基因和CD3基因的基因的等位基因。

8.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中包含一個(gè)或多個(gè)突變的cd等位基因?qū)е庐a(chǎn)生突變cd蛋白。

9.實(shí)施方案1至8中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中包含一個(gè)或多個(gè)突變的cd-等位基因是編碼突變cd2蛋白的cd2等位基因，所述突變cd2蛋白在SEQ ID NO:10中包含一個(gè)或多個(gè)突變。

10.實(shí)施方案1至9中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中角質(zhì)含量和/或角質(zhì)層厚度小于番茄種的正常栽培植物的70％。優(yōu)選地，番茄種的正常栽培植物為缺少突變cd-等位基因，并且還包含與本發(fā)明的植物細(xì)胞相同的遺傳組成的番茄植物。

11.實(shí)施方案1至10中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變cd-等位基因是編碼由SEQ ID NO:10組成的蛋白的cd2等位基因，并且所述蛋白還包含在SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換；或

其中所述突變cd-等位基因是編碼SEQ ID NO:10的功能性變體的cd2等位基因，所述變體包含在SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失；或

其中所述突變cd-等位基因是編碼SEQ ID NO:10的功能性變體的cd2等位基因，所述變體包含在SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及所述變體還由在SEQ ID NO:10的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成；

或

其中所述突變cd-等位基因是編碼由SEQ ID NO:10組成的蛋白的cd2等位基因，所述蛋白還包含在SEQ ID NO:10中的Q708H和/或D737N氨基酸置換；或

其中所述突變cd-等位基因是編碼SEQ ID NO:10的功能性變體的cd2等位基因，所述變體包含在SEQ ID NO:10中的Q708H和/或D737N氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失；或

其中所述突變cd-等位基因是編碼SEQ ID NO:10的功能性變體的cd2等位基因，所述變體包含在SEQ ID NO:10中的Q708H和/或D737N氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及所述變體還由在SEQ ID NO:10的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成。

12.實(shí)施方案1至11中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述非繁殖植物細(xì)胞包含編碼SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13變體的mRNA的核酸序列，所述變體與SEQ ID NO:13具有至少90％(例如91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的核酸序列同一性，并且在第2207位具有胸腺嘧啶；或其中所述植物包含編碼SEQ ID NO:11蛋白的核酸序列；或其中所述植物包含基因組cd2序列，其與SEQ ID NO:14具有至少90％(例如91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％)的序列同一性并且編碼含有一個(gè)或多個(gè)以下氨基酸置換的突變CD2蛋白：G736V、D737N和/或Q708H。

13.實(shí)施方案1至12中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變cd-等位基因是編碼由SEQ ID NO:10組成的蛋白的cd2等位基因，所述蛋白還包含在SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換；或

其中所述突變cd-等位基因是編碼SEQ ID NO:10的功能性變體的cd2等位基因，所述變體包含在SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)8(例如最多達(dá)1、2、3或4)個(gè)氨基酸置換或缺失；或

其中所述突變cd-等位基因是編碼SEQ ID NO:10的功能性變體的cd2等位基因，所述變體包含在SEQ ID NO:10中的G736V氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)8(例如最多達(dá)1、2、3或4)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及所述變體還由在SEQ ID NO:10的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成。

14.實(shí)施方案1至13中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變cd-等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:14雜交，并且還包含在核苷酸7171位置處的鳥嘌呤(G)到胸腺嘧啶(T)的突變(G7171T)；或其中myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:12雜交，并且還包含在核苷酸2207位置處的鳥嘌呤(G)到胸腺嘧啶(T)的突變(G2207T)。

15.實(shí)施方案1至14中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述包含一個(gè)或多個(gè)突變的cd等位基因是存在于以NCIMB 42268或NCIMB 42269保藏的種子中的cd2等位基因。

16.一種突變cd-等位基因，其中所述突變cd-等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:14雜交，并且還包含在核苷酸7171位置處的鳥嘌呤(G)到胸腺嘧啶(T)的突變(G7171T)；或其中myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:12雜交，并且還包含在核苷酸2207位置處的鳥嘌呤(G)到胸腺嘧啶(T)的突變(G2207T)。

17.實(shí)施方案16的突變cd-等位基因在植物育種或在植物鑒定中的用途。

18.一種突變myb12等位基因，其中所述突變myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:7雜交，并且還包含在核苷酸1271位置處的鳥嘌呤(G)到胞嘧啶(C)的突變(G1271C)；或其中所述myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:4雜交，并且還包含在核苷酸148位置處的鳥嘌呤(G)到胞嘧啶(C)的突變(G148C)；

或

其中所述myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:7雜交，并且還包含在核苷酸1305位置處的胸腺嘧啶(T)到腺嘌呤(A)的突變(T1305)；或其中所述myb12等位基因在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO:4雜交，并且還包含在核苷酸182位置處的胸腺嘧啶(T)到腺嘌呤(A)的突變(T182A)。

19.實(shí)施方案18的突變myb12等位基因在植物育種或在植物鑒定中的用途。

20.由SEQ ID NO:1組成并且還含有G50R氨基酸置換的突變myb12蛋白；或由SEQ ID NO:1組成，并且還含有所述G50R氨基酸置換，以及最多達(dá)8(例如最高達(dá)1、2、3或4)個(gè)氨基酸置換或缺失的突變myb12蛋白；或由SEQ ID NO:1組成，并且還含有所述G50R氨基酸置換，以及最多達(dá)8(例如最多達(dá)1、2、3或4)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及還由在SEQ ID NO:1的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成的突變myb12蛋白；

或由SEQ ID NO:1的氨基酸1至60組成的突變myb12蛋白，或

由SEQ ID NO:1的氨基酸1至60組成并且還包含1個(gè)氨基酸置換或缺失的突變myb12蛋白；或

由SEQ ID NO:1的氨基酸1至60組成并且還由1個(gè)氨基酸置換或缺失組成，以及還由在SEQ ID NO:1的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成的突變myb12蛋白。

21.由SEQ ID NO:10組成的突變cd2蛋白，所述蛋白在SEQ ID NO:10中還包含G736V氨基酸置換；或

由SEQ ID NO:10的功能性變體組成的突變cd2蛋白，所述變體在SEQ ID NO:10中包含G736V氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失；或

由SEQ ID NO:10的功能性變體組成的突變cd2蛋白，所述變體在SEQ ID NO:10中包含G736V氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及所述變體還由在SEQ ID NO:10的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的任選序列組成；

或

由SEQ ID NO:10組成的蛋白，所述蛋白在SEQ ID NO:10中還包含Q708H和/或D737N氨基酸置換；或

由SEQ ID NO:10的功能性變體組成的蛋白，所述變體在SEQ ID NO:10中包含Q708H和/或D737N氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失；或

由SEQ ID NO:10的功能性變體組成的蛋白，所述變體在SEQ ID NO:10中包含Q708H和/或D737N氨基酸置換，所述變體還包含最多達(dá)16(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7或8)個(gè)氨基酸置換或缺失，以及所述變體還由在SEQ ID NO:10的N端和/或C端處的1-10(例如最多達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸殘基的序任選列組成。

22.一種植物選擇方法，所述方法包括在所述植物材料中鑒定實(shí)施方案16或18的突變等位基因的步驟，或包括鑒定實(shí)施方案20或21的突變蛋白的步驟。

23.根據(jù)實(shí)施方案1至14中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變myb12等位基因是存在于以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的種子中的等位基因；或

根據(jù)實(shí)施方案1至14中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變cd等位基因是存在于以登錄號(hào)NCIMB 42268或NCIMB 42269保藏的種子中的等位基因；或

根據(jù)實(shí)施方案1至14中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變myb12等位基因是存在于以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的種子中的等位基因，并且其中所述突變cd-等位基因是存在于以登錄號(hào)NCIMB 42268保藏的種子中的等位基因；或

根據(jù)實(shí)施方案1至14中任一項(xiàng)的非繁殖植物細(xì)胞，其中所述突變myb12等位基因是存在于以登錄號(hào)NCIMB 42087或NCIMB 42088保藏的種子中的等位基因，并且其中所述突變cd-等位基因是存在于以登錄號(hào)NCIMB 42269保藏的種子中的等位基因。

24.一種生產(chǎn)顯示出粉紅色光澤果實(shí)的番茄植物的方法，其包括以下步驟：

a.提供受體番茄植物或其部分；

b.提供第一供體番茄植物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因或包含純合形式的y(黃色)基因，如本文中本發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面中所定義的；

c.提供第二供體番茄植物，其包含純合或雜合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(CD)等位基因，與缺少所述突變cd-等位基因的植物的果實(shí)相比，所述突變cd-等位基因?qū)е鹿麑?shí)的光澤度增加，如本文中本發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面中所定義的。

d.使受體植物和第一供體植物雜交；

e.選擇顯示出粉紅色果實(shí)的后代植物；

f.使步驟e的后代植物與第二供體植物雜交；

g.選擇顯示出粉紅色光澤果實(shí)且包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(CD)等位基因的后代植物；

25.一種生產(chǎn)顯示出粉紅色光澤果實(shí)的番茄植物的方法，其包括以下步驟：

a.提供受體番茄植物或其部分；

b.提供第一供體番茄植物，其包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因或包含純合形式的y(黃色)基因，如本文中本發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面中所定義的；

c.提供第二供體番茄植物，其包含純合或雜合形式的含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(CD)等位基因，與缺少所述突變cd-等位基因的植物的果實(shí)相比，所述突變cd-等位基因?qū)е鹿麑?shí)的光澤度增加，如本文中本發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面中所定義的；

d.使受體植物和第二供體植物雜交；

e.選擇顯示出有光澤的果實(shí)且包含含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(CD)等位基因的后代植物；

f.使步驟e的后代植物與第一供體植物雜交；

g.選擇顯示出粉紅色光澤果實(shí)的后代植物。

26.實(shí)施方案24或25的方法，其中所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(cd)等位基因是如實(shí)施方案13或16定義的cd等位基因。

27.實(shí)施方案24或25的方法，其中所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因是如實(shí)施方案5定義的myb12等位基因。

28.實(shí)施方案24或25的方法，其中所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(cd)等位基因是如實(shí)施方案13或16定義的cd等位基因，并且其中所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因是如實(shí)施方案5定義的myb12等位基因。

29.實(shí)施方案28的方法，其中所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的角質(zhì)層缺乏(cd)等位基因是如實(shí)施方案16定義的cd等位基因，并且其中所述含有一個(gè)或多個(gè)突變的myb12等位基因是如實(shí)施方案5定義的myb12等位基因。

應(yīng)當(dāng)理解，無論何時(shí)提到存在于以具體登錄號(hào)保藏的種子中的等位基因，其也涵蓋發(fā)現(xiàn)于或可來源于或可獲自或來源于或獲自，或發(fā)現(xiàn)于或可來源于或可獲自或來源于或獲自所述具體登錄號(hào)的等位基因。

種子保藏

實(shí)施例1的兩(2)種番茄TILLING突變體(myb12突變體)的代表性種子樣本是由Nunhems B.V.保藏并根據(jù)布達(dá)佩斯條約按照Expert Solution(EPC 2000,Rule 32(1))于2012年12月5日被接受保藏在NCIMB Ltd.(英國英格蘭，阿伯丁郡AB219YA，巴克斯本，克萊伯斯通區(qū)，弗格森大廈)。種子被給予以下保藏號(hào)：NCIMB 42087(突變體2961)和NCIMB 42088(突變體5505)。

實(shí)施例3的兩(2)種包含番茄突變體(cd2突變體)的株系的代表性種子樣本是由Nunhems B.V.保藏并根據(jù)布達(dá)佩斯條約按照Expert Solution(EPC 2000,Rule 32(1))于2014年7月4日被接受保藏在NCIMB Ltd.(英國英格蘭，阿伯丁郡AB219YA，巴克斯本，克萊伯斯通區(qū)，弗格森大廈)。種子被給予以下保藏號(hào)：NCIMB 42268(突變體8.17)和NCIMB 42269(突變體26428.001)，這兩者均具有相同的光澤度突變(cd2/cd2)。突變體8.17也為存在于突變體2961中Myb12突變等位基因的純合型，并且產(chǎn)生有光澤的粉紅色果實(shí)。此外，將對(duì)于野生型粉紅色(紅色)等位基因和光澤(暗淡)等位基因均為純合型的株系7.9的種子保藏(NCIMB 42267)并且于2014年7月4日被接受保藏在NCIMB Ltd.。

申請(qǐng)人要求，依據(jù)Rule 32(1)EPC或具有類似條款和規(guī)章的國家或條約的相關(guān)法規(guī)，所述生物材料及其衍生的任何材料的樣本只向指定的專業(yè)人員提供，直至專利授權(quán)公告或者提交之日起20年(如果所述申請(qǐng)被駁回、放棄、撤回或視為撤回)。

在本申請(qǐng)未決期間，由美國專利局主任確定的有資格的人員經(jīng)過請(qǐng)求可被授權(quán)獲得所述保藏。受37C.F.R.§1.808(b)的制約，在專利授權(quán)時(shí)，保藏者針對(duì)所保藏材料的公眾可獲得性施加的所有限制都會(huì)被不可撤銷地取消。所述保藏將會(huì)被維持30年，或在最近一次請(qǐng)求之后5年的時(shí)間，或被維持到專利的可實(shí)施期間(enforceable life)，以較長時(shí)間為準(zhǔn)，在此期間如果所述保藏物不能存活，其都要被替換。申請(qǐng)人不會(huì)放棄本申請(qǐng)的專利或植物品種保護(hù)法(7USC 2321et seq.)授予的任何權(quán)利。

實(shí)施例

一般方法

通過服務(wù)公司(BaseClear,The Netherlands,http://www.baseclear.com/)使用與用于擴(kuò)增的引物相同的引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序。使用計(jì)算機(jī)程序(CLC Bio Main Work Bench,Denmark,www.clcbio.com)對(duì)所得到的序列進(jìn)行比對(duì)以鑒定核苷酸的改變。

材料

用于分析和誘變的水是在Milli-Q水整合系統(tǒng)(配有Q-gard T2筒和QuantumTEX筒的Milli-Q型Reference A+)中過濾的自來水。水的電阻為>＝18MOhm。

甲基磺酸乙酯(EMS)(純)獲自Sigma，產(chǎn)品編號(hào)為M0880。

番茄成熟以及表皮顏色和/或番茄果實(shí)顏色的測量

可通過本領(lǐng)域已知的多種方法測量番茄成熟，所述方法例如定期對(duì)果實(shí)進(jìn)行視覺上的評(píng)估和/或測量果實(shí)硬度或軟化度、測量番茄果實(shí)中番茄紅素的含量、果實(shí)的乙烯產(chǎn)生、果實(shí)的顏色或任何替代方法，或者這些方法的組合?？梢岳缤ㄟ^對(duì)使用裝配有適當(dāng)探針(例如3mm的探針)的貫入儀(penetrometer)測量的單位為例如0.1mm的變形阻力進(jìn)行評(píng)估來測量果實(shí)的硬度(Mutschler et al,1992,Horscience 27pp 352-355)(Martinez et al 1995Acta Horticulturae 412pp 463-469)。本領(lǐng)域中存在替代的方法，例如使用食品質(zhì)地測定計(jì)(Bui et al.2010；International Journal of Food Properties,第13卷，第4期pp 830-846)。

可通過新鮮番茄等級(jí)的美國標(biāo)準(zhǔn)(U.S.Dept of Agriculture,1973,US standards for grades of fresh tomatoes,U.S.Dept Agr.Agr.Mktg.Serv.,Washington D.C.)用比色計(jì)測量顏色(Mutschler et al,1992,Horscience27pp 352-355)，或通過將所述顏色與比色圖表如英國皇家園藝學(xué)會(huì)(RHS)比色圖表(www.rhs.org.uk)進(jìn)行比較來對(duì)果實(shí)顏色進(jìn)行分類。

或者，可以通過比色計(jì)測量番茄果實(shí)的外部顏色，產(chǎn)生三個(gè)參數(shù)：亮度、綠色至紅色標(biāo)尺上的色度坐標(biāo)，以及藍(lán)色至黃色標(biāo)尺上的色度坐標(biāo)(Liu et al,2003,Plant Biotechnology Journal 1,pp 195-207)。

可根據(jù)Fish等人(A quantitative assay for lycopene that utilizes reduced volumes of organic solvents.Fish et al.J.Food Compos.Anal.2002,15,309-317)的有機(jī)溶劑的體積降低的方法來確定番茄紅素含量?？蓪⒃摲椒ㄓ糜跍y定在完整的番茄果實(shí)上直接測量的番茄紅素含量，并同時(shí)評(píng)估以下基本理化特征：顏色、硬度、可溶性固體、酸度和pH(Clement et al,J.Agric.Food Chem.2008,56,9813-9818)。

可根據(jù)Ballester et al.2010(見上文)或Slimestad et al.(Slimestad et al 2008,J.Agric.Food Chem.Vol 56,pp 2436-2441)中提供的方案測定類黃酮含量。或者，可選地，可通過分別制備水解的和非水解的提取物將類黃酮作為糖苷配基或作為其糖苷進(jìn)行測定?？墒褂霉怆姸O管檢測通過HPLC制備和分析水解的提取物(溶于0.1％三氟乙酸的25％乙腈)?？山㈤纹に?、柚皮素和山奈酚(0-20_g/mL)的劑量-反應(yīng)曲線以對(duì)所述水解的提取物中的這些化合物進(jìn)行定量?？墒褂?0分鐘的超聲處理在75％甲醇水溶液中制備非水解的提取物。隨后，可使用溶于0.1％三氟乙酸的5至50％乙腈梯度對(duì)所提取的類黃酮物質(zhì)進(jìn)行HPLC。可將洗脫峰的吸收光譜和保留時(shí)間與如Bovy et al(Bovy et al 2002,The Plant Cell vol 14pp 2509-2526)中詳細(xì)記載的市售類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的那些進(jìn)行比較。

用解剖刀從番茄果實(shí)的其余部分(即番茄果實(shí)的果肉)中小心地分離果皮或表皮。從視覺上對(duì)果皮或表皮的顏色進(jìn)行分類。

實(shí)施例1

誘變

將商業(yè)化加工番茄育種中使用的高度純合的近交株系用于使用下述方案的誘變處理。種子在濕潤的紙上吸漲24h后，將被分為各2500粒的8批次的約20,000粒種子浸泡在錐形燒瓶中的100ml超純水和1％濃度的甲基磺酸乙酯(EMS)中。將燒瓶在室溫下輕輕振蕩16小時(shí)。最后，在流水下將EMS沖洗掉。在EMS處理后，將種子直接播種于溫室中。在60％的萌發(fā)種子中，將其中的10600株小植株(plantlet)移植到田里。在這10600株小植株中，有1790株不育或在產(chǎn)生果實(shí)之前死亡。對(duì)于其余的每株M1突變植物，收獲一個(gè)果實(shí)并分離其種子。所得到的群體(命名為M2群體)由各代表一個(gè)M2家族的8810個(gè)種子批組成。其中有585個(gè)家族由于結(jié)實(shí)率低(low seed set)而被從所述群體中排除。

從源自每個(gè)M2種子批的10粒種子的混合物中提取DNA。對(duì)于每個(gè)突變株系，將10粒種子在96孔深孔板的深孔管(http://www.micronic.com)中混合，在每個(gè)管中加入2個(gè)不銹鋼球。將所述管和種子在液氮中冷凍1分鐘并立即將種子以16.8Hz(最大速度的80％)在Deepwell振蕩器(Vaskon 96grinder,Belgium；http://www.vaskon.com)中持續(xù)2分鐘以研磨至成細(xì)粉。將300μl來自植物DNA分離試劑盒(http://www.agowa.de)的裂解緩沖液P加入到樣品板中，并通過在Deepwell振蕩器中以16.8Hz振蕩1分鐘將所述粉末懸浮于溶液中。將板以4000rmp離心10分鐘。使用Janus(Perkin Elmer,USA；http://www.perkinelmer.com)平臺(tái)(96個(gè)分液頭)將75μl上清液移液至96孔Kingfisher板上。使用Perkin Elmer液體處理裝置(liquid handler robot)和96(Thermo labsystems,Finland；http://www.thermo.com)進(jìn)行下述步驟。用結(jié)合緩沖液(150μl)和磁珠(20μl)稀釋含有DNA的上清液。一旦DNA結(jié)合到所述磁珠上，進(jìn)行兩步連續(xù)的洗滌步驟(洗滌緩沖液1：Agowa洗滌緩沖液1 1/3、乙醇1/3、異丙醇1/3；洗滌緩沖液2：70％乙醇、30％Agowa洗滌緩沖液2)并最后將其在洗脫緩沖液(100μl MQ、0.025μl Tween)中洗脫。

研磨10粒番茄種子產(chǎn)生了足以使所述磁珠飽和的DNA，因此，獲得了全部樣品的高度均勻且相當(dāng)?shù)腄NA濃度。和λDNA參照相比，估計(jì)每個(gè)樣品的濃度為30ng/μl。將2倍稀釋的DNA進(jìn)行4倍平板混合(4fold flat pooled)。將2μl混合的DNA用于多重PCR以進(jìn)行突變檢測分析。

使用計(jì)算機(jī)程序(Primer3,http://primer3.sourceforge.net/)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HRM的基因片段的引物。擴(kuò)增產(chǎn)物的長度被限制在200和400個(gè)堿基對(duì)之間。通過應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生單一產(chǎn)物的測試PCR反應(yīng)來測定所述引物的質(zhì)量。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因片段。將10ng基因組DNA與4μl反應(yīng)緩沖液(5×反應(yīng)緩沖液)、2μl 10×LC染料(LCGreen+染料，Idaho Technology Inc.,UT,USA)、各5pmole的正向和反向引物、4nmole dNTP(Life Technologies,NY,USA)和1單位DNA聚合酶(Hot Start II DNA聚合酶)混合，總體積為10μl。反應(yīng)條件為：98℃下30秒，接著40個(gè)循環(huán)的98℃下10秒、60℃下15秒、72℃下25秒，最后72℃下60秒。

已經(jīng)證明，高分辨率熔解曲線分析(HRM)在人類和植物遺傳學(xué)中是靈敏且高通量的方法。HRM是一種非酶學(xué)篩選技術(shù)。在PCR擴(kuò)增過程中，染料(LCGreen+染料，Idaho Technology Inc.,UT,USA)分子插入到雙鏈DNA分子的每對(duì)退火的堿基對(duì)之間。當(dāng)在所述分子中被捕獲時(shí)，所述染料在470nm處的激發(fā)后在510nm處發(fā)射熒光。當(dāng)DNA樣品被逐漸加熱時(shí)，熒光檢測器(LightScanner,Idaho Technology Inc.,UT,USA)中的照相機(jī)記錄熒光強(qiáng)度。在取決于DNA螺旋的序列特異性的穩(wěn)定性的溫度下，雙鏈PCR產(chǎn)物開始熔解，釋放出所述染料。染料的釋放導(dǎo)致熒光降低，其被熒光檢測器記錄為熔解曲線。含有突變的混合物在PCR后的片段混合物中形成異質(zhì)雙鏈體。與同質(zhì)雙鏈體相比，這些被鑒定為差異熔解溫度曲線。

通過重復(fù)對(duì)來自所鑒定的相應(yīng)DNA混合物的單個(gè)M2種子批的DNA進(jìn)行HRM分析來確認(rèn)各個(gè)植物中具體突變的存在情況。當(dāng)基于HRM圖譜在所述4個(gè)單個(gè)M2家族的DNA樣品的一個(gè)中確認(rèn)了所述突變的存在時(shí)，則對(duì)PCR片段進(jìn)行測序以鑒定基因中的突變。

一旦知道了突變，則使用計(jì)算機(jī)程序CODDLe(用于選擇密碼子以優(yōu)化對(duì)有害損傷的發(fā)現(xiàn)http://www.proweb.org/coddle/)來預(yù)測這個(gè)突變的作用，所述程序鑒定了用戶所選擇的基因和其編碼序列的區(qū)域，在該區(qū)域中所期望的點(diǎn)突變最有可能對(duì)基因功能產(chǎn)生有害效應(yīng)。

播種來自包含具有對(duì)蛋白質(zhì)活性的預(yù)期作用的突變的M2家族的種子，用于所述植物的表型分析。

在自交和隨后的選擇之后選擇或獲得純合型的突變體。確定所述突變對(duì)所述植物的相應(yīng)蛋白質(zhì)和表型的作用。

使含有所述不同的經(jīng)鑒定的突變的種子萌發(fā)，并將植物在溫室中種植在帶有土壤的盆中，所述溫室的光暗方案(regime)是16/8，夜間溫度18℃，日間溫度22-25℃。對(duì)于每種基因型，種植了5株植物。將第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每個(gè)花序上留下6朵花，使所述6朵花能夠通過自花授粉坐果。記錄第一和第六朵花坐果的日期以及所述第一和第六顆果實(shí)的破色期和紅色期的日期。在第六顆果實(shí)的破色期，收獲番茄串(truss)并將其儲(chǔ)存于溫室中的開口盒子里。在整個(gè)成熟階段記錄所述果實(shí)的狀況。

在后期，基于對(duì)果實(shí)的視覺評(píng)估來確定果實(shí)狀況，并記錄最老的果實(shí)變“壞”的日期，并進(jìn)一步記錄果實(shí)變質(zhì)情況(由通過夾緊果實(shí)所評(píng)估的進(jìn)一步的果實(shí)軟化度，以及對(duì)脫水/失水、表皮破損和真菌生長的視覺評(píng)估所指示)。

鑒定了下述突變體：突變體2961、突變體5505、突變體5058和突變體6899，并將前兩種突變體的種子以上文給出的登錄號(hào)保藏在NCIMB。包含變體Myb12蛋白5058和6899的植物沒有顯示出無色果皮的表型，因此認(rèn)為它們是Myb12的功能性變體。

與野生型Myb12的cDNA(如SEQ ID NO:4中描述的)相比的核苷酸序列中的突變，以及其對(duì)每個(gè)突變體的蛋白質(zhì)序列的作用已經(jīng)在上文描述(突變體2961和5505)，并且還在圖2中示出。圖2中描述了突變體5058和6899的蛋白質(zhì)序列。

所觀察到的突變體2961中的T182A突變和突變體5505中的G148C突變在以下意義上是值得注意的：這兩種突變在EMS突變體中都較不常見。通常，EMS導(dǎo)致鳥嘌呤的乙基化，獲得引起乙基鳥嘌呤與胸腺嘧啶的錯(cuò)配的乙基鳥嘌呤。這導(dǎo)致G至A和C至T的突變(Krieg(1963)Genetics 48pp 561-580)。

在所述靶序列中包含突變的植物(例如上文的突變植物或由其得到的(例如通過自交或雜交)并包含突變myb12等位基因的植物)與野生型植物相比，除突變體2961和5505的番茄果實(shí)顏色外，表現(xiàn)出所有植物部分的正常營養(yǎng)生長。其他兩種突變體(5058和6899)與野生型相比具有正常的番茄果實(shí)顏色。從表型上篩選在所述靶序列中包含突變的植物的果實(shí)顏色。

在所述靶cd2序列中包含突變的植物(例如上文的突變植物或由其得到的(例如通過自交或雜交)并包含突變cd2等位基因的植物)與野生型植物相比，除突變體2961和5505的番茄果實(shí)光澤度外，表現(xiàn)出所有植物部分的正常營養(yǎng)生長。其他兩種突變體(5058和6899)與野生型相比具有正常的番茄果實(shí)顏色。從表型上篩選在所述靶序列中包含突變的植物的果實(shí)顏色。

實(shí)施例2

番茄果實(shí)的果實(shí)顏色確定

使含有所述不同突變的種子萌發(fā)，并將植物在溫室中種植在帶有土壤的盆中，所述溫室的光暗方案是16/8，夜間溫度18℃，日間溫度22-25℃。對(duì)于每種基因型，種植了5株植物。將第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每個(gè)花序上留下6朵花，使所述6朵花能夠通過自花授粉坐果。記錄第一和第六朵花坐果的日期，以及第一和第六顆果實(shí)的破色期和紅色期的日期。在第四顆果實(shí)的紅色期，收獲番茄串(truss)并將其儲(chǔ)存于溫室中的開口盒子里。在整個(gè)成熟過程中記錄所述果實(shí)的狀況。

在橙色期后期和紅色期，從視覺上確定果實(shí)和表皮的顏色。果實(shí)和表皮的顏色可例如通過將顏色與英國皇家園藝學(xué)會(huì)(RHS)的比色圖表(http://www.rhs.org.uk/Plants/RHS-Publications/RHS-colour-charts)的色碼進(jìn)行比對(duì)來表征。

突變體2961(圖2中的突變體1，純合型)的果實(shí)在紅熟期具有粉紅色表型和無色透明的表皮。突變體5505(圖2中的突變體2，純合型)的果實(shí)在紅熟期也具有粉紅色的表型和較淺顏色的/無色的透明表皮。在紅色期中的一些天之后，突變體5505(myb12突變純合型)的果實(shí)形成少量類黃酮，所述類黃酮存在于主要在果實(shí)的肩部(shoulder)上的表皮(即皮)中。除了所述粉紅色果實(shí)表型，兩種突變體對(duì)植物都不具有任何其他明顯的多效作用。

myb12突變雜合型(即Myb12/myb12)的突變體5505(圖2中的突變體2雜合型，雜合型)的果實(shí)在紅熟期具有紅色果實(shí)表型和橙色表皮。

在如上所述的實(shí)驗(yàn)1的群體中鑒定了其他兩個(gè)突變體(5058和6899)。5058的番茄果實(shí)在果實(shí)發(fā)育的紅色期是紅色的。突變體6899(圖2中的突變體3，純合型)的番茄果實(shí)也具有紅色的果實(shí)。因此，氨基酸置換G68R和E20K似乎不影響蛋白質(zhì)功能，這兩種突變體可被認(rèn)為是Myb12的功能性變體。

所鑒定的所有四(4)種myb12突變體都在myb12蛋白中包含突變，如圖2所示，并且它們中全部產(chǎn)生所述突變的myb12蛋白。然而，突變對(duì)myb12蛋白的功能的作用不同：它們中只有兩(2)種具有由異常的myb12蛋白功能引起的粉紅色表型。因此，似乎并非所有的myb12突變體都導(dǎo)致無色的果皮和粉紅色的番茄果實(shí)。本發(fā)明的粉紅色番茄包含導(dǎo)致無色果皮表型的特定的遺傳結(jié)構(gòu)(set-up)。

實(shí)施例3

番茄果實(shí)的果實(shí)光澤度確定

對(duì)來自不同的內(nèi)部Nunhems專有育種系的果實(shí)的果實(shí)光澤度進(jìn)行評(píng)分(從視覺上評(píng)分，不顯示數(shù)據(jù))。選擇一種具有高的果實(shí)光澤度且具有紅色果實(shí)的株系以與能夠產(chǎn)生粉紅色番茄的番茄植物雜交。將這種材料(突變體26428.001)的種子以NCIMB 42269保藏。

性狀遺傳研究表明，兩種性狀(粉紅色和光澤度)各自為單基因的，即由單個(gè)基因引起。使用育種技術(shù)如雜交、自交和回交，這兩種性狀最初不能組合，表明所述性狀位于相同的染色體(染色體1)上，并且由于低重組率，假定這些性狀(粉紅色的果實(shí)顏色和光澤度)的兩個(gè)等位基因彼此靠近，并且不可能重組。最終，本發(fā)明人成功地獲得了所需的重組，并且能夠產(chǎn)生突變myb12等位基因的純合型和雜合型以及cd2等位基因的純合型和雜合型的番茄植物。將myb12等位基因的純合型和突變cd2等位基因(突變體8.17；編碼SEQ ID NO：11的突變cd2蛋白)的純合型的植物的種子以NCIMB 42268保藏。對(duì)于粉紅色和光澤突變之一或兩者的純合型或雜合型的本發(fā)明植物均顯示出正常生長行為和正常植物特征(除了果實(shí)顏色和光澤度)，即不因?yàn)榉奂t色突變體的TILLING背景而存在負(fù)面(negative)植物特征。

使含有所述不同突變的種子萌發(fā)，并將植物在溫室中種植在帶有土壤的盆中，所述溫室的光暗方案是16/8，夜間溫度18℃，日間溫度22-25℃。對(duì)于每種基因型，種植了5株植物。將第二、第三和第四花序用于分析。修剪所述花序，在每個(gè)花序上留下6朵花，使所述6朵花能夠通過自花授粉坐果。記錄第一和第六朵花坐果的日期，以及第一和第六顆果實(shí)的破色期和紅色期的日期。在第四顆果實(shí)的紅色期，收獲番茄串(truss)并將其儲(chǔ)存于溫室中的開口盒子里。在整個(gè)成熟過程中記錄所述果實(shí)的狀況。

在綠熟期、橙色期和紅色期(紅熟期或RR)從視覺上確定果實(shí)光澤度。將果實(shí)光澤度按照下述相對(duì)等級(jí)進(jìn)行評(píng)分：

+例如對(duì)于粉紅色果實(shí)(突變粉紅色基因的純合型，myb12/myb12)，野生型光澤性狀的純合型(即由于CD2/CD2而顯示出暗淡或無光澤)；至

++++++例如對(duì)于紅色果實(shí)(突變粉紅色基因的雜合型，Myb12/myb12，或野生型Myb12等位基因的純合型，Myb12/Myb12)，突變型光澤性狀的純合型(例如cd2/cd2)。

此外，使用光澤計(jì)(GlossMeter)(ETB-0686Gloss Meter，Graigar，Guangdong China)對(duì)光澤度進(jìn)行定量(在紅熟期)。使用該光澤計(jì)測量鏡面反射。光強(qiáng)度在預(yù)設(shè)60度的反射角上記錄。光澤計(jì)的測量結(jié)果與從具有確定折射率的黑色玻璃標(biāo)準(zhǔn)品(其與ETB-0686光澤計(jì)一起)的反射光的量有關(guān)。該確定的標(biāo)準(zhǔn)品的測量值為100光澤單位。為了防止污染光線(contaminating light)(即來自周圍環(huán)境)的影響，所述測量在暗室中進(jìn)行。果實(shí)的光澤度在整個(gè)果實(shí)上并不是均勻分布的。因此，通過測量正好在花梗(pedicel)和果頂(blossom end)之間的果皮上的4個(gè)位置處的光反射，來確定每個(gè)果實(shí)的光澤度。每個(gè)基因型測定4個(gè)果實(shí)，將這些由此獲得的16次測量結(jié)果的平均值作為光澤度的相對(duì)值。這些光澤度測量的結(jié)果示于下表1中。

野生型(7.9)的果實(shí)在紅熟期顯示出正常的紅色番茄顏色和反射。突變體7.67(來自NCIMB 42269的純合的粉紅色、雜合的光澤等位基因)的果實(shí)為粉紅色，并且比野生型更有一些光澤。突變體7.22(來自NCIMB 42087的純合的myb12等位基因；來自NCIMB 42269的純合的光澤突變體)的果實(shí)具有粉紅色的非常有光澤的果實(shí)。

使用以NCIMB 42269保藏的光澤突變體(產(chǎn)生如SEQ ID NO:11中的cd2蛋白)進(jìn)行的常規(guī)育種表明，根據(jù)植物株系，植物果實(shí)顯示出對(duì)光澤度的中間表型效應(yīng)，即在NCIMB 42269中存在的cd2等位基因雜合型的植物所具有的光澤度比野生型植物的更高，但低于突變cd2等位基因純合型的植物的果實(shí)。

表1：使用ETB-0686光澤計(jì)確定的光澤度測量

序列表

<110> 紐海姆有限公司

<120> 具有粉紅色光澤果實(shí)的番茄植物

<130> BCS 14-8015

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> 番茄（Lycopersicon esculentum）

<400> 1

Met Gly Arg Thr Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Ile Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Ile Ser Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Ile Thr Ser Gln Glu Glu Asp Ile Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Thr Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Glu His Leu

85 90 95

Ser Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Val Asp Ser Leu Arg Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro

115 120 125

Lys Ala Val Val Asp Leu Ala Lys Lys Gly Ile Pro Lys Pro Ile Lys

130 135 140

Lys Ser Ser Ile Ser Arg Pro Lys Asn Lys Lys Ser Asn Leu Leu Glu

145 150 155 160

Lys Glu Ala Leu Cys Cys Thr Asn Met Pro Ala Cys Asp Ser Ala Met

165 170 175

Glu Leu Met Gln Glu Asp Leu Ala Lys Ile Glu Val Pro Asn Ser Trp

180 185 190

Ala Gly Pro Ile Glu Ala Lys Gly Ser Leu Ser Ser Asp Ser Asp Ile

195 200 205

Glu Trp Pro Arg Leu Glu Glu Ile Met Pro Asp Val Val Ile Asp Asp

210 215 220

Glu Asp Lys Asn Thr Asn Phe Ile Leu Asn Cys Phe Arg Glu Glu Val

225 230 235 240

Thr Ser Asn Asn Val Gly Asn Ser Tyr Ser Cys Ile Glu Glu Gly Asn

245 250 255

Lys Lys Ile Ser Ser Asp Asp Glu Lys Ile Lys Leu Leu Met Asp Trp

260 265 270

Gln Asp Asn Asp Glu Leu Val Trp Pro Thr Leu Pro Trp Glu Leu Glu

275 280 285

Thr Asp Ile Val Pro Ser Trp Pro Gln Trp Asp Asp Thr Asp Thr Asn

290 295 300

Leu Leu Gln Asn Cys Thr Asn Asp Asn Asn Asn Tyr Glu Glu Ala Thr

305 310 315 320

Thr Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn His Ser Thr Ile Val Ser Trp Leu

325 330 335

Leu Ser

<210> 2

<211> 60

<212> PRT

<213> 番茄

<400> 2

Met Gly Arg Thr Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Ile Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Ile Ser Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr

50 55 60

<210> 3

<211> 338

<212> PRT

<213> 番茄

<400> 3

Met Gly Arg Thr Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Ile Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Ile Ser Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Arg Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Ile Thr Ser Gln Glu Glu Asp Ile Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Thr Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Glu His Leu

85 90 95

Ser Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Val Asp Ser Leu Arg Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro

115 120 125

Lys Ala Val Val Asp Leu Ala Lys Lys Gly Ile Pro Lys Pro Ile Lys

130 135 140

Lys Ser Ser Ile Ser Arg Pro Lys Asn Lys Lys Ser Asn Leu Leu Glu

145 150 155 160

Lys Glu Ala Leu Cys Cys Thr Asn Met Pro Ala Cys Asp Ser Ala Met

165 170 175

Glu Leu Met Gln Glu Asp Leu Ala Lys Ile Glu Val Pro Asn Ser Trp

180 185 190

Ala Gly Pro Ile Glu Ala Lys Gly Ser Leu Ser Ser Asp Ser Asp Ile

195 200 205

Glu Trp Pro Arg Leu Glu Glu Ile Met Pro Asp Val Val Ile Asp Asp

210 215 220

Glu Asp Lys Asn Thr Asn Phe Ile Leu Asn Cys Phe Arg Glu Glu Val

225 230 235 240

Thr Ser Asn Asn Val Gly Asn Ser Tyr Ser Cys Ile Glu Glu Gly Asn

245 250 255

Lys Lys Ile Ser Ser Asp Asp Glu Lys Ile Lys Leu Leu Met Asp Trp

260 265 270

Gln Asp Asn Asp Glu Leu Val Trp Pro Thr Leu Pro Trp Glu Leu Glu

275 280 285

Thr Asp Ile Val Pro Ser Trp Pro Gln Trp Asp Asp Thr Asp Thr Asn

290 295 300

Leu Leu Gln Asn Cys Thr Asn Asp Asn Asn Asn Tyr Glu Glu Ala Thr

305 310 315 320

Thr Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn His Ser Thr Ile Val Ser Trp Leu

325 330 335

Leu Ser

<210> 4

<211> 1017

<212> DNA

<213> 番茄

<400> 4

atgggaagaa caccttgttg tgaaaaagtg ggcatcaaga gaggcagatg gactgcagaa 60

gaagatcaaa ttctcactaa ttatattatt tctaatggag aaggctcttg gaggtcgtta 120

cctaaaaatg ccggattatt gagatgcgga aagagttgta gactacgatg gattaattat 180

ttgaggtctg atctcaagag agggaacatt acttctcaag aggaagatat aattataaag 240

ttacatgcaa ctttgggtaa cagatggtct cttatagcag aacatttatc aggtagaaca 300

gacaatgaga taaaaaacta ttggaactct catctaagtc gaaaagttga tagcttaagg 360

ataccaagcg atgagaagtt acctaaagcc gtagttgatt tggctaaaaa aggtataccg 420

aagccaatta aaaaatcatc gattagtcga ccaaaaaata aaaagtcaaa cttattagaa 480

aaagaagcat tgtgttgtac aaatatgcca gcttgtgata gtgccatgga attaatgcaa 540

gaagatctag caaagataga ggtgccaaat tcttgggcag gacctataga ggccaaggga 600

agccttagtt cagatagtga tatcgaatgg ccaagactcg aggagattat gccagacgtg 660

gtgattgatg atgaagataa gaacacaaat ttcatattga attgtttcag agaagaagta 720

acgagcaata atgtagggaa tagttattca tgtatcgagg aaggtaataa aaagatatca 780

agcgacgatg aaaaaatcaa attattaatg gattggcaag ataatgatga gttagtatgg 840

ccaacgttac catgggaatt agaaacggat atagttccca gttggccaca atgggacgat 900

actgacacta acttacttca aaattgcacc aatgataata ataattatga agaagcaaca 960

acaatggaaa ttaataacca aaatcatagt accattgtat cttggctttt gtcttag 1017

<210> 5

<211> 1017

<212> DNA

<213> 番茄

<400> 5

atgggaagaa caccttgttg tgaaaaagtg ggcatcaaga gaggcagatg gactgcagaa 60

gaagatcaaa ttctcactaa ttatattatt tctaatggag aaggctcttg gaggtcgtta 120

cctaaaaatg ccggattatt gagatgcgga aagagttgta gactacgatg gattaattat 180

tagaggtctg atctcaagag agggaacatt acttctcaag aggaagatat aattataaag 240

ttacatgcaa ctttgggtaa cagatggtct cttatagcag aacatttatc aggtagaaca 300

gacaatgaga taaaaaacta ttggaactct catctaagtc gaaaagttga tagcttaagg 360

ataccaagcg atgagaagtt acctaaagcc gtagttgatt tggctaaaaa aggtataccg 420

aagccaatta aaaaatcatc gattagtcga ccaaaaaata aaaagtcaaa cttattagaa 480

aaagaagcat tgtgttgtac aaatatgcca gcttgtgata gtgccatgga attaatgcaa 540

gaagatctag caaagataga ggtgccaaat tcttgggcag gacctataga ggccaaggga 600

agccttagtt cagatagtga tatcgaatgg ccaagactcg aggagattat gccagacgtg 660

gtgattgatg atgaagataa gaacacaaat ttcatattga attgtttcag agaagaagta 720

acgagcaata atgtagggaa tagttattca tgtatcgagg aaggtaataa aaagatatca 780

agcgacgatg aaaaaatcaa attattaatg gattggcaag ataatgatga gttagtatgg 840

ccaacgttac catgggaatt agaaacggat atagttccca gttggccaca atgggacgat 900

actgacacta acttacttca aaattgcacc aatgataata ataattatga agaagcaaca 960

acaatggaaa ttaataacca aaatcatagt accattgtat cttggctttt gtcttag 1017

<210> 6

<211> 1017

<212> DNA

<213> 番茄

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atgggaagaa caccttgttg tgaaaaagtg ggcatcaaga gaggcagatg gactgcagaa 60

gaagatcaaa ttctcactaa ttatattatt tctaatggag aaggctcttg gaggtcgtta 120

cctaaaaatg ccggattatt gagatgccga aagagttgta gactacgatg gattaattat 180

ttgaggtctg atctcaagag agggaacatt acttctcaag aggaagatat aattataaag 240

ttacatgcaa ctttgggtaa cagatggtct cttatagcag aacatttatc aggtagaaca 300

gacaatgaga taaaaaacta ttggaactct catctaagtc gaaaagttga tagcttaagg 360

ataccaagcg atgagaagtt acctaaagcc gtagttgatt tggctaaaaa aggtataccg 420

aagccaatta aaaaatcatc gattagtcga ccaaaaaata aaaagtcaaa cttattagaa 480

aaagaagcat tgtgttgtac aaatatgcca gcttgtgata gtgccatgga attaatgcaa 540

gaagatctag caaagataga ggtgccaaat tcttgggcag gacctataga ggccaaggga 600

agccttagtt cagatagtga tatcgaatgg ccaagactcg aggagattat gccagacgtg 660

gtgattgatg atgaagataa gaacacaaat ttcatattga attgtttcag agaagaagta 720

acgagcaata atgtagggaa tagttattca tgtatcgagg aaggtaataa aaagatatca 780

agcgacgatg aaaaaatcaa attattaatg gattggcaag ataatgatga gttagtatgg 840

ccaacgttac catgggaatt agaaacggat atagttccca gttggccaca atgggacgat 900

actgacacta acttacttca aaattgcacc aatgataata ataattatga agaagcaaca 960

acaatggaaa ttaataacca aaatcatagt accattgtat cttggctttt gtcttag 1017

<210> 7

<211> 5185

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<221> 外顯子

<222> (1034)..(1167)

<223> 外顯子 1

<220>

<221> 外顯子

<222> (1258)..(1386)

<223> 外顯子 2

<220>

<221> 外顯子

<222> (2824)..(3173)

<223> 外顯子 3

<220>

<221> 外顯子

<222> (3767)..(4170)

<223> 外顯子 4

<400> 7

gatgttgatc gaaagggagc gaatagagta cgttatttga tttttaaata ataatactcg 60

aggtttgaaa ataaaatttt agaacaatcg aaattgaggg tatcgaatat gtttaacctt 120

aaaacggtac aattatttag atttatagac ttcaatcaag gacatatata aggattaaga 180

tagtcacaaa cacgtgattt gtatactata ttttgattaa tgaatgggca aattaaaatg 240

aaataacaaa tatatattta taacgagaca taaatacgtt aagtaaatag aattagttct 300

gaaatccgat gtcgatagct agcaacgtca tcgaataacc ttgattatat tggtattaat 360

tgaaacaaat ataacgtaga acaaattaag ctcaagatct taaaaacaca taaagatatt 420

acattactac aaatgaatta aaaaatgcga taatttacaa tgaaggaaaa ggaatttttt 480

tattaagtaa aatcatagag taatcaccac ccactatgac tcccatctac ctggttaaag 540

aaaaattagc ataaaaaagt cttttatata tatatatata tatatgaagc aaagtgttct 600

aattatgaat aaagaaatat ttattagatt ataacgatga ttatatttag gatggagcta 660

gcaatttatc agaggattca cctcttttaa tgaaaaatat tattatctgt acataattaa 720

aatgattttt ttttataata tacaataaat atcaaattcc cttcaattat tttatacatt 780

tattttttta agttttaaat ttttttttat taaaaatctt aactcttctt ttatcaaaga 840

gtgacatgca atgcaaaaaa gcttattaag tcaacctttg gtacgttatt aagttcacat 900

aaaattaact agactaaagt gaagagcggg gtccatttat ttgtgttgtc tctctattta 960

ttggcatttc tattggtgaa atgagactaa ttttcattgc cttttgcttc tccattttgt 1020

gataataata ata atg gga aga aca cct tgt tgt gaa aaa gtg ggc atc 1069

Met Gly Arg Thr Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Ile

1 5 10

aag aga ggc aga tgg act gca gaa gaa gat caa att ctc act aat tat 1117

Lys Arg Gly Arg Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Thr Asn Tyr

15 20 25

att att tct aat gga gaa ggc tct tgg agg tcg tta cct aaa aat gcc 1165

Ile Ile Ser Asn Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala

30 35 40

gg tacgattacc tactaatctt ttattttaat ttgaaattta aaattttttt 1217

Gly

45

cttcgtttaa cagttttttt ataatatttt atttcgaagg a tta ttg aga tgc gga 1273

Leu Leu Arg Cys Gly

50

aag agt tgt aga cta cga tgg att aat tat ttg agg tct gat ctc aag 1321

Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp Leu Lys

55 60 65

aga ggg aac att act tct caa gag gaa gat ata att ata aag tta cat 1369

Arg Gly Asn Ile Thr Ser Gln Glu Glu Asp Ile Ile Ile Lys Leu His

70 75 80

gca act ttg ggt aac ag gtaattagtc aattacttga ttggactttt 1416

Ala Thr Leu Gly Asn Arg

85

tagcttgcta attaaaccac tcattttgtt tctttttagt ctaggtccag aaaaaaatgt 1476

ctcctttaaa atcaagtact ttcttcgttt aaaaaataat aattttattt ttatttagtc 1536

tgttttataa agaatgactt tttttttagt aatatgttaa atttaatttt tcacatgaca 1596

tctttaaaat tataaaatta gagatagttt gatacatttg acataacttt aatttagaat 1656

cacttctttc ttttcttaaa atccgtttca agtcaaatag gtcattcttt tttatacgca 1716

agaagtattt ttttctttaa aaataaatct gaaactcatt ttaggttata aacattgtca 1776

caataatttg gtgcccgatc taacaacact tcttatatca ttttagtgtg tgaatagtgt 1836

tacaccaaat ttaatacaac aaaattactc atcaaaatta ttactattca tgataacata 1896

gtgtaatgga ttcgagctag agaaagaata aataatatgt tttaggtaaa taatattaat 1956

ggattcgagc tagagaaaga ataaataata tgttttaggt aaataatatt ccatttgctt 2016

aaaaaaataa tctttttttt taaaaaaaga atgatttctt ttactttcag atatatttta 2076

atctcagctg ttgttcgtgt gataagttta atatcatata atactttgct ttatttgaca 2136

taattttaat ttagatttat aaaattaata atttttttta ttttcttaaa tatcgtgtta 2196

aattaaacta ggtcaatggt ataattgatt gaagtagatg ccctaataaa taaaagtgag 2256

atcaatgcaa ttataattaa cttaaattca tcacttcttt tttactactt gaattcatca 2316

cataaaacaa atgaattttt cttcttcttt tatttcatgt ttactccagt acttaatagt 2376

ttatagttat gtttgcctgg aaaaaggaga aaagttttgg tcactttaat ttgtagggta 2436

ttattttcta cattcattat ttgtgctaat gaattaataa gttaattaaa ttggtcccct 2496

cgagtaagtt caatattact cttttttttt tctttttcat atgacgagtg acatattcat 2556

gctttaaaaa caattcatcc tttctattat tagtcatata ccaagtctag aaaataaaac 2616

agtgacaatt taaagtattt tttcaaacta gaaaacgtat cttaagttgg atgtatacac 2676

aaatatatca aataatttca acaaagaaaa aatttagaaa agatgtgtta gttgtgagtt 2736

gtgacattaa atatgattga ttaatacaat ataccatcga tctagtttct aacattttct 2796

agtatcatcg actttttaaa attacag a tgg tct ctt ata gca gaa cat tta 2848

Trp Ser Leu Ile Ala Glu His Leu

90 95

tca ggt aga aca gac aat gag ata aaa aac tat tgg aac tct cat cta 2896

Ser Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

agt cga aaa gtt gat agc tta agg ata cca agc gat gag aag tta cct 2944

Ser Arg Lys Val Asp Ser Leu Arg Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro

115 120 125

aaa gcc gta gtt gat ttg gct aaa aaa ggt ata ccg aag cca att aaa 2992

Lys Ala Val Val Asp Leu Ala Lys Lys Gly Ile Pro Lys Pro Ile Lys

130 135 140

aaa tca tcg att agt cga cca aaa aat aaa aag tca aac tta tta gaa 3040

Lys Ser Ser Ile Ser Arg Pro Lys Asn Lys Lys Ser Asn Leu Leu Glu

145 150 155 160

aaa gaa gca ttg tgt tgt aca aat atg cca gct tgt gat agt gcc atg 3088

Lys Glu Ala Leu Cys Cys Thr Asn Met Pro Ala Cys Asp Ser Ala Met

165 170 175

gaa tta atg caa gaa gat cta gca aag ata gag gtg cca aat tct tgg 3136

Glu Leu Met Gln Glu Asp Leu Ala Lys Ile Glu Val Pro Asn Ser Trp

180 185 190

gca gga cct ata gag gcc aag gga agc ctt agt tca g gtacaaattt 3183

Ala Gly Pro Ile Glu Ala Lys Gly Ser Leu Ser Ser

195 200

cgatgttttg actatttttt attgtgaaat ttgattttaa aaaatatttt ttgatattaa 3243

agtgaaaaat aatattcaaa atttatttaa gttgtgtttg gttatgaata tgaattagag 3303

ttgttttttt cattttttcc tcaattattt cgagtaaacc tttttttttc tttaaagaat 3363

tgaaatttta ttgtcaaata tgattctctg agttttaact atcgaaaaaa gcgaaaaaga 3423

tcaaacaccc tctaatagtt tttattaatc aattaaatac attttcaata gtgactatga 3483

cgacataata tttatatatt gaaatatatg attattttat caaaaaactt aaaatttaat 3543

tttcacgtct ttcttttctt ttgaaacgtc attttttata tgtacctttt agatccaata 3603

tctatctatg gatagacgtt gcgaagtact ttttgttatt ttcaattatt aggcacaaat 3663

aattgaatct agcacctctt gtatgtacaa aattttaaac tgtagcaata aataaatata 3723

ttttttaatt tttttaaatt tttatttttt tttgtctgag cag at agt gat atc 3777

Asp Ser Asp Ile

205

gaa tgg cca aga ctc gag gag att atg cca gac gtg gtg att gat gat 3825

Glu Trp Pro Arg Leu Glu Glu Ile Met Pro Asp Val Val Ile Asp Asp

210 215 220

gaa gat aag aac aca aat ttc ata ttg aat tgt ttc aga gaa gaa gta 3873

Glu Asp Lys Asn Thr Asn Phe Ile Leu Asn Cys Phe Arg Glu Glu Val

225 230 235 240

acg agc aat aat gta ggg aat agt tat tca tgt atc gag gaa ggt aat 3921

Thr Ser Asn Asn Val Gly Asn Ser Tyr Ser Cys Ile Glu Glu Gly Asn

245 250 255

aaa aag ata tca agc gac gat gaa aaa atc aaa tta tta atg gat tgg 3969

Lys Lys Ile Ser Ser Asp Asp Glu Lys Ile Lys Leu Leu Met Asp Trp

260 265 270

caa gat aat gat gag tta gta tgg cca acg tta cca tgg gaa tta gaa 4017

Gln Asp Asn Asp Glu Leu Val Trp Pro Thr Leu Pro Trp Glu Leu Glu

275 280 285

acg gat ata gtt ccc agt tgg cca caa tgg gac gat act gac act aac 4065

Thr Asp Ile Val Pro Ser Trp Pro Gln Trp Asp Asp Thr Asp Thr Asn

290 295 300

tta ctt caa aat tgc acc aat gat aat aat aat tat gaa gaa gca aca 4113

Leu Leu Gln Asn Cys Thr Asn Asp Asn Asn Asn Tyr Glu Glu Ala Thr

305 310 315 320

aca atg gaa att aat aac caa aat cat agt acc att gta tct tgg ctt 4161

Thr Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn His Ser Thr Ile Val Ser Trp Leu

325 330 335

ttg tct tag aaatataata atatgacatt atatattgct tttgaatata 4210

Leu Ser

ttactcaact ctttttgttt cgttttatat ttggaatgtg ggaattagaa tgactagttt 4270

atgtacatat tttaagtttc gttagaaata tcgtcaagtc agattaaaat atgtatgagt 4330

tgatgtagta ataaatgtta ttgttattac tttttttgat gtaattgaag tgtcttaatt 4390

tgattagaaa gtaaagttaa aatacagtga aattttttaa aaatttaatt tttttttgtt 4450

tagaatatca aattaatata atctaattta atttttaaaa ttaattaaat tgactttcga 4510

aaatggaaca tgaaaattaa aagtggagaa gtagaaaaac actgacaaat taattaaaca 4570

aagaagaata aacaaatatg ctcataaact tggttttatt tagtatttat gatctttcaa 4630

ttacatataa gtagatattt aaatttgtat aaagttaaac aaataaatat catgtgacat 4690

attacacgta aaatatcatg taaacgtaaa ttgttatgca caacatgtat atttagtttt 4750

ttaattcctt acaaaagaaa acatttaaag aaaaaaacta atcattaaaa atagacactt 4810

tattaaattg aacgaaataa aatactaaat tgagaaaaat aataattagg cttttataat 4870

acattgataa aacaaaccag atataacaca tgaatatgct cataaaagta gtctcattta 4930

atatatatat atatatatat atactaaaaa tttatataaa attatacaaa taaatatatg 4990

tcttacataa tatttcccga gaatcaataa gaaaataagt gctaagtttc agatcagtaa 5050

cgaactggct tcttgagaag ctcattccca ccgcacagct ccagcttgca accacagggg 5110

cccgtcaatt atcaaataaa aaagggcaac ttatttattc tacttattca atttttaata 5170

aatctaagta accat 5185

<210> 8

<211> 338

<212> PRT

<213> 番茄

<400> 8

Met Gly Arg Thr Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Ile Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Ile Ser Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Arg Asn Ile Thr Ser Gln Glu Glu Asp Ile Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Thr Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Glu His Leu

85 90 95

Ser Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Val Asp Ser Leu Arg Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro

115 120 125

Lys Ala Val Val Asp Leu Ala Lys Lys Gly Ile Pro Lys Pro Ile Lys

130 135 140

Lys Ser Ser Ile Ser Arg Pro Lys Asn Lys Lys Ser Asn Leu Leu Glu

145 150 155 160

Lys Glu Ala Leu Cys Cys Thr Asn Met Pro Ala Cys Asp Ser Ala Met

165 170 175

Glu Leu Met Gln Glu Asp Leu Ala Lys Ile Glu Val Pro Asn Ser Trp

180 185 190

Ala Gly Pro Ile Glu Ala Lys Gly Ser Leu Ser Ser Asp Ser Asp Ile

195 200 205

Glu Trp Pro Arg Leu Glu Glu Ile Met Pro Asp Val Val Ile Asp Asp

210 215 220

Glu Asp Lys Asn Thr Asn Phe Ile Leu Asn Cys Phe Arg Glu Glu Val

225 230 235 240

Thr Ser Asn Asn Val Gly Asn Ser Tyr Ser Cys Ile Glu Glu Gly Asn

245 250 255

Lys Lys Ile Ser Ser Asp Asp Glu Lys Ile Lys Leu Leu Met Asp Trp

260 265 270

Gln Asp Asn Asp Glu Leu Val Trp Pro Thr Leu Pro Trp Glu Leu Glu

275 280 285

Thr Asp Ile Val Pro Ser Trp Pro Gln Trp Asp Asp Thr Asp Thr Asn

290 295 300

Leu Leu Gln Asn Cys Thr Asn Asp Asn Asn Asn Tyr Glu Glu Ala Thr

305 310 315 320

Thr Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn His Ser Thr Ile Val Ser Trp Leu

325 330 335

Leu Ser

<210> 9

<211> 338

<212> PRT

<213> 番茄

<400> 9

Met Gly Arg Thr Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Ile Lys Arg Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Lys Glu Asp Gln Ile Leu Thr Asn Tyr Ile Ile Ser Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ser Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Ile Thr Ser Gln Glu Glu Asp Ile Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ala Thr Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Glu His Leu

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Ser Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Val Asp Ser Leu Arg Ile Pro Ser Asp Glu Lys Leu Pro

115 120 125

Lys Ala Val Val Asp Leu Ala Lys Lys Gly Ile Pro Lys Pro Ile Lys

130 135 140

Lys Ser Ser Ile Ser Arg Pro Lys Asn Lys Lys Ser Asn Leu Leu Glu

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gaatctcttt tcaaggagtg tcctcatcct gatgagaaac aaaggttgga gttaagcaaa 480

aggctttctt tggagactag acaagtcaag ttttggttcc aaaatcgtag aactcagatg 540

aagactcaac tggaacgcca tgagaattcg atactaaggc aagagaatga taagcttcgt 600

gcagaaaaca tgtctataag agaggcaatg agaaatccaa tttgtactaa ttgtggtggt 660

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<223> 外顯子 1

<220>

<221> 外顯子

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<220>

<221> 外顯子

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<220>

<221> 外顯子

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<220>

<221> 外顯子

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<220>

<221> 外顯子

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<220>

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<220>

<221> 外顯子

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<220>

<221> 外顯子

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<223> 外顯子 9

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gagagagatg acatctaaat ttattaaaat tttaataagt agttaataaa atattctgaa 300

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tttactctgg catttcattt tcttcttgtg ttaaatctct gtttgttttt tttacagtaa 1680

aaagtttaaa ctgtgaaaaa aaaaaaaagc tacacatttt ttcacagttt gacggtagat 1740

ttcaagaatt agagagaggg gttgggggtt gaaggggagt ggggtggggg tgaaagagtc 1800

aaccaaacct ttttctgtgc tgttttggct gtatgtatat gtaaggcttc gatgagtcca 1860

caattttgcg tattatcttc accttttttt ttttggtttt tagtattatt tttttctact 1920

gttgttaccc ctttttctat ctctcgtctc ttctattgtc tttgcaaaac tgattaaaca 1980

aagccttttt agcttctttt tctctcactt ccttttctgt gctttatttt ttattttttt 2040

ggtttacaaa agtcaagcat gcagagatac atacatataa cagaacagaa aaatgccctc 2100

taacttaggg ttttgcttgc ttaaaccatt cttttaagta tctatgcttt tgtatttgca 2160

gttaatgatt agtttaagaa aggtcccttt ttttttttta ctgttttgtt aggagggaga 2220

gaagagaaat tttaattagt actgttattt aaggaaagta tagagaagag aaaggcaaag 2280

agtagcacaa gttaagggtt tttttttttt ggctttcttt tcttgttatt tttctttcaa 2340

gagtaaaaat tagagaggaa gttggagaca tttggattcg tccttgtgtc tcctctacct 2400

ctcataattt ttctcccaac tttttagctc aaaaaagata cagtgaatct gtcaaatata 2460

caaaaaaaga aaaagtttag ttctttttga gtttctcttg ctttatttc atg aat ttt 2518

Met Asn Phe

1

ggg ggt ttt ctt gat aat aat tct ggt ggt ggc ggt gca aga att gtt 2566

Gly Gly Phe Leu Asp Asn Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ile Val

5 10 15

gct gat ata cca ttt aat cac aac aac agc agc agc aac aac gac aat 2614

Ala Asp Ile Pro Phe Asn His Asn Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asp Asn

20 25 30 35

aaa aac aat atg ccc act ggt gca att tct cag cca aga ctt ctt cct 2662

Lys Asn Asn Met Pro Thr Gly Ala Ile Ser Gln Pro Arg Leu Leu Pro

40 45 50

caa tct ctt gcc aag aac atg ttc aac tcc cca gga ctt tct ctt gct 2710

Gln Ser Leu Ala Lys Asn Met Phe Asn Ser Pro Gly Leu Ser Leu Ala

55 60 65

ctt gtaagccaaa tgaaaaagag cataaaaatt gaatcttttt tacttttata 2763

Leu

tgacaccctt tttttttttt gttgcag caa aca ggt atg gaa ggg caa agt gag 2817

Gln Thr Gly Met Glu Gly Gln Ser Glu

70 75

gta aca aga atg gct gaa aac tac gag gga aat aac agt gtt ggt aga 2865

Val Thr Arg Met Ala Glu Asn Tyr Glu Gly Asn Asn Ser Val Gly Arg

80 85 90

agg agt aga gaa gaa gaa cca gac agc aga tct gga agt gat aac ttg 2913

Arg Ser Arg Glu Glu Glu Pro Asp Ser Arg Ser Gly Ser Asp Asn Leu

95 100 105

gaa ggt gca tcg ggt gat gaa caa gat gct acc gac aaa cca cca agg 2961

Glu Gly Ala Ser Gly Asp Glu Gln Asp Ala Thr Asp Lys Pro Pro Arg

110 115 120 125

aag aaa aga tac cac cga cac act cct cag caa atc caa gaa ctt gaa 3009

Lys Lys Arg Tyr His Arg His Thr Pro Gln Gln Ile Gln Glu Leu Glu

130 135 140

tc gtaatcatta ccttcttttt caaatgaaaa aaaaatgatt tttttttctt 3061

Ser

tcaacttttc ttatgagatg tttctattat ggtttttttt ttcttag t ctt ttc aag 3118

Leu Phe Lys

145

gag tgt cct cat cct gat gag aaa caa agg ttg gag tta agc aaa agg 3166

Glu Cys Pro His Pro Asp Glu Lys Gln Arg Leu Glu Leu Ser Lys Arg

150 155 160

ctt tct ttg gag act aga caa gtc aag ttt tgg ttc caa aat cgt aga 3214

Leu Ser Leu Glu Thr Arg Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn Arg Arg

165 170 175

act cag atg a aggtaataaa aaaaagattc aatttctatg gctttaaaag 3264

Thr Gln Met

180

attctttttt tttgtgggtt tctgcttctg aataatgaat ctttgattgc acc ag 3319

Lys

act caa ctg gaa cgc cat gag aat tcg ata cta agg caa gag aat gat 3367

Thr Gln Leu Glu Arg His Glu Asn Ser Ile Leu Arg Gln Glu Asn Asp

185 190 195

aag ctt cgt gca gaa aac atg tct ata aga gag gca atg aga aat cca 3415

Lys Leu Arg Ala Glu Asn Met Ser Ile Arg Glu Ala Met Arg Asn Pro

200 205 210

att tgt act aat tgt ggt ggt cca gca atg att ggt gag atc tct ctt 3463

Ile Cys Thr Asn Cys Gly Gly Pro Ala Met Ile Gly Glu Ile Ser Leu

215 220 225

gag gag caa cat ctt agg att gaa aat gct agg ctg aaa gat gaa tta 3511

Glu Glu Gln His Leu Arg Ile Glu Asn Ala Arg Leu Lys Asp Glu Leu

230 235 240 245

gat cga gtt tgt gca ctt gct ggc aag ttt ttg ggg cga ccc att tca 3559

Asp Arg Val Cys Ala Leu Ala Gly Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Ser

250 255 260

tct tta gta acc tct atg cct ccc cca atg cct aat tca agt ttg gaa 3607

Ser Leu Val Thr Ser Met Pro Pro Pro Met Pro Asn Ser Ser Leu Glu

265 270 275

ctt gga gtt gga agt aat gga ttt ggt ggt atg agt aat gta cca aca 3655

Leu Gly Val Gly Ser Asn Gly Phe Gly Gly Met Ser Asn Val Pro Thr

280 285 290

aca ctc ccc tta gca cct cct gat ttc ggt gtt ggg att tca aat tct 3703

Thr Leu Pro Leu Ala Pro Pro Asp Phe Gly Val Gly Ile Ser Asn Ser

295 300 305

tta cca gtt gtg cct tca act aga cag tca act gga att gag aga tca 3751

Leu Pro Val Val Pro Ser Thr Arg Gln Ser Thr Gly Ile Glu Arg Ser

310 315 320 325

ctt gaa aga tcc atg tat ctt gaa ctt gct ttg gct gcc atg gag gaa 3799

Leu Glu Arg Ser Met Tyr Leu Glu Leu Ala Leu Ala Ala Met Glu Glu

330 335 340

ttg gta aaa atg gca caa act gat gaa cct ctt tgg ttc agg agc att 3847

Leu Val Lys Met Ala Gln Thr Asp Glu Pro Leu Trp Phe Arg Ser Ile

345 350 355

gaa ggt ggt aga gaa ata ctt aac cat gaa gag tac ata agg aca ttt 3895

Glu Gly Gly Arg Glu Ile Leu Asn His Glu Glu Tyr Ile Arg Thr Phe

360 365 370

act cct tgc att ggt atg aga cca aac agt ttt att tca gag gct tcc 3943

Thr Pro Cys Ile Gly Met Arg Pro Asn Ser Phe Ile Ser Glu Ala Ser

375 380 385

agg gag aca ggc atg gtt ata atc aat agt tta gct ctt gtt gag aca 3991

Arg Glu Thr Gly Met Val Ile Ile Asn Ser Leu Ala Leu Val Glu Thr

390 395 400 405

tta atg gac tct gtaagtaatt tcttgattgc acttttaggt gtctaatcct 4043

Leu Met Asp Ser

gtaaatatcc ttgtcaatta tcatacatga aagtcataaa tcttcatttg ttttttctga 4103

tgattagctt taattttgac ag aac aaa tgg gca gaa atg ttt cca tgt ttg 4155

Asn Lys Trp Ala Glu Met Phe Pro Cys Leu

410 415

att gct aga acc tca aca aca gat gtt ata tca agt ggt atg ggt gga 4203

Ile Ala Arg Thr Ser Thr Thr Asp Val Ile Ser Ser Gly Met Gly Gly

420 425 430 435

acc aga aat ggt gca ctt cag ct ggtaaattaa aatgaacctt tgtttgtagt 4256

Thr Arg Asn Gly Ala Leu Gln Leu

440

taaatcaaat gttattatta ttattattag tcaatgttga aatatgattt tttttttctt 4316

gattctttat a g atg cat gct gaa ctc caa gtg ctt tca cca tta gta 4364

Met His Ala Glu Leu Gln Val Leu Ser Pro Leu Val

445 450 455

cca att aga gag gtc aat ttc ctg cgt ttc tgc aaa caa cat gct gaa 4412

Pro Ile Arg Glu Val Asn Phe Leu Arg Phe Cys Lys Gln His Ala Glu

460 465 470

ggt gtc tgg gct gtc gtt gat gta tcg att gat acc atc cgt gaa act 4460

Gly Val Trp Ala Val Val Asp Val Ser Ile Asp Thr Ile Arg Glu Thr

475 480 485

tct ggt gca cca acg ttt cca aat agc aga agg ctt cct tct ggc tgt 4508

Ser Gly Ala Pro Thr Phe Pro Asn Ser Arg Arg Leu Pro Ser Gly Cys

490 495 500

gtt gtt caa gat atg ccc aat ggc tac agc aaa gtaagttctc tatgaataaa 4561

Val Val Gln Asp Met Pro Asn Gly Tyr Ser Lys

505 510

ttcaattgtc tatattcggt taactctatt cacaaagact tttctctctt ctactagtgt 4621

gtcgtttagt actatatatt caatgagttt acattcatgg ggtagctact attttgcttt 4681

ttgtgtttaa tgagtttggt tgagcaacta caaatttttg gatcttagtt cagaacattg 4741

atttggtttt ttttccccac ctaatttgga ttgtcaaaat gactaaaagc tttagtagtc 4801

ttttttggtt atttggtcca aaaccaaaaa gattagatta ttgaacctga taagatgctg 4861

attatagggg acataacagt attaaaaagt catcaaatat cagcaactta cttcctgctt 4921

aagatgagct taatactaat attatatgaa caccgtacgt gtggaaatcg aggttaagga 4981

cgagttaatt aatctaataa attgaataga agtctccatt acttatattt ttgtgccttg 5041

ggacacatta atttcatatg attcttcaga aaataattta aaaaaaatta aattaaaaat 5101

ttgctttgta actttcaagc attggtttaa ttaaacaatg tatttgatgt ttctattcca 5161

atctctgatg ctgtctcgat cagtcccccg tgtatataat taattcatct aactgtgtat 5221

tatctggttc cagccttgtg atgtgtttgt tttttatact atactaatga aggactcttt 5281

ttagtcaaac aacaagactg actacattat tttttgttgt cacgtgagta tctacagagt 5341

ctaaaagctt tgtggtacat ttctcaatgt ctcaaaccta acctcgtgcc ttcaaatttg 5401

cataaaaatg gtgaaaactt gtatttttat gacttctaat tttagggttc taggttctat 5461

catgtctctc cttgaaccta actttgctat agaaaccatt tccaagattt gtcctgttgc 5521

atcacaaaaa tttcccattt agtaatgtac ttattttttt attctttttc taatttttgg 5581

ggtttttaaa acatgtttgg attaaaataa atctatacta atagcactaa taagttaggt 5641

gacgttattc atggtctaaa tgtttgaatt catttgtcac aactaacttt gctcaggagt 5701

tgtaattatt tgcctatgtg ataaatactt gtcataaatt actctataat ttaaatgtag 5761

tcgataataa attcaatgca tatgatcatt aatttactat gtaacgaggg aaaattgtga 5821

caacaattga ttaactcccc ttgtgattat tattattatg ctctaattta ttccaagcaa 5881

gttcagaccg actaaataaa ttctgacggt taataattat gtag gtt aca tgg gta 5937

Val Thr Trp Val

515

gaa cat gcc gaa tat gaa gag ggt gca aat cac cat ctt tac cgg cag 5985

Glu His Ala Glu Tyr Glu Glu Gly Ala Asn His His Leu Tyr Arg Gln

520 525 530

tta att agc gcg ggt atg ggg ttt ggc gca caa aga tgg gtt gca acc 6033

Leu Ile Ser Ala Gly Met Gly Phe Gly Ala Gln Arg Trp Val Ala Thr

535 540 545 550

ctc caa cgc cag tgt gag tgt ctt gca att ctc atg tca tcc acc gtg 6081

Leu Gln Arg Gln Cys Glu Cys Leu Ala Ile Leu Met Ser Ser Thr Val

555 560 565

tct gcc agg gat cat aca g gtaactaatt aaaatctata tttttgtgaa 6130

Ser Ala Arg Asp His Thr

570

actgttcaat gaatcaacct ctatcatgtg atgagtagta gacccttata ttttgtgtga 6190

ccaaatttaa attttaagaa atcaaatcac atgcag ca ata act cca agt ggg 6243

Ala Ile Thr Pro Ser Gly

575

agg cgt agc atg ttg aag cta gca caa cgc atg aca aac aac ttt tgt 6291

Arg Arg Ser Met Leu Lys Leu Ala Gln Arg Met Thr Asn Asn Phe Cys

580 585 590

gct ggt gtt tgt gct tca acg gta cac aag tgg aac aaa ctt tgt gca 6339

Ala Gly Val Cys Ala Ser Thr Val His Lys Trp Asn Lys Leu Cys Ala

595 600 605 610

ggt aat gtt gat gaa gat gta cgt gtc atg act cga aag agc gtc gat 6387

Gly Asn Val Asp Glu Asp Val Arg Val Met Thr Arg Lys Ser Val Asp

615 620 625

gac cct ggt gaa cca gca ggg atc gtc tta agc gct gct act tcc gtt 6435

Asp Pro Gly Glu Pro Ala Gly Ile Val Leu Ser Ala Ala Thr Ser Val

630 635 640

tgg ttg ccc gtt tcc cct caa aga ctc ttt gat ttc ctc cgt gac gaa 6483

Trp Leu Pro Val Ser Pro Gln Arg Leu Phe Asp Phe Leu Arg Asp Glu

645 650 655

cgc ctc cgt agc gaa tgg gat atc cta tcc aac ggt ggc cct atg caa 6531

Arg Leu Arg Ser Glu Trp Asp Ile Leu Ser Asn Gly Gly Pro Met Gln

660 665 670

gaa atg gct cat att gcc aaa ggc caa gat cat ggc aac tgc gtc tct 6579

Glu Met Ala His Ile Ala Lys Gly Gln Asp His Gly Asn Cys Val Ser

675 680 685 690

ctc ctt cgt gct agt g taatttcctc aaccctttct tttttctttt ttttttttat 6635

Leu Leu Arg Ala Ser

695

gaaaaaatta attttgaatg gatagagata atgcatggcg atttatacat atgaatgcat 6695

gtaaaaagat tgattgatta tgcatgtgtg gggttcattt tcttgtaaga taaaaataaa 6755

attgttgatt gaaaaggaca aactaggggg atttggaagt atctcaaaag gaccatctta 6815

ttccagatct ataaattttt aactttgttg catcttttgt aaatttgtaa aaagtcaaaa 6875

cacatgatac atgttacctt tttattttag tcagccctac tatgatatca ccctttttac 6935

atgaaaaagt cttcaaacac tgcaacaaac aactgacgta ttatatatac cacacaatgg 6995

cattattcgt aaatatattc ataaccaagg ggctttgtat tgatctattg ccagg ct 7052

Ala

atg aac gcg aat cag agc agc atg ttg ata ctt cag gag act tgc ata 7100

Met Asn Ala Asn Gln Ser Ser Met Leu Ile Leu Gln Glu Thr Cys Ile

700 705 710

gac gcg gct ggg gcg ctt gtt gta tac gcg cca gtt gat att ccg gca 7148

Asp Ala Ala Gly Ala Leu Val Val Tyr Ala Pro Val Asp Ile Pro Ala

715 720 725

atg cac gtg gtg atg aac ggt gga gat tcg gct tac gtg gct ttg ctt 7196

Met His Val Val Met Asn Gly Gly Asp Ser Ala Tyr Val Ala Leu Leu

730 735 740

cct tcg gga ttc tca att gta ccc gac ggc cca gga tct cgt ggg tcc 7244

Pro Ser Gly Phe Ser Ile Val Pro Asp Gly Pro Gly Ser Arg Gly Ser

745 750 755 760

aat ggg cct tca tgt aat ggg ggc cca gat caa aga att agc ggg tca 7292

Asn Gly Pro Ser Cys Asn Gly Gly Pro Asp Gln Arg Ile Ser Gly Ser

765 770 775

ctc ttg acg gta gcc ttt cag ata ttg gtg aat agt ctt cct aca gcc 7340

Leu Leu Thr Val Ala Phe Gln Ile Leu Val Asn Ser Leu Pro Thr Ala

780 785 790

aag ctt act gtg gaa tca gtg gaa aca gtc aat aat ctt ata tca tgc 7388

Lys Leu Thr Val Glu Ser Val Glu Thr Val Asn Asn Leu Ile Ser Cys

795 800 805

act gtt cag aag att aaa gct gca ctt caa tgc gaa agc taa 7430

Thr Val Gln Lys Ile Lys Ala Ala Leu Gln Cys Glu Ser

810 815 820

tatttgagac aaggagaaca acttttttta atatattttt ttttaataat atatagttta 7490

actagtagaa agaaaaaaaa aaagtggtgc ggtaatggaa ggagtggagg cttgatcatt 7550

gaagaactcg agctgaattg gaggctgagt caagaacgaa ccgcgctgaa aagaccattg 7610

ctaggtggta agggccggct caactagctc gaggtgttat taatttggtg ttcaacacaa 7670

agcaaaggtg gtggttcggg tattgactca gggtactaat atcagttggt tcatgaatga 7730

atcagctttt gggtgaaaat tttcaatttg gacaagttgt gtgacagaat tatgtcaatt 7790

tcagaagcta tggtttgttt ttgatgaatt tatagttgtt tgttgaagag tcataatggc 7850

tcttttgttt tgtatgttat ggtgggggac aattgacaaa tcaactattg tacgttatct 7910

taattgacct actttaactt gaatctcatt gtcattgttt atttttcttt gccattatgg 7970

tctaggttca catttgatca caagtgaaaa tttgttttat tttaactttt acagtttatc 8030

aagtcgtaat atatatatct ttctgaatat tgtatgttcg atatctttga aagttatgta 8090

tgtcatcttc aataaggatt aaaccatcgc tcttcattct tgttttgcag attaattaat 8150

tgttactcag acaaaatatg cgactatcat gtgataatat aagcattgta atctaaagag 8210

aaatttcatt cacatgtata ttttaagaaa tctgcaaaaa ttcacgtact acatcaattt 8270

tttataaaat tctaatttat ttatcttaat gtaatcctaa tatcttacct gaaataaata 8330

aaataaatag gaaatattat gaggtattta ttgattttag gcttacgttg tttgatgtac 8390

atgtatttgc taagttcgtg aagatattag gtgaattata tggacaatac aaatataaca 8450

ttattctgta aaaaactgtt attcttcttt gataaaaaaa taaatttata ttaaaagttt 8510

attaaaacgt gtgataaata tattatatat tagtaaaatt tatattatac atataaatta 8570

ttttatataa tatgtattaa aacaatatga tgaatatttc atagaaaaat attattgcta 8630

taaataacga atattttttt aatctaaaat atctatttaa atttttcaaa agatatttac 8690

gtaatcgaat gttaaagtta atcaaataag attgattttt ttttaaagaa aaagttaggg 8750

caggattaga gatgaagtta aagagaaagg gaatgggttt gtgaattgtg atgagtgaag 8810

gtgaagacag ctgaggagtg atggagaaag ggggcggggg ctcctgcaaa gtgaggtgca 8870

tttaatgtaa tttcagaagc tgttgggaca aacacttccc atgcatttaa tgctctcttt 8930

cctatactta tttgtattaa agtctgatta aatttaaatc ttcatatatt aagagataaa 8990

atgcttttta a 9001

<210> 15

<211> 821

<212> PRT

<213> 番茄

<400> 15

Met Asn Phe Gly Gly Phe Leu Asp Asn Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ala

1 5 10 15

Arg Ile Val Ala Asp Ile Pro Phe Asn His Asn Asn Ser Ser Ser Asn

20 25 30

Asn Asp Asn Lys Asn Asn Met Pro Thr Gly Ala Ile Ser Gln Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Pro Gln Ser Leu Ala Lys Asn Met Phe Asn Ser Pro Gly Leu

50 55 60

Ser Leu Ala Leu Gln Thr Gly Met Glu Gly Gln Ser Glu Val Thr Arg

65 70 75 80

Met Ala Glu Asn Tyr Glu Gly Asn Asn Ser Val Gly Arg Arg Ser Arg

85 90 95

Glu Glu Glu Pro Asp Ser Arg Ser Gly Ser Asp Asn Leu Glu Gly Ala

100 105 110

Ser Gly Asp Glu Gln Asp Ala Thr Asp Lys Pro Pro Arg Lys Lys Arg

115 120 125

Tyr His Arg His Thr Pro Gln Gln Ile Gln Glu Leu Glu Ser Leu Phe

130 135 140

Lys Glu Cys Pro His Pro Asp Glu Lys Gln Arg Leu Glu Leu Ser Lys

145 150 155 160

Arg Leu Ser Leu Glu Thr Arg Gln Val Lys Phe Trp Phe Gln Asn Arg

165 170 175

Arg Thr Gln Met Lys Thr Gln Leu Glu Arg His Glu Asn Ser Ile Leu

180 185 190

Arg Gln Glu Asn Asp Lys Leu Arg Ala Glu Asn Met Ser Ile Arg Glu

195 200 205

Ala Met Arg Asn Pro Ile Cys Thr Asn Cys Gly Gly Pro Ala Met Ile

210 215 220

Gly Glu Ile Ser Leu Glu Glu Gln His Leu Arg Ile Glu Asn Ala Arg

225 230 235 240

Leu Lys Asp Glu Leu Asp Arg Val Cys Ala Leu Ala Gly Lys Phe Leu

245 250 255

Gly Arg Pro Ile Ser Ser Leu Val Thr Ser Met Pro Pro Pro Met Pro

260 265 270

Asn Ser Ser Leu Glu Leu Gly Val Gly Ser Asn Gly Phe Gly Gly Met

275 280 285

Ser Asn Val Pro Thr Thr Leu Pro Leu Ala Pro Pro Asp Phe Gly Val

290 295 300

Gly Ile Ser Asn Ser Leu Pro Val Val Pro Ser Thr Arg Gln Ser Thr

305 310 315 320

Gly Ile Glu Arg Ser Leu Glu Arg Ser Met Tyr Leu Glu Leu Ala Leu

325 330 335

Ala Ala Met Glu Glu Leu Val Lys Met Ala Gln Thr Asp Glu Pro Leu

340 345 350

Trp Phe Arg Ser Ile Glu Gly Gly Arg Glu Ile Leu Asn His Glu Glu

355 360 365

Tyr Ile Arg Thr Phe Thr Pro Cys Ile Gly Met Arg Pro Asn Ser Phe

370 375 380

Ile Ser Glu Ala Ser Arg Glu Thr Gly Met Val Ile Ile Asn Ser Leu

385 390 395 400

Ala Leu Val Glu Thr Leu Met Asp Ser Asn Lys Trp Ala Glu Met Phe

405 410 415

Pro Cys Leu Ile Ala Arg Thr Ser Thr Thr Asp Val Ile Ser Ser Gly

420 425 430

Met Gly Gly Thr Arg Asn Gly Ala Leu Gln Leu Met His Ala Glu Leu

435 440 445

Gln Val Leu Ser Pro Leu Val Pro Ile Arg Glu Val Asn Phe Leu Arg

450 455 460

Phe Cys Lys Gln His Ala Glu Gly Val Trp Ala Val Val Asp Val Ser

465 470 475 480

Ile Asp Thr Ile Arg Glu Thr Ser Gly Ala Pro Thr Phe Pro Asn Ser

485 490 495

Arg Arg Leu Pro Ser Gly Cys Val Val Gln Asp Met Pro Asn Gly Tyr

500 505 510

Ser Lys Val Thr Trp Val Glu His Ala Glu Tyr Glu Glu Gly Ala Asn

515 520 525

His His Leu Tyr Arg Gln Leu Ile Ser Ala Gly Met Gly Phe Gly Ala

530 535 540

Gln Arg Trp Val Ala Thr Leu Gln Arg Gln Cys Glu Cys Leu Ala Ile

545 550 555 560

Leu Met Ser Ser Thr Val Ser Ala Arg Asp His Thr Ala Ile Thr Pro

565 570 575

Ser Gly Arg Arg Ser Met Leu Lys Leu Ala Gln Arg Met Thr Asn Asn

580 585 590

Phe Cys Ala Gly Val Cys Ala Ser Thr Val His Lys Trp Asn Lys Leu

595 600 605

Cys Ala Gly Asn Val Asp Glu Asp Val Arg Val Met Thr Arg Lys Ser

610 615 620

Val Asp Asp Pro Gly Glu Pro Ala Gly Ile Val Leu Ser Ala Ala Thr

625 630 635 640

Ser Val Trp Leu Pro Val Ser Pro Gln Arg Leu Phe Asp Phe Leu Arg

645 650 655

Asp Glu Arg Leu Arg Ser Glu Trp Asp Ile Leu Ser Asn Gly Gly Pro

660 665 670

Met Gln Glu Met Ala His Ile Ala Lys Gly Gln Asp His Gly Asn Cys

675 680 685

Val Ser Leu Leu Arg Ala Ser Ala Met Asn Ala Asn Gln Ser Ser Met

690 695 700

Leu Ile Leu His Glu Thr Cys Ile Asp Ala Ala Gly Ala Leu Val Val

705 710 715 720

Tyr Ala Pro Val Asp Ile Pro Ala Met His Val Val Met Asn Gly Gly

725 730 735

Asn Ser Ala Tyr Val Ala Leu Leu Pro Ser Gly Phe Ser Ile Val Pro

740 745 750

Asp Gly Pro Gly Ser Arg Gly Ser Asn Gly Pro Ser Cys Asn Gly Gly

755 760 765

Pro Asp Gln Arg Ile Ser Gly Ser Leu Leu Thr Val Ala Phe Gln Ile

770 775 780

Leu Val Asn Ser Leu Pro Thr Ala Lys Leu Thr Val Glu Ser Val Glu

785 790 795 800

Thr Val Asn Asn Leu Ile Ser Cys Thr Val Gln Lys Ile Lys Ala Ala

805 810 815

Leu Gln Cys Glu Ser

820

<210> 16

<211> 2466

<212> DNA

<213> 番茄

<400> 16

atgaattttg ggggttttct tgataataat tctggtggtg gcggtgcaag aattgttgct 60

gatataccat ttaatcacaa caacagcagc agcaacaacg acaataaaaa caatatgccc 120

actggtgcaa tttctcagcc aagacttctt cctcaatctc ttgccaagaa catgttcaac 180

tccccaggac tttctcttgc tcttcaaaca ggtatggaag ggcaaagtga ggtaacaaga 240

atggctgaaa actacgaggg aaataacagt gttggtagaa ggagtagaga agaagaacca 300

gacagcagat ctggaagtga taacttggaa ggtgcatcgg gtgatgaaca agatgctacc 360

gacaaaccac caaggaagaa aagataccac cgacacactc ctcagcaaat ccaagaactt 420

gaatctcttt tcaaggagtg tcctcatcct gatgagaaac aaaggttgga gttaagcaaa 480

aggctttctt tggagactag acaagtcaag ttttggttcc aaaatcgtag aactcagatg 540

aagactcaac tggaacgcca tgagaattcg atactaaggc aagagaatga taagcttcgt 600

gcagaaaaca tgtctataag agaggcaatg agaaatccaa tttgtactaa ttgtggtggt 660

ccagcaatga ttggtgagat ctctcttgag gagcaacatc ttaggattga aaatgctagg 720

ctgaaagatg aattagatcg agtttgtgca cttgctggca agtttttggg gcgacccatt 780

tcatctttag taacctctat gcctccccca atgcctaatt caagtttgga acttggagtt 840

ggaagtaatg gatttggtgg tatgagtaat gtaccaacaa cactcccctt agcacctcct 900

gatttcggtg ttgggatttc aaattcttta ccagttgtgc cttcaactag acagtcaact 960

ggaattgaga gatcacttga aagatccatg tatcttgaac ttgctttggc tgccatggag 1020

gaattggtaa aaatggcaca aactgatgaa cctctttggt tcaggagcat tgaaggtggt 1080

agagaaatac ttaaccatga agagtacata aggacattta ctccttgcat tggtatgaga 1140

ccaaacagtt ttatttcaga ggcttccagg gagacaggca tggttataat caatagttta 1200

gctcttgttg agacattaat ggactctaac aaatgggcag aaatgtttcc atgtttgatt 1260

gctagaacct caacaacaga tgttatatca agtggtatgg gtggaaccag aaatggtgca 1320

cttcagctga tgcatgctga actccaagtg ctttcaccat tagtaccaat tagagaggtc 1380

aatttcctgc gtttctgcaa acaacatgct gaaggtgtct gggctgtcgt tgatgtatcg 1440

attgatacca tccgtgaaac ttctggtgca ccaacgtttc caaatagcag aaggcttcct 1500

tctggctgtg ttgttcaaga tatgcccaat ggctacagca aagttacatg ggtagaacat 1560

gccgaatatg aagagggtgc aaatcaccat ctttaccggc agttaattag cgcgggtatg 1620

gggtttggcg cacaaagatg ggttgcaacc ctccaacgcc agtgtgagtg tcttgcaatt 1680

ctcatgtcat ccaccgtgtc tgccagggat catacagcaa taactccaag tgggaggcgt 1740

agcatgttga agctagcaca acgcatgaca aacaactttt gtgctggtgt ttgtgcttca 1800

acggtacaca agtggaacaa actttgtgca ggtaatgttg atgaagatgt acgtgtcatg 1860

actcgaaaga gcgtcgatga ccctggtgaa ccagcaggga tcgtcttaag cgctgctact 1920

tccgtttggt tgcccgtttc ccctcaaaga ctctttgatt tcctccgtga cgaacgcctc 1980

cgtagcgaat gggatatcct atccaacggt ggccctatgc aagaaatggc tcatattgcc 2040

aaaggccaag atcatggcaa ctgcgtctct ctccttcgtg ctagtgctat gaacgcgaat 2100

cagagcagca tgttgatact tcatgagact tgcatagacg cggctggggc gcttgttgta 2160

tacgcgccag ttgatattcc ggcaatgcac gtggtgatga acggtggaaa ttcggcttac 2220

gtggctttgc ttccttcggg attctcaatt gtacccgacg gcccaggatc tcgtgggtcc 2280

aatgggcctt catgtaatgg gggcccagat caaagaatta gcgggtcact cttgacggta 2340

gcctttcaga tattggtgaa tagtcttcct acagccaagc ttactgtgga atcagtggaa 2400

acagtcaata atcttatatc atgcactgtt cagaagatta aagctgcact tcaatgcgaa 2460

agctaa 2466